Investigação do metabolismo xenobióticos em folhas de Salix alba via Imagem de Espectrometria de Massa

Resumo

Este método usa imagens de espectrometria de massa (MSI) para entender processos metabólicos nas folhas de S. alba quando expostos a xenobióticos. O método permite a localização espacial de compostos de interesse e seus metabólitos previstos dentro de tecidos específicos e intactos.

Resumo

O método apresentado utiliza imagens de espectrometria de massa (IM) para estabelecer o perfil metabólico das folhas de S. alba quando expostas a xenobióticos. Usando uma abordagem não direcionada, metabólitos vegetais e xenobióticos de interesse são identificados e localizados em tecidos vegetais para descobrir padrões específicos de distribuição. Em seguida, na previsão silico de metabólitos potenciais (ou seja, catabólitos e conjugados) dos xenobióticos identificados é realizada. Quando um metabólito xenobiótico está localizado no tecido, o tipo de enzima envolvida em sua alteração pela planta é registrado. Esses resultados foram utilizados para descrever diferentes tipos de reações biológicas ocorridas nas folhas de S. alba em resposta ao acúmulo xenobiótico nas folhas. Os metabólitos foram previstos em duas gerações, permitindo a documentação de sucessivas reações biológicas para transformar xenobióticos nos tecidos da folha.

Introdução

Xenobióticos são amplamente distribuídos ao redor do mundo devido às atividades humanas. Alguns desses compostos são solúveis em água e absorvidos pelo solo¹, e entram na cadeia alimentar quando se acumulam em tecidos vegetais^2,3,4. As plantas são comidas por insetos e herbívoros, que são presas de outros organismos. A ingestão de alguns xenobióticos e seu impacto na saúde de uma planta foram descritos^5,6,7,8, mas apenas recentemente em um nível de tecido⁹. Portanto, ainda não está claro onde ou como o metabolismo dos xenobióticos ocorre, ou se metabólitos vegetais específicos estão correlacionados ao acúmulo xenobiótico em tecidos específicos¹⁰. Além disso, a maioria das pesquisas tem negligenciado o metabolismo dos xenobióticos e seus metabólitos nas plantas, tão pouco se sabe sobre essas reações nos tecidos vegetais.

Proposto aqui é um método para investigar reações enzimáticas em amostras biológicas que podem estar associadas à localização tecidual de substratos e produtos das reações. O método pode desenhar o perfil metabólico completo de uma amostra biológica em um experimento, uma vez que a análise não é direcionada e pode ser investigada usando listas personalizadas de analitos de interesse. Desde que seja uma lista de candidatos rastreados no conjunto de dados original. Se um ou vários analitos de interesse forem observados na amostra, a localização específica do tecido pode fornecer informações importantes sobre os processos biológicos relacionados. Os analitos de interesse podem então ser modificados em sílico usando leis biológicas relevantes para a busca de possíveis produtos/metabólitos. A lista de metabólitos obtidos é então utilizada para analisar os dados originais, identificando as enzimas envolvidas e localizando as reações nos tecidos, ajudando assim a compreender os processos metabólicos que ocorrem. Nenhum outro método fornece informações sobre os tipos de reações ocorridas nas amostras biológicas, a localização dos compostos de interesse e seus metabólitos relacionados. Este método pode ser usado em qualquer tipo de material biológico uma vez que tecidos frescos e intactos estão disponíveis e os compostos de interesse podem ser ionizados. O protocolo proposto foi publicado em Villette et al.¹² e é detalhado aqui para uso da comunidade científica.

Protocolo

1. Preparação da amostra

1. Obtenha a amostra biológica e mantenha-a fresca e intacta (por exemplo, não a force a um tubo) ou congele-a. O protocolo proposto aplica-se a qualquer tipo de amostra biológica sólida (ou seja, tecidos vegetais, animais ou humanos) para localização de compostos em tecidos específicos.
2. Esfrie um criomicrotome a -20 °C. Mantenha o suporte da amostra e a lâmina na mesma temperatura.
3. Se necessário, incorpore o objeto no meio de incorporação M1 para preservá-lo durante o corte.
   1. Despeje alguma matriz em um molde de plástico colocado na câmara de criomicrotome. Adicione rapidamente a amostra e despeje um pouco mais de incorporação de meio para cobri-la. Mantenha a amostra no centro do molde à medida que a matriz se solidifica enquanto esfria.
      NOTA: A incorporação não é necessária para todos os objetos biológicos. Objetos homogêneos, como cérebros de camundongos, não precisam incorporar meios e podem ser cortados congelados.
4. Coloque a amostra embutida ou congelada no suporte de criomicrotome e corte-a com uma lâmina afiada. Uma espessura de 5-30 μm é boa para amostras de plantas, que são difíceis de cortar devido à sua heterogeneidade. Adapte a espessura e temperatura de corte à amostra, fazendo vários cortes para encontrar as melhores condições. No exemplo fornecido, a amostra foi cortada a -20 °C. Considere manter a amostra abaixo de 0 °C para evitar a degradação da amostra.
   NOTA: O uso de um microscópio binóculo colocado ao lado do criomicrotome pode ajudar a determinar a qualidade das fatias. Os tecidos devem ficar intactos.
5. Mova cuidadosamente a fatia para um slide revestido de ITO usando fórceps ou um pequeno pincel, em seguida, coloque um dedo sob o slide para aquecer e secar a amostra. Mantenha o slide na câmara criomicrotome até que todas as amostras estejam prontas. Retire o deslizamento da câmara lentamente para evitar choque térmico.
   NOTA: Para verificar qual lado do slide é revestido de ITO, coloque uma gota de água no escorregador à temperatura ambiente (RT). A queda permanecerá em volta do lado revestido da ITO ou achatará no lado não revestido.
6. Desenhe marcas no slide usando uma caneta ou fluido de correção de marcador fino e escaneie-o com um scanner de alta resolução antes da deposição da matriz. As marcas serão usadas para determinar a posição exata da amostra no slide quando ela estiver no espectrômetro de massa. A melhor maneira de obter pontos precisos de referência é desenhar um cruzamento.

2. Depoimento matricial

1. Prepare a matriz MALDI: pese 70 mg de matriz de ácido hidroxicinâmico (HCCA) α de 70 mg de água e metanol (50:50) com 0,2% de TFA. Sonicate a matriz por 10 minutos na RT. Pode haver matriz extra sólida após a sônicação.
   NOTA: Diferentes tipos de matrizes MALDI podem ser usados dependendo dos analitos de interesse.
2. Limpe o robô de deposição de matriz com 100% de metanol.
3. Usando metanol e uma limpeza de precisão, limpe o slide, segurando as amostras sem tocá-las e sem remover as marcas. Adicione uma mancha de cobertura limpa sobre o slide em uma área sem amostra. Essa parte do slide é então colocada sobre o detector óptico para rastrear a deposição da matriz.
   NOTA: Para rastrear opticamente a espessura da matriz, o deslizamento e a tampa devem estar muito limpos.
4. Use o robô para deposição matricial: coloque apenas 6 mL da solução matricial no reservatório, e adicione 2 mL de 100% de metanol para um volume total de 8 mL.
   NOTA: A gravação da espessura da matriz ao longo da deposição é automática e pode ser recuperada usando um pendrive. O desenvolvimento de um método de pulverização não é detalhado aqui.

3. Aquisição de dados

1. Coloque 1 μL da matriz em uma placa MALDI para calibrar o espectrômetro de massa usando os picos da matriz como referências. O desenvolvimento de um método de aquisição no espectrômetro de massa não é detalhado aqui.
   1. Insira a placa MALDI na fonte, clique em "Load Target" no software ftmsControl e aguarde que a placa seja carregada.
   2. Escolha a posição do ponto de matriz clicando no local na imagem representando a placa MALDI.
   3. Indique o nome da amostra e a pasta na guia " Informações deamostra" do software.
   4. Comece a aquisição clicando em "Aquisição".
   5. Mova a placa ligeiramente durante a aquisição usando o ponteiro do mouse na guia "VÍDEO MALDI" para que o laser aponte em diferentes pontos.
   6. Quando a aquisição estiver concluída, vá para a guia "Calibração", escolha a lista de calibração HCCA no modo quadrático e clique em Automático. O resultado de calibração global é indicado na janela "Gráfico de Calibração" e deve ser inferior a 0,2 ppm para um SolariX XR 7T.
   7. Se a calibração for boa, clique em "Aceitar" e salve o método.
2. Uma vez terminado o depoimento da matriz nas amostras, coloque o slide em um adaptador de slides e recupere a posição das marcas usando uma tampa plástica.
3. No software flexImaging, configure uma nova execução de imagem usando a primeira janela que se abre com o software.
   1. Nomeie a execução de imagens, selecione o Diretório de Resultadose clique em Next.
   2. Indique o tamanho do raster (ou seja, região de medição definida pelo usuário), escolha o método a ser utilizado (calibrado na seção 3.1) e clique em Next.
   3. Carregue a imagem óptica do slide obtida na etapa 1.6 após digitalizar o slide e clique em Next.
   4. A imagem se abre em uma janela mais ampla. Use as marcas no slide para ensinar a posição dos slides: no ftmsControl,coloque o alvo da janela de vídeo MALDI na posição exata de uma marca, depois volte para felxImaging e clique no mesmo ponto da imagem óptica. Repita isso por três pontos independentes. A tampa plástica com as marcas é colocada em uma placa MALDI para recuperar sua posição e facilitar o ensino.
      NOTA: Se as marcas foram feitas com um marcador, adicionar fluido de correção branca na parte de trás do slide pode fazê-los se destacar durante o ensino.
4. Desenhe as regiões de interesse nas amostras do software flexImaging usando as ferramentas "Adicionar regiões de medição".
5. Salve a execução de imagem e uma "Sequência autoxecute" se várias amostras forem analisadas.
6. Inicie uma sequência usando "AutoXecute Batch Runner" se várias amostras forem analisadas.
   NOTA: Sincronizar os dados regularmente em um local seguro.

4. Processamento de dados

1. Importe os dados brutos para o software de visualização (SCiLS Lab) e crie um conjunto de dados. Isso é feito em duas etapas separadas neste software.
   1. Use a ferramenta "Importador de lotes" e selecione os dados brutos, indique o diretório de destino e clique em "Importação".
   2. Após a importação, vários conjuntos de dados podem ser combinados para análise suplementar. Para combinar conjuntos de dados, use o arquivo"| Novo| Dataset" ferramenta.
   3. Selecione o tipo de instrumento usado para aquisição, adicione os conjuntos de dados importados clicando em "+", e organize as imagens clicando e arrastando os objetos.
   4. Verifique as configurações do intervalo de massa ou modifique se necessário, indicando o intervalo de juros. Clique em A seguir para ver o resumo da importação e iniciar a importação.
2. Visualize o m/z de interesse nos diferentes tecidos de uma amostra e/ou em diferentes amostras. Basta clicar no espectro para selecionar o m/z de interesse ou digitar o valor na caixa m/z .
   1. Realize testes estatísticos se necessário para procurar valores colocalizados ou discriminatórios entre diferentes tecidos e/ou amostras diferentes para determinar o m/z de interesse. As ferramentas estão disponíveis no menu "Ferramenta" e não serão descritas neste protocolo.
3. Exporte o m/z de juros (por exemplo, compostos discriminatórios e discriminatórios) como um arquivo .csv da guia Objeto. Todo o conjunto de dados também pode ser exportado se não for muito grande (ou seja, no máximo 60.000 linhas). Clique no ícone "Exportar" no lado direito da região de interesse indicado por uma seta vermelha.
4. Importe o arquivo .csv para criar um novo conjunto de dados no software de anotação (Metaboscape). Clique em "Projetos | Importação projeto CSV". Esteja ciente de que apenas o m/z exato será considerado, e o perfil isotópico é perdido.
   NOTA: A versão de software 5.0 permite a importação direta de dados do software de visualização, o que permite uma anotação mais precisa, pois o perfil isotópico pode ser considerado.
5. Anote com listas de analitos personalizadas, que podem ser derivadas de bancos de dados disponíveis publicamente. Um modelo é dado pelo software para criar listas de analitos.
6. Use o software de previsão (Metabolite Predict) para executar na previsão de silico dos metabólitos dos compostos anotados. A fórmula desenvolvida do composto de interesse é necessária, seja desenhada pelo usuário no software ou importada como um arquivo .mol. Em seguida, o método é um protocolo passo-a-passo simples.
7. Recupere a lista de metabólitos, crie uma lista de analitos e use-a no software de anotação para anotar os dados brutos com metabólitos previstos. Alternativamente, se a lista de metabólitos for curta, procure-a manualmente na etapa 4.8.
8. Visualize a distribuição tecidual dos metabólitos nos dados brutos do software de visualização.
9. Recupere os nomes das enzimas envolvidas nos processos metabólicos no software de previsão clicando com o botão direito do mouse no metabólito de interesse previsto.

Resultados

Este protocolo foi aplicado a folhas frescas amostradas de uma árvore S. alba exposta a xenobióticos no ambiente. O processo é retratado na Figura 1. O primeiro passo é preparar fatias finas da amostra de juros. Amostras de plantas são muitas vezes mais difíceis de cortar do que amostras de animais, pois os tecidos são heterogêneos e podem conter água e/ou ar. Esta dificuldade é tratada usando meio de incorporação, que forma um bloco homogêneo ao redor da amostra. A dep...

Discussão

A parte crítica deste protocolo é a preparação da amostra: a amostra deve ser macia e intacta. O corte é a parte mais difícil, pois a temperatura e a espessura da amostra podem variar dependendo do tipo de amostra estudada. Os tecidos animais são geralmente homogêneos e mais fáceis de cortar. As amostras de plantas geralmente incorporam estruturas diferentes e, portanto, são mais difíceis de manter intactas à medida que a lâmina encontra tecidos vasculares macios, duros ou vazios. É altamente recomendável ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cover slips	Bruker Daltonics	267942
Cryomicrotome	Thermo Scientific
Excel	Microsoft corporation
flexImaging	Bruker Daltonics
ftmsControl	Bruker Daltonics
GTX primescan	GX Microscopes
HCCA MALDI matrix	Bruker Daltonics	8201344
ImagePrep	Bruker Daltonics
ITO-coated slides	Bruker Daltonics	237001
M1-embedding matrix	ThermoScientific	1310
Metabolite Predict	Bruker Daltonics
Metaboscape	Bruker Daltonics
Methanol	Fisher Chemicals		No specific reference needed
MX 35 Ultra blades	Thermo Scientific	15835682
Plastic molds			No specific reference needed
SCiLS Lab	Bruker Daltonics
SolariX XR 7Tesla	Bruker Daltonics		The method proposed is not limited to this instrument
Spray sheets for ImagePrep	Bruker Daltonics	8261614
TFA	Sigma Aldrich		No specific reference needed