Investigación Del Metabolismo De Xenobióticos En Hojas De Salix alba A Través De Imágenes Espectrometría De Masas

Resumen

Este método utiliza imágenes de espectrometría de masas (MSI) para comprender los procesos metabólicos en las hojas de S. alba cuando se exponen a xenobióticos. El método permite la localización espacial de compuestos de interés y sus metabolitos predichos dentro de tejidos específicos e intactos.

Resumen

El método presentado utiliza imágenes de espectrometría de masas (MSI) para establecer el perfil metabólico de las hojas de S. alba cuando se exponen a xenobióticos. Utilizando un enfoque no dirigido, los metabolitos de las plantas y los xenobióticos de interés se identifican y localizan en los tejidos de las plantas para descubrir patrones de distribución específicos. A continuación, se realiza una predicción in silico de metabolitos potenciales (es decir, catabolitos y conjugados) a partir de los xenobióticos identificados. Cuando se localiza un metabolito xenobiótico en el tejido, se registra el tipo de enzima implicada en su alteración por la planta. Estos resultados se utilizaron para describir diferentes tipos de reacciones biológicas que ocurren en las hojas de S. alba en respuesta a la acumulación xenobiótica en las hojas. Los metabolitos se predijeron en dos generaciones, permitiendo la documentación de reacciones biológicas sucesivas para transformar xenobióticos en los tejidos foliares.

Introducción

Los xenobióticos están ampliamente distribuidos en todo el mundo debido a las actividades humanas. Algunos de estos compuestos son solubles en agua y absorbidos por el suelo^1,y entran en la cadena alimentaria cuando se acumulan en los tejidos vegetales^2,3,4. Las plantas son devoradas por insectos y herbívoros, que son presa de otros organismos. La ingesta de algunos xenobióticos y su impacto en la salud de una planta se han descrito^5,6,7,8,pero sólo recientemente a nivel tisular^9. Por lo tanto, todavía no está claro dónde o cómo se produce el metabolismo de los xenobióticos, o si los metabolitos específicos de las plantas están correlacionados con la acumulación xenobiótica en tejidos específicos¹⁰. Por otra parte, la mayoría de la investigación ha pasado por alto el metabolismo de los xenobióticos y sus metabolitos en las plantas, por lo que poco se sabe acerca de estas reacciones en los tejidos de las plantas.

Aquí se propone un método para investigar reacciones enzimáticas en muestras biológicas que pueden estar asociadas a la localización tisular de sustratos y productos de las reacciones. El método puede dibujar el perfil metabólico completo de una muestra biológica en un experimento, ya que el análisis no está dirigido y se puede investigar utilizando listas personalizadas de analitos de interés. Se proporciona una lista de candidatos con seguimiento en el conjunto de datos original. Si uno o varios analitos de interés se observan en la muestra, la localización específica del tejido puede proporcionar información importante sobre los procesos biológicos relacionados. Los analitos de interés pueden ser modificados in silico utilizando las leyes biológicas pertinentes para buscar posibles productos/metabolitos. La lista de metabolitos obtenidos se utiliza para analizar los datos originales mediante la identificación de las enzimas implicadas y la localización de las reacciones en los tejidos, ayudando así a comprender los procesos metabólicos que ocurren. Ningún otro método proporciona información sobre los tipos de reacciones que ocurren en las muestras biológicas, la localización de los compuestos de interés y sus metabolitos relacionados. Este método se puede utilizar en cualquier tipo de material biológico una vez que los tejidos frescos e intactos están disponibles y los compuestos de interés pueden ser ionizados. El protocolo propuesto fue publicado en Villette et al.¹² y se detalla aquí para su uso por la comunidad científica.

Protocolo

1. Preparación de la muestra

1. Obtenga la muestra biológica y manténgala fresca e intacta (por ejemplo, no la fuerce a un tubo) o congele. El protocolo propuesto se aplica a cualquier tipo de muestra biológica sólida (es decir, tejidos vegetales, animales o humanos) para localizar compuestos en tejidos específicos.
2. Enfríe un criomicrotoma a -20 °C. Mantenga el porta muestras y la cuchilla a la misma temperatura.
3. Si es necesario, incruste el objeto en el medio de incrustación M1 para conservarlo durante el corte.
   1. Vierta un poco de matriz en un molde de plástico colocado en la cámara del criomicrotome. Agregue rápidamente la muestra y vierta un poco más de medio de incrustación para cubrirla. Mantenga la muestra en el centro del molde a medida que la matriz se solidifica mientras se enfría.
      NOTA: La incrustación no es necesaria para todos los objetos biológicos. Los objetos homogéneos como los cerebros de ratón no necesitan un medio de incrustación y se pueden cortar congelados.
4. Coloque la muestra incrustada o congelada en el soporte del criomicrotoma y córtela con una cuchilla afilada. Un espesor de 5-30 μm es bueno para muestras de plantas, que son difíciles de cortar debido a su heterogeneidad. Adapta el espesor y la temperatura de corte a la muestra, realizando varios cortes para encontrar las mejores condiciones. En el ejemplo proporcionado, la muestra se cortó a -20 °C. Considere mantener la muestra por debajo de 0 °C para evitar la degradación de la muestra.
   NOTA: El uso de un microscopio binocular colocado junto al criomicrotoma puede ayudar a determinar la calidad de las rebanadas. Los tejidos deben permanecer intactos.
5. Mueva cuidadosamente la rebanada a un portaobjetos recubierto de ITO usando pinzas o un pincel pequeño, luego coloque un dedo debajo del portaobjetos para calentar y secar la muestra. Mantenga el portaobjetos en la cámara del criomicrotoma hasta que todas las muestras estén listas. Saque el portaobjetos de la cámara lentamente para evitar el choque térmico.
   NOTA: Para verificar qué lado de la diapositiva está recubierto de ITO, coloque una gota de agua en la diapositiva a temperatura ambiente (RT). La gota permanecerá redonda en el lado recubierto de ITO o se aplanará en el lado sin recubrimiento.
6. Dibuje marcas en la diapositiva con un rotulador delgado o fluido de corrección y escanee con un escáner de alta resolución antes de la deposición de la matriz. Las marcas se utilizarán para determinar la posición exacta de la muestra en la diapositiva cuando esté en el espectrómetro de masas. La mejor manera de obtener puntos de referencia precisos es dibujar una cruz.

2. Deposición matricial

1. Preparar la matriz MALDI: pesar 70 mg de α-ciano-4-hidroxicinámico ácido (HCCA) y diluirlo en 10 mL de una solución de agua y metanol (50:50) con TFA al 0,2%. Sonicar la matriz durante 10 minutos en RT. Puede haber una matriz sólida adicional después de la sonicación.
   NOTA: Se pueden utilizar diferentes tipos de matrices MALDI dependiendo de los analitos de interés.
2. Limpie el robot de deposición de matriz con metanol al 100%.
3. Usando metanol y una toallita de precisión, limpie la diapositiva, sosteniendo las muestras sin tocarlas y sin quitar las marcas. Agregue un cubrebocas limpio sobre la diapositiva en un área sin muestra. Esa parte de la diapositiva se coloca sobre el detector óptico para rastrear la deposición de la matriz.
   NOTA: Para realizar un seguimiento óptico del grosor de la matriz, la diapositiva y el cubrebocas deben estar muy limpios.
4. Utilice el robot para la deposición de la matriz: coloque sólo 6 mL de la solución de la matriz en el depósito, y añadir 2 mL de metanol al 100% para un volumen total de 8 mL.
   NOTA: El registro del espesor de la matriz a lo largo de la deposición es automático y se puede recuperar utilizando una memoria USB. El desarrollo de un método de pulverización no se detalla aquí.

3. Adquisición de datos

1. Coloque 1 μL de la matriz en una placa MALDI para calibrar el espectrómetro de masas utilizando los picos de la matriz como referencias. El desarrollo de un método de adquisición en el espectrómetro de masas no se detalla aquí.
   1. Inserte la placa MALDI en la fuente, haga clic en "Cargar destino" en el software ftmsControl, y espere a que la placa sea cargada.
   2. Elija la posición del punto de la matriz haciendo clic en el lugar en la imagen que representa la placa MALDI.
   3. Indique el nombre de la muestra y la carpeta en la pestaña " Información demuestra" del software.
   4. Comience la adquisición haciendo clic en "Adquisición".
   5. Mueva la placa ligeramente durante la adquisición usando el puntero del ratón en la pestaña "MALDI video" para que el láser apunte a diferentes puntos.
   6. Cuando finalice la adquisición, vaya a la pestaña"Calibración",elija la lista de calibración HCCA en Modo cuadrático y haga clic en Automático. El resultado de la calibración global se indica en la ventana " Diagrama decalibración" y debe ser inferior a 0,2 ppm para un SolariX XR 7T.
   7. Si la calibración es buena, haga clic en "Aceptar" y guarde el método.
2. Una vez finalizada la deposición de la matriz en las muestras, coloque la diapositiva en un adaptador de diapositivas y recupere la posición de las marcas utilizando una cubierta de plástico.
3. En el software flexImaging, configure una nueva ejecución de imágenes utilizando la primera ventana que se abre con el software.
   1. Asigne un nombre a la ejecución de imágenes, seleccione el Directorio de resultadosy haga clic en Siguiente.
   2. Indique el tamaño del ráster (es decir, la región de medición definida por el usuario), elija el método que se utilizará (calibrado en la sección 3.1) y haga clic en Siguiente.
   3. Cargue la imagen óptica de la diapositiva obtenida en el paso 1.6 después de escanear la diapositiva y haga clic en Siguiente.
   4. La imagen se abre en una ventana más ancha. Utilice las marcas en la diapositiva para enseñar la posición de las diapositivas: en ftmsControl, coloque el objetivo de la ventana de vídeo MALDI en la posición exacta de una marca, a continuación, vuelva a felxImaging y haga clic en el mismo punto exacto en la imagen óptica. Repita esto para tres puntos independientes. La cubierta de plástico que lleva las marcas se coloca en una placa MALDI para recuperar su posición y facilitar la enseñanza.
      NOTA: Si las marcas se hicieron con un marcador, agregar líquido de corrección blanco en la parte posterior de la diapositiva puede hacer que se destaquen durante la enseñanza.
4. Dibuje las regiones de interés en las muestras en el software flexImaging utilizando las herramientas "Agregar regiones de medición".
5. Guarde la ejecución de imágenes y una "Secuencia autoexecuta" si se van a analizar varias muestras.
6. Inicie una secuencia usando "AutoXecute Batch Runner" si se analizan varias muestras.
   Nota : sincronizar los datos regularmente a una ubicación segura.

4. Tratamiento de datos

1. Importe los datos sin procesar al software de visualización (SCiLS Lab) y cree un conjunto de datos. Esto se hace en dos pasos separados en este software.
   1. Utilice la herramienta "Importador por lotes" y seleccione los datos sin procesar, indique el directorio de destino y haga clic en "Importar".
   2. Después de la importación, se pueden combinar varios conjuntos de datos para su posterior análisis. Para combinar conjuntos de datos, utilice el"Archivo| Nuevo| Conjunto de datos" herramienta.
   3. Seleccione el tipo de instrumento utilizado para la adquisición, agregue los conjuntos de datos importados haciendo clic en "+", y organice las imágenes haciendo clic y arrastrando los objetos.
   4. Compruebe la configuración del rango de masa o modifíquelo si es necesario indicando el rango de interés. Haga clic en Siguiente para ver el resumen de importación e iniciar la importación.
2. Visualizar el m/z de interés en los diferentes tejidos de una muestra y/o en diferentes muestras. Simplemente haga clic en los espectros para seleccionar el m/z de interés o escriba el valor en el cuadro m/z.
   1. Realice las pruebas estadísticas si es necesario buscar para los valores colocalized o discriminativos entre diversos tejidos y/o diversas muestras para determinar el m/z del interés. Las herramientas están disponibles en el menú "Herramienta" y no serán descritas en este protocolo.
3. Exporte el m/z de interés (por ejemplo, compuestos colocalizados y discriminativos) como un archivo .csv desde la pestaña Objeto. El conjunto de datos completo también se puede exportar si no es demasiado grande (es decir, un máximo de 60.000 líneas). Haga clic en el icono "Exportar" en el lado derecho de la región de interés indicada por una flecha roja.
4. Importe el archivo .csv para crear un nuevo conjunto de datos en el software de anotación (Metaboscape). Haga clic en "Proyectos | Importar proyecto CSV". Tenga en cuenta que solo se considerará la m/z exacta y se perderá el perfil isotópico.
   NOTA: La versión de software 5.0 permite la importación directa de datos desde el software de visualización, lo que permite una anotación más precisa, ya que se puede considerar el perfil isotópico.
5. Anote con listas de analitos personalizadas, que se pueden derivar de bases de datos disponibles públicamente. Una plantilla es dada por el software para crear listas de analitos.
6. Utilice el software de predicción (Metabolite Predict) para realizar una predicción in silico de los metabolitos de los compuestos anotados. Se necesita la fórmula desarrollada del compuesto de interés, ya sea dibujado por el usuario en el software o importado como un archivo .mol. A continuación, el método es un simple protocolo paso a paso.
7. Recupere la lista de metabolitos, cree una lista de analitos y utilícese en el software de anotación para anotar los datos sin procesar con metabolitos predichos. Alternativamente, si la lista de metabolitos es corta, búscala manualmente en el paso 4.8.
8. Visualice la distribución tisular de los metabolitos en los datos sin procesar en el software de visualización.
9. Recupere los nombres de las enzimas implicadas en los procesos metabólicos en el software de predicción haciendo clic derecho en el metabolito predicho de interés.

Resultados

Este protocolo se aplicó a hojas frescas muestreadas de un árbol de S. alba expuesto a xenobióticos en el medio ambiente. El proceso se representa en la Figura 1. El primer paso es preparar rodajas delgadas de la muestra de interés. Las muestras de plantas son a menudo más difíciles de cortar que las muestras de animales, ya que los tejidos son heterogéneos y pueden contener agua y / o aire. Esta dificultad se maneja utilizando el medio de incrustación, que forma un bloque h...

Discusión

La parte crítica de este protocolo es la preparación de la muestra: la muestra debe ser suave e intacta. El corte es la parte más difícil, ya que la temperatura y el espesor de la muestra pueden variar dependiendo del tipo de muestra estudiada. Los tejidos animales suelen ser homogéneos y más fáciles de cortar. Las muestras de plantas a menudo incorporan diferentes estructuras y, por lo tanto, son más difíciles de mantener intactas, ya que la hoja encuentra tejidos vasculares blandos, duros o vacíos. Es muy rec...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cover slips	Bruker Daltonics	267942
Cryomicrotome	Thermo Scientific
Excel	Microsoft corporation
flexImaging	Bruker Daltonics
ftmsControl	Bruker Daltonics
GTX primescan	GX Microscopes
HCCA MALDI matrix	Bruker Daltonics	8201344
ImagePrep	Bruker Daltonics
ITO-coated slides	Bruker Daltonics	237001
M1-embedding matrix	ThermoScientific	1310
Metabolite Predict	Bruker Daltonics
Metaboscape	Bruker Daltonics
Methanol	Fisher Chemicals		No specific reference needed
MX 35 Ultra blades	Thermo Scientific	15835682
Plastic molds			No specific reference needed
SCiLS Lab	Bruker Daltonics
SolariX XR 7Tesla	Bruker Daltonics		The method proposed is not limited to this instrument
Spray sheets for ImagePrep	Bruker Daltonics	8261614
TFA	Sigma Aldrich		No specific reference needed