살릭스 알바에서 제노바이오틱스 대사에 대한 조사는 질량 분광화상 영상을 통해 나뭇잎

요약

이 방법은 xenobiotics에 드러날 때 S. 알바 잎에 있는 신진 대사 과정을 이해하기 위하여 질량 분광법 화상 진찰 (MSI)를 이용합니다. 이 방법을 사용하면 관심 있는 화합물과 예측된 대사산물의 공간 적 국소화를 특정, 그대로 조직 내에서 할 수 있습니다.

초록

제시된 방법은 xenobiotics에 드러날 때 S. 알바 잎의 신진 대사 단면도를 확립하기 위하여 질량 분광법 화상 진찰 (MSI)를 이용합니다. 비표적 접근법을 사용하여 식물 대사 산물과 관심있는 제노바이오틱을 식별하고 식물 조직에서 국소화하여 특정 분포 패턴을 발견합니다. 이어서, 확인된 제노바이오틱으로부터 잠재적 대사산물(즉, 이화산물 및 회인)의 실리코 예측이 수행된다. xenobiotic 대사 산물이 조직에 위치할 때, 식물에 의한 변경에 관여하는 효소의 종류가 기록됩니다. 이러한 결과는 잎에 있는 xenobiotic 축적에 응하여 S. Alba 잎에서 생기는 생물학 반응의 다른 모형을 기술하기 위하여 이용되었습니다. 대사 산물은 2 대에 예측되었다, 잎 조직에 있는 xenobiotics를 변환하는 연속한 생물학 반응의 문서화를 허용했습니다.

서문

제노바이오틱스는 인간의 활동으로 인해 전 세계에 널리 분포되어 있습니다. 이들 화합물 중 일부는 수용성이며 토양^1에흡수되며 식물 조직^2,3,4에축적되면 먹이 사슬에 들어간다. 식물은 곤충과 초식 동물에 의해 먹습니다. 일부 제노바이오틱스의 섭취와 식물의 건강에 미치는 영향은^5,6,7,8로설명되었지만 최근에는 조직 수준^9에서만설명되었다. 따라서, 제노바이오틱의 대사가 어디에서 어떻게 발생하는지, 또는 특정 식물 대사산물이 특정 조직에서 제노바이오틱 축적과 상관관계가 있는지 는 아직^{불분명하다(10).} 더욱이, 대부분의 연구는 식물에 있는 xenobiotics 그리고 그들의 대사산물의 물질 대사를 간과했습니다, 그래서 식물 조직에 있는 이 반응에 관하여 거의 알려지지 않습니다.

여기서 제안된 것은 기판의 조직 국소화와 반응의 산물과 연관될 수 있는 생물학적 샘플에서 효소 반응을 조사하는 방법이다. 이 방법은 분석이 비표적화되고 관심 있는 분석물의 사용자 지정 목록을 사용하여 조사할 수 있기 때문에 한 실험에서 생물학적 샘플의 완전한 대사 프로파일을 그릴 수 있다. 제공된 원래 데이터 집합에서 추적된 후보자 목록입니다. 샘플에 관심 있는 하나 또는 여러 개의 별표가 지적되는 경우, 특정 조직 국소화는 관련 생물학적 과정에 중요한 정보를 제공할 수 있다. 관심의 질량은 가능한 제품/대사 산물을 검색하기 위하여 관련 생물학 법률을 사용하여 실리코에서 수정될 수 있습니다. 얻어진 대사산물의 목록은 관련효소를 식별하고 조직에 있는 반응을 현지화해서 본래 데이터를 분석하기 위하여 그 때 이용되고, 따라서 일어나는 신진 대사 과정을 이해하는 것을 돕습니다. 다른 방법은 생물학적 샘플에서 발생하는 반응의 유형, 관심 있는 화합물의 국소화 및 관련 대사 산물에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 이 방법은 신선하고 손상되지 않은 조직이 이용 가능하고 관심있는 화합물이 이온화될 수 있게 되면 모든 유형의 생물학적 물질에 사용될 수 있다. 제안 된 프로토콜은 Villette 외^12에 발표되었으며 과학 계에서 사용하기 위해 여기에 자세히 설명되어 있습니다.

프로토콜

1. 샘플 준비

1. 생물학적 샘플을 얻고 신선하고 온전하게 유지 (예를 들어, 튜브로 강요하지 마십시오) 또는 동결. 제안된 프로토콜은 특정 조직에서 화합물을 국소화하기 위해 모든 유형의 고체 생물학적 샘플(즉, 식물, 동물 또는 인간 조직)에 적용됩니다.
2. 저온마이크로토메를 -20°C로 식힙니다. 샘플 홀더와 블레이드를 동일한 온도로 유지합니다.
3. 필요한 경우 절단 중에 물체를 보존하기 위해 M1 포함 매체에 개체를 포함시면 보존합니다.
   1. 저온 마이크로 토메 챔버에 배치 플라스틱 금형에 일부 매트릭스를 부어. 신속하게 샘플을 추가하고 그것을 커버하기 위해 좀 더 포함 매체를 부어. 냉각하는 동안 매트릭스가 고화될 때 금형 중앙에 샘플을 유지합니다.
      참고: 모든 생물학적 개체에 포함이 필요하지 는 않습니다. 마우스 뇌와 같은 동질적인 물체는 중간을 포함 할 필요가 없으며 냉동 절단 할 수 있습니다.
4. 임베디드 또는 냉동 샘플을 극저온마이크로톤 홀더에 놓고 날카로운 블레이드로 자른다. 5-30 μm의 두께는 식물 샘플에 적합하며, 이질성으로 인해 절단하기가 어렵습니다. 절삭 두께와 온도를 시료에 적용하여 최상의 조건을 찾기 위해 여러 컷을 만듭니다. 제공된 예에서, 샘플은 -20°C에서 절단되었다. 샘플 분해를 피하기 위해 샘플을 0°C 이하로 유지하는 것이 좋습니다.
   참고: 저온 마이크로토메 옆에 배치된 쌍안경 현미경을 사용하면 슬라이스의 품질을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 조직은 그대로 유지되어야 합니다.
5. 조심스럽게 집게 또는 작은 페인트 브러시를 사용하여 ITO 코팅 슬라이드로 슬라이스를 이동한 다음 슬라이드 아래에 손가락을 배치하여 샘플을 따뜻하게하고 건조시. 모든 샘플이 준비될 때까지 미온 마이크로토메 챔버에 슬라이드를 보관하십시오. 열 충격을 피하기 위해 천천히 챔버에서 슬라이드를 꺼내.
   참고: 슬라이드의 어느 쪽이 ITO 코팅되어 있는지 확인하려면 실온(RT)에서 슬라이드에 물 한 방울을 놓습니다. 드롭은 ITO 코팅 된 측면에 라운드 또는 코팅되지 않은 측면에 평평하게 유지됩니다.
6. 얇은 마커 펜 또는 보정 유체를 사용하여 슬라이드에 마크를 그리고 매트릭스 증착 전에 고해상도 스캐너로 스캔합니다. 마크는 질량 분광계에 있을 때 슬라이드에서 샘플의 정확한 위치를 결정하는 데 사용됩니다. 정확한 기준점을 얻는 가장 좋은 방법은 십자가를 그리는 것입니다.

2. 매트릭스 증착

1. MALDI 매트릭스 준비: α-시아노-4-하이드록시신나산(HCCA) 매트릭스의 70 mg을 계량하고 0.2% TFA로 물과 메탄올 용액(50:50)의 10mL로 희석합니다. RT에서 10분 동안 매트릭스를 초음파 처리합니다. 초음파 처리 후 추가 고체 매트릭스가있을 수 있습니다.
   참고: 관심 있는 문체에 따라 다양한 유형의 MALDI 행렬을 사용할 수 있습니다.
2. 매트릭스 증착 로봇을 100% 메탄올로 청소합니다.
3. 메탄올과 정밀 물티슈를 사용하여 슬라이드를 청소하고 샘플을 만지지 않고 마크를 제거하지 않고 보관하십시오. 샘플없이 지역의 슬라이드 위에 깨끗한 커버 슬립을 추가합니다. 그런 다음 슬라이드의 해당 부분을 광학 검출기 위에 배치하여 매트릭스 증착을 추적합니다.
   참고: 매트릭스 두께를 광학적으로 추적하려면 슬라이드와 커버슬립이 매우 깨끗해야 합니다.
4. 매트릭스 증착을 위해 로봇을 사용하십시오: 저수지에 매트릭스 용액의 6mL만 배치하고, 총 8mL의 총 부피에 대해 100% 메탄올의 2mL를 추가합니다.
   참고: 증착을 따라 매트릭스 두께를 기록하는 것은 자동이며 USB 스틱을 사용하여 복구할 수 있습니다. 살포 방법의 개발은 여기에 자세히 설명되어 있지 않습니다.

3. 데이터 수집

1. 매트릭스 피크를 참조로 사용하여 질량 분광계를 보정하기 위해 MALDI 플레이트에 매트릭스의 1 μL을 배치합니다. 질량 분광계에 대한 획득 방법의 개발은 여기에 자세히 설명되어 있지 않습니다.
   1. 소스에 MALDI 플레이트를 삽입하고 ftmsControl 소프트웨어에서"로드 대상"을클릭하고 플레이트가 로드될 때까지 기다립니다.
   2. MALDI 플레이트를 나타내는 이미지의 그 자리를 클릭하여 매트릭스 스팟의 위치를 선택합니다.
   3. 샘플 이름과 소프트웨어의"샘플 정보"탭의 폴더를 나타냅니다.
   4. "인수"를 클릭하여인수를시작합니다.
   5. "MALDI 비디오"탭의 마우스 포인터를 사용하여 획득 하는 동안 플레이트를 약간 이동하여 레이저가 다른 지점에서 점등되도록 합니다.
   6. 인수가 완료되면"교정"탭으로 이동하여 이차 모드에서 HCCA 교정 목록을 선택하고 자동을 클릭합니다. 전역 교정 결과는"교정 플롯"창에 표시되며 SolariX XR 7T의 경우 0.2ppm 미만이어야 합니다.
   7. 교정이 양호한 경우"수락"을클릭하고 메서드를 저장합니다.
2. 샘플의 매트릭스 증착이 완료되면 슬라이드를 슬라이드 어댑터에 놓고 플라스틱 커버를 사용하여 마크의 위치를 검색합니다.
3. flexImaging 소프트웨어에서 소프트웨어로 열리는 첫 번째 창을 사용하여 새 이미징 실행을 설정합니다.
   1. 이미징 실행이름을 지정하고 결과 디렉터리를선택하고 다음을 클릭합니다.
   2. 래스터 크기(즉, 사용자 정의 측정 영역)를 나타내고, 사용할 방법을 선택하고(섹션 3.1에서 보정됨)를 클릭하고 다음을 클릭합니다.
   3. 슬라이드를 스캔한 후 1.6단계에서 얻은 슬라이드의 광학 이미지를 로드하고 다음을 클릭합니다.
   4. 이미지가 더 넓은 창에서 열립니다. 슬라이드의 표시를 사용하여 슬라이드의 위치를 가르칩니다: ftmsControl에서MALDI 비디오 창의 대상을 마크의 정확한 위치에 배치한 다음 felxImaging로 돌아와 광학 이미지의 정확한 동일한 지점을 클릭합니다. 세 개의 독립적인 점에 대해 이 것을 반복합니다. 자국이 새겨진 플라스틱 커버는 MALDI 플레이트에 배치되어 위치를 회복하고 교육을 용이하게 합니다.
      참고: 표식으로 표시가 만들어진 경우 슬라이드 뒷면에 흰색 보정 유체를 추가하면 가르치는 동안 눈에 띄는 수 있습니다.
4. "측정영역 추가"도구를 사용하여 flexImaging 소프트웨어의 샘플에 대한 관심 영역을 그립니다.
5. 여러 샘플을 분석해야 하는 경우 이미징 실행 및"AutoXecute 시퀀스"를저장합니다.
6. 여러 샘플을 분석하는 경우"자동 제큐트 배치 러너"를사용하여 시퀀스를 시작합니다.
   참고: 데이터를 정기적으로 안전한 위치에 동기화합니다.

4. 데이터 처리

1. 원시 데이터를 시각화 소프트웨어(SCiLS Lab)로 가져오고 데이터 집합을 만듭니다. 이 작업은 이 소프트웨어의 두 단계에서 수행됩니다.
   1. "일괄가져오기"도구를 사용하고 원시 데이터를 선택하고 대상 디렉터리를 표시하고"가져오기"를 클릭합니다.
   2. 가져온 후 추가 분석을 위해 여러 데이터 집합을 결합할 수 있습니다. 데이터 집합을 결합하려면"File| 새로운| 데이터 집합" 도구.
   3. 획득에 사용되는 계측기 유형을 선택하고 "+""를 클릭하여 가져온 데이터 집합을 추가하고 개체를 클릭하고 드래그하여 이미지를 정렬합니다.
   4. 관심 범위를 표시하여 필요한 경우 질량 범위 설정을 확인하거나 수정합니다. 다음을 클릭하여 가져오기 요약을 보고 가져오기를 시작합니다.
2. 샘플 및/또는 다른 샘플의 다른 조직에 관심 있는 m/z를 시각화합니다. 스펙트럼을 클릭하여 관심 있는 m/z를 선택하거나 m/z 상자에값을 입력하기만 하면 됩니다.
   1. 관심 있는 m/z를 결정하기 위해 서로 다른 조직 및/또는 다른 샘플 간의 공동 지역화 또는 차별적 값을 검색하는 데 필요한 경우 통계 테스트를 수행합니다. 도구는"도구"메뉴에서 사용할 수 있으며 이 프로토콜에 설명되지 않습니다.
3. 관심 있는 m/z(예: 공동지역화된 차별 화합물)를 개체 탭에서 .csv 파일로 내보냅니다. 전체 데이터 집합이 너무 크지 않은 경우에도 내보낼 수 있습니다(예: 최대 60,000줄). 빨간색 화살표로 표시된 관심 영역의 오른쪽에 있는"내보내기"아이콘을 클릭합니다.
4. .csv 파일을 가져와 서 어장 소프트웨어(메타보스케이프)에서 새 데이터 집합을 만듭니다. "프로젝트| 클릭 CSV 프로젝트가져오기 ". 정확한 m/z만 고려되고 동위원소 프로필이 손실됩니다.
   참고: 5.0 소프트웨어 버전은 시각화 소프트웨어에서 직접 데이터를 가져올 수 있으므로 동위원소 프로파일을 고려할 수 있으므로 보다 정확한 음표를 사용할 수 있습니다.
5. 공개적으로 사용할 수 있는 데이터베이스에서 파생될 수 있는 사용자 지정 된 별언 목록으로 노츠합니다. 분석 목록을 만드는 소프트웨어에 의해 템플릿이 제공됩니다.
6. 예측 소프트웨어(대사 산물 예측)를 사용하여 인음부 화합물의 대사 산물의 실리코 예측에서 수행한다. 관심 있는 화합물의 개발된 수식은 소프트웨어의 사용자가 그려지거나 .mol 파일로 가져온 것이 필요합니다. 그런 다음 메서드는 간단한 단계별 프로토콜입니다.
7. 대사 산물 목록을 복구하고 분석 목록을 만들고, 분석 소프트웨어에서 사용하여 예측된 대사 산물로 원시 데이터에 인가합니다. 또는 대사 산물 목록이 짧은 경우 4.8 단계에서 수동으로 검색하십시오.
8. 시각화 소프트웨어에서 원시 데이터에서 대사 산물의 조직 분포를 시각화합니다.
9. 예측 된 대사 산물을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 예측 소프트웨어의 대사 과정에 관련된 효소의 이름을 복구합니다.

결과

이 프로토콜은 환경의 제노바이오틱에 노출된 S. 알바 나무에서 샘플링된 신선한 잎에 적용되었다. 이 프로세스는 그림 1에묘사됩니다. 첫 번째 단계는 관심있는 샘플의 얇은 조각을 준비하는 것입니다. 식물 샘플은 조직이 이질적이며 물 및 / 또는 공기를 포함 할 수 있기 때문에 동물 샘플보다 절단하기가 더 어렵습니다. 이러한 난이도는 샘플 주위의 균일한 블록을 ...

토론

이 프로토콜의 중요한 부분은 샘플 준비입니다: 샘플은 부드럽고 온전해야 합니다. 절단은 가장 어려운 부분이며, 시료의 온도와 두께는 연구된 시료의 종류에 따라 달라질 수 있다. 동물 조직은 일반적으로 균일하고 절단하기 쉽습니다. 식물 샘플은 종종 다른 구조를 통합하므로 블레이드가 부드럽고 단단하거나 빈 혈관 조직을 만날 때 그대로 유지하기가 더 어렵습니다. 식물 샘플과 함께 작업 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cover slips	Bruker Daltonics	267942
Cryomicrotome	Thermo Scientific
Excel	Microsoft corporation
flexImaging	Bruker Daltonics
ftmsControl	Bruker Daltonics
GTX primescan	GX Microscopes
HCCA MALDI matrix	Bruker Daltonics	8201344
ImagePrep	Bruker Daltonics
ITO-coated slides	Bruker Daltonics	237001
M1-embedding matrix	ThermoScientific	1310
Metabolite Predict	Bruker Daltonics
Metaboscape	Bruker Daltonics
Methanol	Fisher Chemicals		No specific reference needed
MX 35 Ultra blades	Thermo Scientific	15835682
Plastic molds			No specific reference needed
SCiLS Lab	Bruker Daltonics
SolariX XR 7Tesla	Bruker Daltonics		The method proposed is not limited to this instrument
Spray sheets for ImagePrep	Bruker Daltonics	8261614
TFA	Sigma Aldrich		No specific reference needed