JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وصف هنا هو بروتوكول لتحديد أربعة الأيضات التربتوفان مختلفة ولدت في مسار الكينارينين (الكينارينين، 3-هيدروكسيكينورين، حمض زانثيورينيك، 3-حمض هيدروكسيانثرانياليك) في الوسط الذي تم جمعه من الثقافات الخلايا السرطانية تحليلها بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب واحد رباعية الطيف الكتلي.

Abstract

وقد تلقى مسار الكينيرينين والانتبولات التربتوفان دعا kynurenines زيادة الاهتمام لمشاركتها في تنظيم المناعة وبيولوجيا السرطان. وغالبا ما تستخدم في المختبر خلية الخلية المقايسة لمعرفة المزيد عن مساهمة مختلف نواتج التريبتوفان في آلية المرض ولاختبار الاستراتيجيات العلاجية. خلية ثقافة المتوسطة التي هي غنية في المستقلبات السرية وجزيئات الإشارات يعكس حالة الأيض التربتوفان وغيرها من الأحداث الخلوية. بروتوكولات جديدة لتحديد موثوق بها من الكينيرينينات متعددة في المتوسطة خلية معقدة ثقافة مطلوبة للسماح لتحليل موثوق وسريع من عينات متعددة. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة مقرونة بمنظار الطيف الكتلي. وتستخدم هذه التقنية القوية في العديد من المختبرات السريرية والبحثية من أجل القياس الكمي من المستقلبات ويمكن استخدامها لقياس الكينيرينينات.

هنا هو استخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب الطيف الطيفي كتلة رباعية واحدة (LC-SQ) لتحديد في وقت واحد من أربعة kynurenines، أي، الكيونرينين، 3-هيدروكسيكي نيورينرينين، 3-هيدروكسيانثرانليك، وحمض xanthurenic في المتوسطة التي تم جمعها من الخلايا السرطانية في المختبر. SQ كاشف بسيط للاستخدام وأقل تكلفة بالمقارنة مع مطياف كتلة أخرى. في تحليل SQ-MS، يتم إنشاء أيونات متعددة من العينة وفصلها وفقًا لنسبة الكتلة إلى الشحنة المحددة(m/z)، متبوعة بالكشف باستخدام وضع مراقبة الأيونات الواحدة (SIM).

وتسترعي هذه الورقة الانتباه إلى مزايا الطريقة المبلغ عنها وتشير إلى بعض نقاط الضعف. وهو يركز على العناصر الحاسمة لتحليل LC-SQ بما في ذلك إعداد العينة جنبا إلى جنب مع تحليل الكروماتوغرافيا وقياس الطيف الكتلي. كما تناقش مراقبة الجودة، وظروف معايرة الأسلوب، وقضايا تأثير المصفوفة. وصفنا تطبيق بسيط من 3-نيتروتروروسين كمعيار واحد التناظرية لجميع التحليلات المستهدفة. وكما أكدت التجارب التي أجريت على خلايا سرطان المبيض والثدي، فإن الطريقة المقترحة من LC-SQ تولد نتائج موثوقة ويمكن تطبيقها كذلك على النماذج الخلوية المختبرية الأخرى.

Introduction

مسار الكينيرينين (KP) هو الطريق الرئيسي للتريبتوفان (Trp) تقويض في الخلايا البشرية. إندولام-2،3-ديوكسيجيناز (IDO-1) في الخلايا خارج الكبد هو أول والحد من إنزيم KP ويحول Trp إلى N-formylkynurenine1. خطوات أخرى داخل KP توليد الأيض الثانوية الأخرى, وهي الكينيرينين التي تحمل خصائص بيولوجية مختلفة. Kynurenine (Kyn) هو أول ثابت Trp مستقرة تظهر الخصائص السامة وتنظيم الأحداث الخلوية بعد ربط لمستقبلات الهيدروكربونات آرل (AhR)2. في وقت لاحق, يتم تحويل كين إلى عدة جزيئات إما تلقائيا أو في العمليات التي تتوسطها انزيم, توليد هذه الأيضات مثل 3-هيدروكسيكينرينين (3HKyn), حمض الجمرة الخبيثة (AA), 3-حمض هيدروكسيانثانليك (3-ها)، حمض الكيونريك (كينا), وحمض xanthurenic (XA). آخر المستقلب المصب، 2-أمينو-3-الكربوكبوكيكونيك حمض-6-شبهالديهيد (ACMS)، يخضع للدراجات غير الانزيمية إلى حمض الكينولينيك (QA) أو حمض بيكولينيك (السلطة الفلسطينية)1. وأخيرا، يتم تحويل المزيد من QA إلى نيكوتيناميد أدينين دينوكليوتيد (NAD+)3، وهو المستقلب نقطة نهاية KP الذي هو عامل مساعد انزيم مهم. بعض الكيرينينات لها خصائص اعصاب مثل كينا والسلطة الفلسطينية، في حين أن الآخرين، أي 3HAA و 3HKyn، هي سامة4. حمض Xanthurenic، الذي يتكون من 3HKyn، ويعرض خصائص مضادات الأكسدة و vasorelaxation5. XA يتراكم في العدسات الشيخوخة ويؤدي إلى موت الخلايا الظهاريةللخلايا الظهارية 6. اكتسبت KP، التي تم وصفها في منتصف القرنالعشرين، المزيد من الاهتمام عندما تم إثبات مشاركتها في اضطرابات مختلفة. زيادة نشاط هذا الطريق الأيضي وتراكم بعض الكينيرينات تعدل الاستجابة المناعية وترتبط مع ظروف مرضية مختلفة مثل الاكتئاب، الفصام، اعتلال الدماغ، فيروس نقص المناعة البشرية، الخرف، التصلب الجانبي الضموري، الملاريا، الزهايمر، مرض هنتنغتون، والسرطان4،7. ويلاحظ بعض التغيرات في التمثيل الغذائي Trp في microenonments الورم والخلايا السرطانية2,8. وعلاوة على ذلك، تعتبر الكينيرينينات علامات المرضالواعدة 9. في أبحاث السرطان، نماذج ثقافة الخلايا في المختبر راسخة وتستخدم على نطاق واسع لتقييم ما قبل الكلينيكي من الردود على العقاقير مكافحة السرطان10. ويفرز الأيض Trp من قبل الخلايا في الوسط ثقافة ويمكن قياسها لتقييم حالة مسار الكينيرينين. ولذلك، هناك حاجة إلى تطوير طرق مناسبة للكشف المتزامن عن أكبر عدد ممكن من نواتج الأيض في النماذج البيولوجية في مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية مع بروتوكول سهل ومرن وموثوق به.

في هذه الورقة، نحن وصف بروتوكول لتحديد المتزامنة من أربعة الأيض المسار الكينيرينين: كين، 3HKyn، 3HAA، وXA من قبل LC-SQ في وسط ما بعد الثقافة التي تم جمعها من الخلايا السرطانية. في نهج تحليلي حديث، الكروماتوغرافيا السائل13،14،15،16 ويفضل للكشف في وقت واحد وتكميم من المستقلين التربتوفان الأيض، على النقيض من البيوكيميائية غير محدد مقولات استخدام كاشف Ehrlich11،12. في الوقت الحاضر، هناك العديد من الطرق المتاحة لتحديد الكينيرينين في العينات البشرية، تقوم أساسا على الكروماتوغرافيا السائلة مع الأشعة فوق البنفسجية أو للكشف عن الفلوريسين13،17،18،19. يبدو اللوني السائل مقرونًا بمستشعر لقياس الطيف الكتلي (LC-MS) أكثر ملاءمة لهذا النوع من التحليل ، نظرًا لحساسية أعلى (حدود أقل للكشف) والانتقائية والتكرار.

وقد تم بالفعل تحديد الأيض Trp في مصل الدم البشري والبلازما والبول13،20،21،22،23، ومع ذلك ، فإن أساليب العينات البيولوجية الأخرى ، مثل خلية ثقافة المتوسطة هي أيضا المطلوب. سابقا، LC-MS كانت تستخدم للمركبات المشتقة من Trp في وسط جمعت بعد زراعة خلايا الورم الدبقي البشري، monocytes، الخلايا التشعبية أو الخلايا الفلكية تعامل مع انترفيرون غاما (IFN-γ)24،25،26. حاليا, هناك حاجة لبروتوكولات جديدة التحقق من صحة التي يمكن أن تسمح بإجراء تقييم للعديد من الأيضات في وسائل الإعلام المختلفة الثقافة, الخلايا, والعلاجات المستخدمة في نماذج السرطان.

والغرض من الطريقة المتقدمة هو تحديد (في غضون عملية تحليلية واحدة) أربعة الكينيرينينات الرئيسية التي يمكن أن تشير إلى تشوهات في KP. قدمت هنا هي الخطوات الحاسمة من بروتوكولنا نشرت مؤخرا لتحليل LC-SQ الكمية من kynurenines المحددة ذات مغزى باستخدام معيار داخلي واحد (3-نيتروتروروسين، 3NT) في المتوسطة التي تم جمعها من الخلايا السرطانية البشرية في المختبر مثقف27. على حد علمنا، هو أول بروتوكول LC-SQ لتحديد كمية 3HKyn في وقت واحد، 3HAA، كين وXA في وسط الثقافة التي تم الحصول عليها من الخلايا التي تزرع في المختبر. عند بعض التعديلات، قد يتم تطبيق طريقة مزيد من لدراسة التغييرات في التمثيل الغذائي Trp في مجموعة أوسع من نماذج ثقافة الخلية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد معيار 3NT، كين، 3HKyn، 3HAA، XA حلول الأسهم القياسية

  1. وزن الكواشف في قارورة بأعلى دقة (0.3 ملغ لكل من الزّين). للحصول على دقة أفضل، وتوسيع نطاق الكواشف، وضبط حجم المذيب وفقا للخطوة 1.2.
  2. تذوب الكواشف في 300 ميكرولتر من المذيبات للحصول على محلول مخزون من 1 g/L. 3NT في 1٪ (v/v) حمض الفشكل (FA) في الماء؛ Kyn, 3HAA, وXA في ثنائيات الدايميتيل السلفوكسيد (DMSO); 3HKyn في الماء حموضة إلى 2.5 درجة الحموضة مع حمض الهيدروكلوريك (HCl).
    تنبيه: 3HAA يهيج العينين والأنف والحنجرة والرئتين. وهو ضار عند استنشاقه ، في اتصال مع الجلد ، وإذا ابتلع. ارتداء الحماية المناسبة، أي القفازات والقناع.
  3. إغلاق بإحكام القارورة ووضعها في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 1 دقيقة لتسريع حل.
    ملاحظة: تخزين حلول الأسهم في -20 درجة مئوية وتقليل التجميد / الذوبان (3 دورات كحد أقصى) بسبب عدم استقرار حلول الأسهم.

2- إعداد الوسيلة الوسيطة لثقافة معالجة الفحم

  1. في أنبوب، تزن 280 ملغ من الفحم المنشط وإضافة 5 مل من المتوسطة السائلة المعدة لأصناف الخلايا ذات الاهتمام.
  2. يهز أنبوب مع المتوسطة والفحم على رأى الروك رأى لمدة 2 ساعة، في درجة حرارة الغرفة (السرعة المحددة إلى 50 التذبذبات / دقيقة). بعد ذلك، الطرد المركزي الأنابيب في 6000 س ز لمدة 15 دقيقة.
  3. إزالة أنبوب من جهاز الطرد المركزي وجمع بعناية فائقة دون إزعاج الرواسب. كرر الطرد المركزي إذا لزم الأمر، لإزالة جميع بقايا الفحم.
  4. تصفية عظمى باستخدام 0.45 μm مرشاح الحقن.
  5. تأكد من أن الوسيلة الثقافة المعالجة مسبقة للفحم محرومة من آثار الكينيرينينات عن طريق تشغيل عينة تجريبية على LC-MS كما هو موضح في الخطوة 6.3.2. وإلا، كرر الخطوات 2.1-2.4.
    ملاحظة: إذا كانت الثقافة الكاملة المتوسطة في البداية لا تحتوي على الكينيرينينات، قد يتم حذف خطوة تنقية باستخدام الفحم. في هذه الحالة، إعداد معايير المعايرة وعينات مراقبة الجودة باستخدام المتوسطة الكاملة التي عادة ما تكون معدة لأصناف الخلايا.
  6. تخزين المتوسط المعد في 4 درجة مئوية حتى التحليل.

3. جعل حلول المعايرة ومنحنيات المعايرة

  1. قم بزدّح متوسطة الاستزراع المعالجة مسبقًا بالفحم بـ 0.75 ميكرولتر من 0.1 جرام/لتر 3NT، وأضف أربعة معايير (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) على الأقل عند ستة تركيزات مختلفة لتغطية نطاقات المعايرة. الحفاظ على حجم النهائي من كل عينة في 150 μL. دوامة جيدا. استخدام أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل لإعداد العينات.
    ملاحظة: نقاط المعايرة المقترحة لـ 3HKyn: 0.018، 0.045، 0.22، 1.12، 2.23، 4.46 ميكرومول/لتر؛ 0.045، 1.12، 2.23، 4.46 ميكرومول/لتر؛ 0.045، 1.12، 2.23، 4.46 ميكرومول/لتر؛ 0.045، 1.12، 2.23، 4.46 ميكرومول/لتر؛ 0.045، 1.12، 2.23، 4. بالنسبة لـ Kyn: 0.0096, 0.048, 0.24, 1.20, 2.40, 3.84 ميكرومول/لتر؛ بالنسبة إلى 3HAA: 0.033، 0.16، 0.65، 3.27، 6.53، 13.06 ميكرومول/لتر؛ بالنسبة لـ XA: 0.019، 0.13، 0.49، 1.22، 3.65، 4.87 ميكرومول/لتر.
  2. إضافة 150 ميكرولتر من الميثانول البارد (أبقى في -20 درجة مئوية) تحتوي على 1٪ (v/v) حمض الفشكل في كل أنبوب لفك البروتين العينة. بإحكام إغلاق الأنابيب و دوامة جيدا.
  3. احتضان العينات في -20 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
  4. أجهزة الطرد المركزي العينات في 14،000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 °C. إزالة الأنابيب من جهاز الطرد المركزي. جمع اغطار في أنابيب جديدة. لا تزعج الرواسب.
  5. نقل 270 ميكرولتر من ااالزجاج في قارورة الزجاج باستخدام ماصة أوتوماتيكية. ضعي القنينات في المبخر وتتبخرين بلطف حتى تجف. استخدام البرنامج المناسب لكسور الماء / الميثانول لتبخر المكونات المتطايرة. لا تطبق درجة حرارة أعلى من 40 درجة مئوية وتجنب الإفراط في التجفيف.
    ملاحظة: قارورة الزجاج المسطحة القاعية، أي قنينات الكروماتوغرافية تسهل التبخر الأسرع واسترجاع أعلى بالمقارنة مع الأنابيب المخروطية البلاستيكية.
  6. بعد 30 دقيقة، والتحقق من حالة التبخر. إذا لزم الأمر، استمر في التبخر (على سبيل المثال، أضف 10 دقائق إضافية). تجنب الإفراط في التجفيف.
  7. إزالة قارورة من المبخر. إعادة تشكيل كل عينة في 60 ميكرولتر من 0.1٪ (v/v) حمض الفليك في الماء. إضافة المذيبات في القارورة التي تحتوي على المواد المتبقية. إغلاق بإحكام قوارير ودوامة-جيدا.
  8. نقل العينة إلى أنبوب 1.5 مل وتدور في 14000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية لفصل البروتين المترسب.
  9. دون إزعاج بيليه البروتين، نقل supernatants في قوارير الكروماتوغرافي مع إدراج الزجاج المخروطي مع ماصة التلقائي. أغلق القنينات بإحكام.
  10. التحقق من وجود فقاعات الهواء في القارورة إدراج وإزالتها إذا لزم الأمر (على سبيل المثال، عن طريق دوامة).
  11. نقل قوارير الكروماتوغرافية تحتوي على عينات في LC autosampler. تسجيل موضع العينات الموضوعة في علبة ampler.

4. إعداد عينات مراقبة الجودة (QC)

  1. اشعل محلول الاستزراع قبل المعالجة بالفحم (المعد في أنبوب طردي 1.5 مل) مع 0.75 ميكرولتر من 0.1 غرام/لتر 3NT حل ومعايير أربعة kynurenines (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) بتركيز واحد مختار من النطاق الخطي للمنحنيات المعايرة. الحفاظ على حجم النهائي من العينة في 150 μL.
    ملاحظة: إذا كان ذلك ممكناً، قم بإعداد عدة عينات من مراقبة الجودة بتركيزات مختلفة تقع تحت النطاق الخطي لمنحنى المعايرة.
  2. اتبع البروتوكول الموضح في القسم 3 (الخطوات 3.2-3.11).

5. إنشاء نظام LC-MS

  1. تحضير المذيبات المرحلة المتنقلة: المذيب A: 20 mmol/L الأمونيوم formate في الماء فائقة الخطورة (درجة الحموضة 4.3 معدلة مع حمض الفورميك)؛ المذيب B: 100٪ الأسيتونتريل.
    ملاحظة: استخدام زجاجات البورسليكات فقط. شطف زجاجات مع الماء فائقة الخطورة قبل إعادة تعبئتها. لا تستخدم الزجاجات تنظيفها مع المنظفات.
    تنبيه: يسبب الأسيتونتريل آثارًا صحية شديدة أو الوفاة. ومن السهل أن تشعل من الحرارة. يمكن السائل الأسيتونيتريل والبخار تهيج العينين والأنف والحلق والرئتين.
    1. إعداد 5 مول / ل حل الأسهم من formate الأمونيوم عن طريق حل كاشف بلوري (15.77 غرام) في 50 مل من الماء فائقة السخ في زجاجة. يُحرّك المزيج حتى تذوب جميع المخلفات. تصفية من خلال غشاء 0.45 ميكرومتر لإزالة أي بقايا الحطام (على سبيل المثال، باستخدام مرشح حقنة النايلون). تخزين حل الأسهم عند 4 درجة مئوية.
    2. إعداد المذيب A بإضافة 4 مل من 5 مول/ لتر formate الأمونيوم في الماء إلى 980 مل من الماء فائقة الخطورة في زجاجة زجاجية العنبر ويحرك جيدا. تزج شريط اثارة ووضع زجاجة مع المذيبات على مُنشر مغناطيسي. غمر قطباً للدغة الهزية في المحلل وتحكم في الـ pH تحت التحريك. إضافة محلول مخزون حمض الفُرق (98٪ -100٪) dropwise باستخدام ماصة التلقائي مع 0.2 مل تلميح للحصول على درجة حًاً 4.3، وضبط مستوى الصوت تصل إلى 1 لتر مع الماء فائقة الخطورة ويحرك جيدا.
      ملاحظة: إعداد المذيبات مرة واحدة على الأقل في الأسبوع لمنع أي نمو الميكروبات.
      تنبيه: حمض فورميك (FA) سام عند استنشاقه، ويسبب حروقاً جلدية وتلفاً للعين. العمل تحت غطاء الدخان؛ ارتداء قفازات واقية ومعطف.
    3. تصفية جميع الحلول من خلال غشاء 0.22 ميكرومتر (على سبيل المثال، مرشح حقنة النايلون) لإزالة أي بقايا الحطام. اختياريا، استخدم مرشحات مدخل المذيبات المخصصة لخزانات المذيبات LC لحماية النظام من الجسيمات الواردة.
  2. بدء تشغيل LC-MS التحكم والبيانات اقتناء البرمجيات.
  3. تطهير نظام LC مع المرحلة المتنقلة لإزالة الفقاعات، ورئيس جميع القنوات المذيبات.
  4. طقم عمود حراسة لحماية العمود التحليلي من انسداد.
  5. مسح العمود الحارس والتحليلي (C18، 2.1 × 100 مم، 1.8 ميكرومتر) مع 100٪ الأسيتونيتريل لحوالي 30 دقيقة، ومن ثم مع 100٪ المذيبات A حتى لوحظ ضغط مستقر في العمود. التحكم في أداء النظام باستخدام برنامج التحكم.
  6. تعيين معلمات LC المناسبة في برنامج الحصول على البيانات.
    1. إعداد برنامج التدرج: 0-8 دقيقة المذيب B 0٪; 8-17 دقيقة المذيب B 0-2٪ ؛ 17-20 دقيقة المذيب B 2٪ ؛ 20-32 دقيقة المذيب B 10-30٪ ؛ 32-45 دقيقة المذيب B 0٪.
    2. تعيين معدل تدفق المرحلة المتنقلة في 0.15 مل / دقيقة، تحليل إجمالي وقت التشغيل لمدة 45 دقيقة، درجة حرارة العمود في +40 درجة مئوية وحجم الحقن في 10 ميكرولتر.
  7. تعيين المعلمات اقتناء كاشف الطيف الشامل.
    1. تطبيق المعلمات التأين: رصد أيون واحد (SIM)، المؤين إيجابية، ضغط البخاخات من 50 psi، +350 درجة مئوية تجفيف درجة حرارة الغاز، تجفيف تدفق الغاز من 12 لتر / دقيقة، و 5500 فولت من الشعيرية.
    2. حدد أيونات الرصد التحليل: ل3HKyn م / ز 225.0 (فترة المسح الضوئي: 2-6 دقيقة، والجهد جزء: 100 V)؛ ل Kyn m/z 209.0 (فترة المسح الضوئي: 6-12 دقيقة، الجهد المجزأ: 80 فولت)؛ ل3HAA م / ز 154.0 (فترة المسح الضوئي: 12-18 دقيقة، والجهد جزء: 80 V)؛ ل3NT م / ز 227.0 (مسح الفترة: 18-23 دقيقة، والجهد جزء: 100 V)؛ لXA م / ض 206.0 (مسح الفترة: 23-45 دقيقة، والجهد جزء: 100 V).
  8. إنشاء قائمة عمل وتشغيل عينات على نظام LC.
  9. في البداية، قبل تحليل العينات التجريبية، تشغيل عينة فارغة (المذيب A) على الأقل في ثلاث 333، تليها عينة مراقبة الجودة واحدة.
  10. افتح برنامج تحليل البيانات وحمّل النتائج التي تم الحصول عليها لعينة QC.
  11. تحقق من موضع قمم التحليلات على الكروماتوجرام. عندما تتحول الإشارات إلى ما وراء الموضع المتوقع ضبط البوابات الزمنية لجمع إشارات التحليل المناسبة. راجع دليل البرامج للحصول على تعليمات حول تكامل الإشارة.

6. بناء منحنى المعايرة

  1. في برنامج الحصول على البيانات، أضف معايير المعايرة إلى قائمة العمل وتشغيل المعايير في ثلاث 33.
  2. دمج وقياس منطقة الذروة المقابلة ل3HKyn، كين، 3HAA، 3NT، وXA في وقت الاحتفاظ حوالي 4.4 دقيقة، 10 دقيقة، 16 دقيقة، 21 دقيقة، و 30 دقيقة، على التوالي.
  3. بناء منحنيات معايرة الفردية لكل المستقلب باستخدام برنامج جدول البيانات.
    1. لإنشاء مخطط المعايرة، رسم قيمة نسبة من منطقة الذروة التحليل على منطقة الذروة 3NT مقابل تركيز التحليل.
    2. تحليل عينة فارغة (الفحم قبل المعالجة المتوسطة الثقافة ارتفعت فقط مع 3NT) لضمان عدم وجود أي أثر من التحليلات درس في الوسط. وإلا، اطرح القيمة التي تم الحصول عليها من كل نقطة معايرة.
    3. تحقق من الخطية لكل منحنى معايرة.
      1. على حدة، لكل تحليل، إنشاء معادلة خطية تقاطع الميل (y = ax +b)، حيث y يتوافق مع نسبة منطقة الذروة التحليل مقابل منطقة الذروة 3NT، و a هو الميل، و x هو تركيز التحليل (μmol/L)، و b يشير إلى اعتراض المنحنى. سيؤدي رسم الرسم البياني 'y' مقابل 'x' إلى إنشاء منحنى المعايرة.
      2. إضافة خط اتجاه خطي إلى المخطط، وعرض معادلة منحنى المعايرة ومعامل الانحدار على المخطط. تأكد من أن معامل الانحدار هو > 0.990. في حالة عدم تطابق معايير المعايرة، قم بإعداد و/أو تحليل هذه مرة أخرى. اختياريا، تغيير نطاق تركيز منحنى المعايرة.
    4. تحليل عينات مراقبة الجودة للتحقق من أداء النظام قبل تحليل العينات التجريبية. في حالة عدم التوافق (± انحراف 20٪ عن القيمة المرجعية)، قم بإعداد منحنيات المعايرة الجديدة.

7. في خلية في المختبر ثقافة وجمع عينة للتحليل

  1. لوحة الخلايا السرطانية درس (MDA-MB-231 أو SK-OV-3) في DMEM (متوسط النسر المعدلة دولبيكو) التي تحتوي على 4.5 غرام / لتر من ᴅ الجلوكوز، 10٪ (v/v) مصل الأبقار الجنين (FBS)، 2 مليمول / ل ʟ-الجلوتامين و 1 U البنسلين / ستربتوميسين والثقافة في 37 درجة مئوية في جو رطب من 5٪ CO2 لتوسيعها للتجربة. مرور الخلايا في 80٪ من التقاء.
  2. فصل الخلايا من طبق الثقافة باستخدام التربسين، البذور للتجربة على لوحات 12-جيدا في كثافة 0.3 × 106 خلايا في البئر ووضع في حاضنة بين عشية وضحاها.
  3. في اليوم التالي، الطامح المتوسطة الثقافة وإضافة DMEM الطازجة مع أو بدون إضافة المركبات درس، اعتمادا على التصميم التجريبي.
  4. بعد 48 ساعة، وجمع المتوسطة من فوق الخلايا (حوالي 500 ميكرولتر) في أنبوب 1.5 مل. جهاز طرد مركزي في 14، 000 س ز لمدة 5 دقائق لإزالة أي حطام الخلية. جمع المابير وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى التحليل.
  5. حفظ بيليه الخلوية من الخطوة 7.4 لتقدير البروتين. تجميد العينات في -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: ينبغي تطبيع النتائج التي تم الحصول عليها عن وسيط من آبار مختلفة إلى إجمالي محتوى البروتين لمراعاة التباين في رقم الخلية في الآبار الفردية. ويمكن تقييم تركيز البروتين كما هو موضح في الخطوة 9.

8. إعداد عينات لتحليل LC-MS

  1. اذيب العينة المجمدة في درجة حرارة الغرفة واخلط جيدا. نقل 149.25 ميكرولتر من وسط الثقافة إلى أنبوب الطرد المركزي (1.5 مل).
  2. إضافة 0.75 ميكرولتر من 0.1 غرام / لتر من 3NT الحل (معيار داخلي). أغلق الأنابيب و الدوامة جيداً.
  3. إضافة 150 μL من المبردة في -20 درجة مئوية الميثانول تحتوي على 1٪ (v/v) FA لتكثير العينات. أغلق الأنابيب و الدوامة جيداً.
  4. مواصلة إعداد العينة كما هو موضح في القسم 3 (الخطوات 3-3-3-11).
    ملاحظة: بعض الخلايا السرطانية مثل SK-OV-3 تفرز كميات كبيرة من كين في وسط الثقافة. لاحتواء البيانات في نطاق خطي من منحنى المعايرة، من الضروري تخفيف العينة بنحو 100 ضعف. في هذه الحالة، تمييع جزء من العينة مع 0.1٪ (v/v) FA في الماء وتحليل بالإضافة إلى العينة غير مخففة. وينبغي إعداد العينات المرجعية للمعايير لمنحنى المعايرة في 100 مرة مخففة ثقافة كاملة المتوسطة. بدلاً من ذلك، أضف المزيد من النقاط في منحنى المعايرة (إذا تحققت الذوبانية الخطية المناسبة) لضبطه إلى مستوى تركيز كين في العينة التجريبية.
  5. تحليل العينات بواسطة LC-MS كما هو موضح في القسم 5. إنشاء قائمة عمل وتشغيل كل عينة في ثلاثية.
  6. بعد اكتمال قائمة العمل، قم بقياس منطقة الذروة في التحليل.
  7. إنشاء جدول بيانات باستخدام البرامج المتوفرة والحصول على البيانات الرقمية.
  8. في عمود جدول واحد حساب نسبة منطقة الذروة التحليل على منطقة الذروة 3NT.
  9. استخدم معادلة معايرة خطية فردية مخصصة لكل تحليل (من الخطوة 6.3.) لحساب تركيزات التحليلات الموجودة في العينات التجريبية.

9. تقييم محتوى البروتين وتطبيع البيانات

  1. Resuspend بيليه الخلوية من الخطوة 7.5 مع 100 ميكرولتر من الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) في أنبوب 1.5 مل.
    ملاحظة: إعداد برنامج تلفزيوني حل عن طريق حل 8 غرام من كلوريد الصوديوم، 0.2 غرام من كلوريد البوتاسيوم، 1.44 غرام من فوسفات الصوديوم ديباسيتش، فوسفات ديهيدروجين البوتاسيوم في 950 مل من الماء فائقة السخ. يُحرّك جيداً. ضبط الأسى إلى 7.4 مع حمض الهيدروكلوريك (قطرة). ضبط مستوى الصوت حتى 1 لتر مع الماء فائق الخطورة. يُحرّك جيداً حتى يصبح متجانساً.
    تنبيه: حمض الهيدروكلوريك شديد التآكل ويجب التعامل معه باحتياطات السلامة المناسبة. يمكن أن يسبب ملامسة الجلد البشري احمرارًا وألمًا وحروقًا جلدية. العمل تحت غطاء الدخان؛ ارتداء قفازات واقية ومعطف.
  2. تجميد العينات في -20 درجة مئوية ثم تذويب الجليد على الجليد. كرر هذه الخطوة 3x.
  3. أجهزة الطرد المركزي العينات في 14، 000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية. جمع اغطار في أنابيب جديدة. لا تزعج بيليه.
  4. تمييع 10x مع PBS.
  5. بناء منحنى المعايرة من 0 إلى 2 ميكروغرام من البروتين في نطاق جيد.
    1. إعداد البلومين المصل البقري (BSA) حل قياسي للمعايرة. يُحلّل 1.23 ميكروغرام من BSA في 1 مل من الماء فائق الخطورة وبهم دوامة.
    2. على لوحة 96-جيدا، تحميل كميات مختلفة من الحل القياسي BSA (1.23 ميكروغرام / مل): 0 ميكرولتر، 2 ميكرولتر، 4 ميكرولتر، 5 ميكرولتر، 7 ميكرولتر، 10 ميكرولتر، 15 ميكرولتر، 20 ميكرولتر.
    3. ملء البئر مع برنامج تلفزيوني إلى حجم النهائي من 50 μL.
  6. تحميل 10 - 15 μL خلية lysate من الخطوة 9.4 على نفس لوحة 96-well. ملء الآبار مع برنامج تلفزيوني للوصول إلى حجم النهائي من 50 ميكرولتر.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، ضبط حجم aliquot الخلية في كل بئر لتناسب في المدى الخطي لمنحنى المعايرة. الحفاظ على حجم النهائي إلى 50 ميكرولتر من العينة في بئر.
  7. أضف 200 ميكرولتر من كاشف برادفورد (مخفف 5 مرات مع الماء فائق الخطورة) إلى كل بئر.
  8. احتضان بات 96-جيدا لمدة 5 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة. أدخل اللوحة في قارئ microplate. قياس امتصاص في λ = 595 نانومتر.
  9. إنشاء منحنى معايرة باستخدام برنامج جدول بيانات. رسم مقدار BSA (μg) مقابل الامتصاص. إضافة خط اتجاه خطي، وعرض معادلة منحنى المعايرة ومعامل الانحدار على التخطيط.
  10. استخدم المعادلة الخطية (y = ax +b، حيث y يتوافق مع الامتصاص في λ = 595 نانومتر، و a هو الميل، و x هو محتوى البروتين (μg)، و b يشير إلى اعتراض المنحنى) لحساب كمية البروتين في العينة.
    ملاحظة: خذ بعين الاعتبار عامل تخفيف العينة في الحسابات.
  11. استخدام محتوى البروتين المقدر لتطبيع كمية الكينيرينين في العينة لكل 1 ملغ من البروتين. للقيام بذلك، قم بتقسيم تركيز الكينيرينين المحدد في الخطوة 8.9 مع محتوى البروتين الكلي من الخطوة 9.10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

LC-MS يقدم مزايا لا جدال فيها في القياس الكمي للجزيئات النشطة بيولوجيا، على الرغم من أن بعض مكونات العينات المعقدة تسبب ما يسمى آثار المصفوفة وتئينات حل وسط من التحليلات. وهو يؤدي إلى قمع الأيونات أو تعزيز أيون، وتناقص دقة بقوة، وتؤثر على حد من الكشف /الكم من LC-MS، والتي تعتبر نقطة ''ضعيفة' من ا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هذه الورقة يعرض بروتوكول مفصل LC-SQ للقياس الكمي المتزامن من أربعة الأيض Trp الرئيسية (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) التي تقاس في وسط من الخلايا السرطانية البشرية في المختبر. ويولى اهتمام خاص لإعداد العينات، وإجراء قياس الطيف الكروماتوغرافي/الكتلة، وتفسير البيانات، وأهم النقاط في التحليل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل الاتحاد الأوروبي من صندوق التنمية الإقليمية الأوروبية في إطار تطوير البرنامج التنفيذي لبولندا الشرقية 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00)، من قبل كلية التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيئية التابعة لجامعة جون بول الثانية الكاثوليكية في لوبلين (منحة العلماء الشباب لمنظمة إيلونا سادوك)، المركز البولندي الوطني للعلوم، OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 لماغدالينا ستانيسزسكا، المحقق الرئيسي).  يشكر المؤلفون البروفيسور Agnieszka Ścibior من مختبر الأكسدة ، ومركز البحوث متعددة التخصصات ، JPII CUL لتقاسم المعدات لاستزراع الخلايا والتكميم البروتيني.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3-hydroksy-DL-kynureninaSigma-AldrichH1771
3-hydroxyanthranilic acidSigma-Aldrich14877697%
3-nitro-L-tyrosineSigma-AldrichN7389
AcetonitrileSupelco1.00029hypergrade for LC-MS LiChrosolv
Activated charcoalSupelco05105powder
Analytical balanceOhaus
Analytical columnAgilent Technologies959764-902Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µm)
Ammonium formateSupelco7022eluent additive for LC-MS, LiChropur, ≥99.0%
Bovine Serum AlbuminSigma1001887398
Caps for chromatographic vialsAgilent Technologies5185-5820blue screw caps,PTFE/red sil sepa
Cell culture dishNest704004polystyrene, non-pyrogenic, sterile
Cell culture plateBiologix07-601212-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille
Cell incubatorThermo Fisher ScientificHERAcell 150i Cu
CentrifugeEppendorfmodel 5415R
CentrifugeEppendorfmodel 5428
Centrifuge tubesBionovoB-2278Eppendorf type, 1.5 mL
Centrifuge tubesBionovoB-3693Falcon type, 50 mL, PP
Chromatographic data acqusition and analysis softwareAgilent TechnologiesLC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)
Chromatographic insert vialsAgilent Technologies9301-1387100 µL
Chromatographic vialsAgilent Technologies5182-07142 mL, clear glass
Dimethyl sulfoxideSupelco1.02950Uvasol
Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)PAN BiotechP04-41450
Dual meter pH/conductivityMettler ToledoSevenMulti
EvaporatorGenevacmodel EZ-2.3 Elite
Fetal bovine serumSigma-AldrichF9665
Formic acidSupelco5.33002for LC-MS LiChropur
Glass bottle for reagents storageBionovoS-207050 mL, clear glass
Guard columnAgilent Technologies959757-902Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 µm)
Hydrochloric acidMerck1.00317.1000
L-kynurenineSigma-AldrichK8625≥98% (HPLC)
Magnetic stirrerWigoES 21 H
MicrobalanceMettler Toledomodel XP6
Milli-Q systemMilliporeZRQSVPO30Direct-Q 3 UV with Pump
Quadrupole mass spectrometerAgilent TechnologiesG1948Bmodel 6120
Penicillin-StreptomycinSigma-Adrich048M4874V
Plate readerBio TekSynergy 2 operated by Gen5
Potassium chlorideMerck1.04936.1000
Potassium dihydrogen phosphateMerck1.05108.0500
Protein Assay Dye Reagent ConcentrateBioRad500-0006
See-saw rockerStuartSSL4
Serological pipetteNest3260015 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile
Sodium chlorideSigma-Aldrich7647-14-5
Sodium phosphate dibasicMerck1.06346.1000
Solvent inlet filterAgilent Technologies5041-2168glass filter, 20 μm pore size
Solvent reservoir (for LC-MS)Agilent Technologies9301-65241 L, clear glass
Solvent reservoir (for LC-MS)Agilent Technologies9301-65261 L, amber glass
Spreadsheet programMicrosoft OfficeMicrosoft Office Excel
Stir barBionovo6-2003teflon coated
Syringe filters for culture medium filtrationBionovo7-8803regenerated cellulose, Ø 30 mm, 0,45 µm
Syringe filters for mobile phase components filtrationBionovo6-0018nylon, Ø 30 mm, 0,22 µm
Tissue culture platesVWR10062-90096-wells, sterille
Trypsin-EDTA SolutionSigma-AldrihT4049-100 mL
Ultra-High Performance Liquid Chromatography systemAgilent TechnologiesG1367D, G1379B, G1312B, G1316C1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C)
Ultrasound bathPolsonic104533model 6D
VortexBiosanmodel V-1 plus
Xanthurenic acidSigma-AldrichD12080496%

References

  1. Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment. International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).
  2. Heng, B., et al. Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immunobiology. Oncotarget. 7 (6), 6506-6520 (2015).
  3. Badawy, A. A. B. Kynurenine pathway and human systems. Experimental Gerontology. 129, (2020).
  4. Chen, Y., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites in humans: Disease and healthy states. International Journal of Tryptophan Research. 2 (1), 1-19 (2009).
  5. Sathyasaikumar, K. V., et al. Xanthurenic Acid Formation from 3-Hydroxykynurenine in the Mammalian Brain: Neurochemical Characterization and Physiological Effects. Neuroscience. 367, 85-97 (2017).
  6. Malina, H., Richter, C., Frueh, B., Hess, O. M. Lens epithelial cell apoptosis and intracellular Ca2+ increasein the presence of xanthurenic acid. BMC Ophthalmology. 2, 1-7 (2002).
  7. Colín-González, A. L., Maldonado, P. D., Santamaría, A. 3-Hydroxykynurenine: an intriguing molecule exerting dual actions in the central nervous system. Neurotoxicology. 34, 189-204 (2013).
  8. Xue, P., Fu, J., Zhou, Y. The aryl hydrocarbon receptor and tumor immunity. Frontiers in Immunology. 9 (286), 00286(2018).
  9. Tan, V. X., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites as biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis. Frontiers in Microbiology. 13 (1013), 1-11 (2019).
  10. Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Research. 14 (40), 2377-2384 (2015).
  11. Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity. Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).
  12. Park, A., et al. Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways. Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).
  13. Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M. Chromatographic analysis of tryptophan metabolites. Journal of Separation Science. 40 (15), 3020-3045 (2017).
  14. Fuertig, R., et al. LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain. Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).
  15. Marcos, J., et al. Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).
  16. Möller, M., Du Preez, J., Harvey, B. Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).
  17. Lesniak, W. G., et al. Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites. Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).
  18. Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection. International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).
  19. Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection. Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).
  20. Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum. Journal of Biological Methods. 4 (3), 75(2017).
  21. Arnhard, K., et al. A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma. Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).
  22. Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).
  23. Huang, Y., et al. A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients. Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).
  24. Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).
  25. Zhu, W., et al. Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).
  26. Hashioka, S., et al. Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes. Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).
  27. Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).
  28. Annesley, T. M. Ion suppression in mass spectrometry. Clinical Chemistry. 49 (7), 1041-1044 (2003).
  29. Houée-Lévin, C., et al. Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences. Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).
  30. Wei, H., et al. Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage. Reproductive Sciences. , e1933719119833788 (2019).
  31. Liu, P., et al. Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes. BMC Cancer. 9, 416(2009).
  32. Mailankot, M., et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159 3 3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved