从癌细胞培养物中收集的介质光谱分析的选定金核素的同步量化

摘要

这里描述的是一个协议，用于确定从液体色谱分析的癌细胞培养物中收集的介质中产生的四种不同的色氨酸代谢物（金黄素、3-羟基核素、Xanthurenic酸、3-羟基苯甲酸）。

摘要

基努雷宁通路和色氨酸卡塔博利特称为基努雷宁已经受到越来越多的关注，因为他们参与免疫调节和癌症生物学。 体外 细胞培养分析通常用于了解不同色氨酸卡托邦细胞在疾病机制中的贡献以及用于测试治疗策略。富含分泌代谢物和信号分子的细胞培养介质反映了色氨酸代谢和其他细胞事件的状态。需要在复杂的细胞培养介质中可靠量化多种基努他宁的新协议，以便对多个样本进行可靠和快速的分析。这可以通过液体色谱与质谱学相结合来完成。这种强大的技术用于许多临床和研究实验室的代谢物的定量，可用于测量基努他宁。

这里介绍的是使用液相色谱与单四足质谱（LC-SQ）同时确定四个基努他宁，即基努雷宁，3-羟基核素，3-羟基苯甲酸，和从 体外 培养癌细胞中收集的介质中的黄曲霉素酸。SQ探测器使用简单，与其他质谱仪相比更便宜。在 SQ-MS 分析中，根据样品的特定质量与电荷比（m/z）生成并分离多个离子，然后使用单离子监控 （SIM） 模式进行检测。

本文注重报告方法的优点，指出了一些薄弱环节。它侧重于LC-SQ分析的关键要素，包括样品准备以及色谱和质谱分析。还讨论了质量控制、方法校准条件和矩阵效应等问题。我们描述了一个简单的应用3硝基酪氨酸作为一个模拟标准的所有目标分析。经人类卵巢癌和乳腺癌细胞实验证实，建议的LC-SQ方法产生可靠的结果，并可进一步应用于其他 体外 细胞模型。

引言

基努琳通路 （KP） 是人类细胞中色氨酸 （Trp） 催化的主要途径。在肝外细胞中，印度胺-2，3-二氧酶（IDO-1）是第一种限制KP酶，并将Trp转化为N-形成基核素^1。KP 内的进一步步骤会生成其他次要代谢物，即具有各种生物特性的基努他宁。Kynurenine （Kyn） 是第一个稳定的 Trp 催化物， 显示有毒性质和调节细胞事件后， 结合到阿丽尔碳氢化合物受体 （AhR）².随后，Kyn被自发地或在酶介质过程中转化为几个分子，产生诸如3-羟基核素（3HKyn）、炭酸（AA）、3-羟基苯甲酸（3-HAA）、基努雷尼酸（Kyna）和Xanthurenic酸（XA）等代谢物。另一种下游代谢物，2-氨基-3-卡博基霉素酸-6-半醛（ACMS），经历非酶循环奎诺利尼酸（QA）或野餐酸^（PA）1.最后，QA被进一步转化为烟酰胺-腺苷二核苷酸（NAD^+）3，KP端点代谢物，是一个重要的酶共同因子。一些基努肾上腺素具有神经保护特性，如Kyna和PA，而其他，即3HAA和3HKyn，是有毒^的4。由3HKyn形成的Xanthurenic酸具有抗氧化和血管电离特性^5。XA在老化的镜片中积累，导致上皮细胞⁶的凋亡。KP在20^世纪中叶被描述，当它参与各种疾病被证明时，它得到了更多的关注。这种代谢途径的增加和一些kynurenine的积累调节免疫反应，并与不同的病理条件，如抑郁症，精神分裂症，脑病，艾滋病毒，痴呆症，肌萎缩性侧索硬化症，疟疾，阿尔茨海默氏症，亨廷顿舞蹈症和癌症^4，7。在肿瘤微环境和癌细胞^2，8中观察到Trp新陈代谢^的一些变化。此外，基努雷宁被认为是有希望的疾病标记^9。在癌症研究中，体外细胞培养模型已建立并广泛应用于抗癌药物¹⁰的药前评价。Trp代谢物由细胞分泌到培养基中，可以测量以评估基努艾琳通路的状态。因此，需要开发适当的方法，以简单、灵活和可靠的协议，在各种生物标本中同时检测尽可能多的KP代谢物。

在本文中，我们描述了一个协议，用于同时确定四个基努艾琳通路代谢物:Kyn、3HKyn、3HAA和XA，由LC-SQ在从癌细胞中收集的培养基中。在现代分析方法中，液相色谱13、14、15、16优先于同时检测和量化单个色氨酸催化物，而使用Erlich试剂^11、12进行生化非特异性检测。目前，人类标本中有许多用于基努他宁测定的方法，主要基于带有紫外线或荧光检测仪^{13、17、18、19}的液相色谱。液相色谱与质谱探测器 （LC-MS） 似乎更适合此类分析，因为其灵敏度较高（检测范围较低）、选择性和可重复性。

Trp代谢物已经确定在人类血清，血浆和尿液13，20，21，22，23，但是，其他生物标本的方法，如细胞培养介质也是需要的。此前，LC-MS用于培养人类胶质瘤细胞、单核细胞、支气管细胞或用干扰素伽马（IFN-γ）治疗的星形细胞（IFN-γ）24、25、26后收集的介质中的Trp衍生化合物。目前，需要新的验证协议，可以评估不同培养基、细胞和癌症模型中使用的治疗方法中的几个代谢物。

开发方法的目的是量化（在一次分析运行内）四个主要的基努雷宁，可以指示KP的异常。这里介绍的是我们最近出版的协议的关键步骤，定量LC-SQ分析选定的有意义的基努雷宁使用一个内部标准（3-硝基罗辛，3NT）在从 体外 培养的人类癌细胞²⁷收集的介质。据我们所知，这是第一个LC-SQ协议，用于在从 体外 生长细胞获得的培养基中同时量化3HKyn、3HAA、Kyn和XA。经过一些修改后，该方法可以进一步应用于研究Trp代谢在更广泛的细胞培养模型中的变化。

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研究方案

1. 准备标准 3NT、Kyn、3HKyn、3HAA、XA 标准库存解决方案

1. 以最高精度（每瓶0.3毫克）在小瓶中称量试剂。为了提高准确性，请放大试剂，根据步骤 1.2 调整溶剂的体积。
2. 溶解溶剂在溶剂的300μL，以获得1克/升的库存溶液。溶解3NT在1%（v/v）的微酸（FA）在水中;金，3HAA和XA在二甲基硫化物（DMSO）;3HKyn 在水中酸化到 pH 2.5 与盐酸 （HCL）.
   警告:3HAA刺激眼睛、鼻子、喉咙和肺部。吸入、接触皮肤和吞咽时有害。佩戴适当的防护服，即手套和面罩。
3. 紧闭小瓶，放在超声波浴缸中1分钟，以加速溶解。
   注意:将库存解决方案存储在 -20 °C，并最大限度地减少由于库存解决方案不稳定造成的冻结/解冻（最大 3 个周期）。

2. 木炭处理文化媒介的制备

1. 在一根管子中，重280毫克的活性炭，并加入5 mL的液体介质，准备培养感兴趣的细胞。
2. 在室温下（将速度设置为 50 振荡/分钟），用锯锯摇杆上的介质和木炭摇动管 2 小时。接下来，将管子在 6000 x g 下离心 15 分钟。
3. 从离心机中取出管子，小心收集超纳坦，而不会干扰沉积物。如有必要，重复离心，以去除所有木炭残留物。
4. 使用 0.45 μm 注射器过滤器过滤超强剂。
5. 通过在LC-MS上运行第 6.3.2 步中描述的试点样本，确保木炭预处理培养基被剥夺了 kynurenine 痕迹。否则，重复步骤 2.1-2.4。
   注:如果完整的培养基最初不含基努他宁，则可能会省略使用木炭的净化步骤。在这种情况下，使用通常用于细胞培养的完整介质准备校准标准和质量控制样品。
6. 将准备好的介质存储在4°C，直到分析。

3. 制作校准解决方案和校准曲线

1. 用 0.75 μL 的 0.1 g/L 3NT 溶液喷涂木炭预处理培养基，并添加四个标准（3HKyn、3HAA、Kyn、XA）至少六种不同浓度，以覆盖校准范围。将每个样品的最终体积保持在 150μL. 漩涡良好。使用 1.5 mL 离心管进行样品准备。
   注:3HKyn建议校准点:0.018、0.045、0.22、1.12、2.23、4.46 μmol/L:Kyn: 0.0096， 0.048， 0.24， 1.20， 2.40， 3.84 μmol/L;3HAA: 0.033， 0.16， 0.65， 3.27， 6.53， 13.06 μmol/L;XA: 0.019， 0.13， 0.49， 1.22， 3.65， 4.87 μmol/L.
2. 在每个管子中加入 150 μL 的冷甲醇（保持在 -20 °C），其中含有 1% （v/v） 的甲醇，用于样品脱蛋白。紧紧地关闭管子和漩涡。
3. 在-20°C下孵化样品40分钟。
4. 在 4 °C 下将样品在 14，000 x g 下离心 15 分钟。 从离心机中取出管子。将超纳丁收集到新管中。请勿干扰沉积物。
5. 使用自动移液器将 270μL 的超级麻醉剂转移到玻璃瓶中。将小瓶放入蒸发器中，轻轻蒸发，直到干燥。使用适当的程序对水/甲醇分数蒸发挥发性成分。不要应用温度高于40°C，避免过度干燥。
   注:平底玻璃瓶，即色谱瓶，与塑料圆锥管相比，可促进更快的蒸发和更高的回收。
6. 30分钟后，检查蒸发状态。如有必要，继续蒸发（例如，额外增加10分钟）。避免过度干燥。
7. 从蒸发器中取出小瓶。将每个样品在 60 μL 中重新构合 0.1% （v/v） 水中的微酸。将溶剂加入含有残留物质的瓶中。紧紧关闭小瓶和漩涡井。
8. 将样品转移到 1.5 mL 管中，在 14，000 x g 下旋转 15 分钟，在 4 °C 下分离沉淀的蛋白质。
9. 在不干扰蛋白质颗粒的情况下，使用带自动移液器的锥形玻璃插入将超级纳坦转移到色谱小瓶中。紧紧关闭小瓶。
10. 检查插入瓶中是否存在气泡，如有必要，将其取出（例如，通过涡旋）。
11. 将含有样品的色谱小瓶转移到LC自动取样器中。记录放置在自动取样器托盘中的样品的位置。

4. 编制质量控制 （QC） 样品

1. 用0.75微升的0.1克/升3NT溶液和四种基努他宁（3HKyn、3HAA、Kyn、XA）的标准，在从校准曲线的线性范围内选择的浓度中，将木炭预处理培养基（在1.5毫升离心管中制备）尖峰。将样品的最终体积保持在 150 μL。
   注:如果适用，请准备几个不同浓度的QC样品，这些样品属于校准曲线的线性范围。
2. 遵循第 3 节中描述的协议（步骤 3.2-3.11）。

5. 建立LC-MS系统

1. 准备移动相溶剂:溶剂A:超纯水中的20毫升/升铵（pH 4.3经氨酸调节）:溶剂 B: 100% 丙酮三星。
   注意:仅使用波罗西酸玻璃瓶。在重新灌装之前用超纯水冲洗瓶子。不要使用用洗涤剂清洗的瓶子。
   警告:丙酮三星会导致严重的健康影响或死亡。它很容易被热点燃。丙酮液体和蒸汽会刺激眼睛、鼻子、喉咙和肺部。
   1. 将晶体试剂（15.77克）溶解在玻璃瓶中的50毫升超纯净水中，准备5摩尔/L铵汤溶液。搅拌，直到所有残留物溶解。过滤 0.45 μm 膜以清除任何残留碎片（例如，使用尼龙注射器过滤器）。将库存解决方案存储在4°C。
   2. 准备溶剂A通过添加4毫升5摩尔/升铵在水中到980毫升的超纯水在琥珀色玻璃瓶和搅拌井。浸入搅拌棒，将带溶剂的瓶子放在磁性搅拌器上。将 pH 电极浸入溶液中，并在搅拌下控制 pH。添加氨酸库存溶液 （98%-100%）使用带 0.2 mL 尖端的自动移液器获得 pH 4.3，用超纯水将音量调整至 1 L，搅拌良好。
      注意:每周至少准备一次溶剂以防止任何微生物生长。
      警告:福密酸 （FA） 吸入时有毒，导致皮肤灼伤和眼睛损伤。在烟雾罩下工作;戴防护手套和外套。
   3. 通过 0.22 μm 膜（例如尼龙注射器过滤器）过滤所有溶液，以清除任何残留碎片。可选地，使用专用于LC溶剂储层的溶剂进气口过滤器，以保护系统免受传入颗粒的射入。
2. 启动LC-MS控制和数据采集软件。
3. 使用移动相清除LC系统以去除气泡，并使所有溶剂通道都处于最佳状态。
4. 组合一个守卫柱，以保护分析列免受堵塞。
5. 用 100% 丙酮三星冲洗护栏和分析柱（C18、2.1 x 100 mm、1.8 μm）约 30 分钟，然后用 100% 溶剂 A 冲洗，直到观察到柱子中的稳定压力。使用控制软件控制系统性能。
6. 在数据采集软件中设置相应的LC参数。
   1. 设置梯度方案:0-8分钟溶剂B 0%:8-17 分钟溶剂 B 0-2%:17-20分钟溶剂B 2%:20-32 分钟溶剂 B 10-30%:32-45 分钟溶剂 B 0%。
   2. 将移动相流速设置为 0.15 mL/min，总分析运行时间为 45 分钟，柱温为 +40 °C，喷射体积为 10μL。
7. 设置质谱探测器的采集参数。
   1. 应用电化参数:单离子监测（SIM）、正电化、雾化压力50 psi、+350°C干燥气体温度、12升/分钟的干燥气体流量和5500 V毛细管电压。
   2. 选择分析监测离子:3HKyn m/z 225.0（扫描周期:2-6分钟，碎块电压:100 V）:用于 Kyn m/z 209.0（扫描周期:6-12 分钟，碎块电压:80 V）:3HAA m/z 154.0（扫描周期:12-18 分钟，碎块电压:80 V）:3NT m/z 227.0（扫描周期:18-23分钟，碎块电压:100 V）:XA m/z 206.0（扫描周期:23-45分钟，碎块电压:100 V）。
8. 构建工作列表并在LC系统上运行示例。
9. 首先，在分析实验样品之前，至少在三个样本中运行一个空白样本（溶剂A），然后是一个QC样本。
10. 打开数据分析软件并加载为 QC 样本获得的结果。
11. 检查色谱上分析峰的位置。当信号移到预期位置之外时，请调整时间门以进行适当的分析信号收集。有关信号集成的说明，请参阅软件手册。

6. 构建校准曲线

1. 在数据采集软件中，将校准标准添加到工作列表中，并在三次运行标准。
2. 分别在约4.4分钟、10分钟、16分钟、21分钟和30分钟的保留时间内，对应3HKyn、Kyn、3HA、3NT和XA的峰值区域进行集成和测量。
3. 使用电子表格程序为每个代谢物构建单个校准曲线。
   1. 要创建校准图，则绘制 3NT 峰值区域中分析峰值区域与分析物浓度的比率值。
   2. 分析空白样本（仅用3NT喷射的炭预处理培养基），确保介质中没有研究分析物的痕迹。否则，从每个校准点减去所获得的价值。
   3. 检查每个校准曲线的线性。
      1. 单独地，对于每个分析器，创建一个斜面拦截线性方程（y = ax +b），其中 y 对应分析峰值区域与 3NT 峰值区域的比例，a是斜率，x是分析浓度（μmol/L），b 表示曲线拦截。绘制图形"y"与"x"将生成校准曲线。
      2. 在图表中添加线性趋势线，在图表上显示校准曲线方程和回归系数。确保回归系数为+0.990。如果校准标准不匹配，再次准备和/或分析这些标准。可选地更改校准曲线的浓度范围。
   4. 在分析实验样品之前，先分析 QC 样本以检查系统性能。如果不兼容（±参考值偏离 20%），则准备新的校准曲线。

7. 体外细胞培养和样本收集，供分析

1. 板研究的癌细胞（MDA-MB-231或SK-OV-3）在DMEM（杜尔贝科的改良鹰的介质）含有4.5克/升的ᴅ葡萄糖， 10% （v/v） 胎儿牛血清 （FBS）， 2 mmol/L ʟ-谷氨酰胺和 1 U 青霉素/链霉素和培养在 37 °C 在 5% CO₂ 的加湿大气中， 以扩大他们为实验.以 80% 的汇合率通过细胞。
2. 使用trypsin将细胞从培养皿中分离出，在12口井板上进行实验的种子，密度为每口井0.3×10⁶ 个细胞，并放置在孵化器中过夜。
3. 第二天，吸气培养基，并添加新鲜的DMEM，无论是否添加研究的化合物，这取决于实验设计。
4. 48小时后，从细胞上方（约500μL）收集介质到1.5 mL管中。离心机在14，000 x g 5分钟，以消除任何细胞碎片。收集超纳坦并储存在-80°C，直到分析。
5. 将细胞颗粒从步骤 7.4 中保存以进行蛋白质估计。将样品冻结在-20°C。
   注:从不同油井获得的介质结果应标准化为总蛋白质含量，以考虑单个油井中细胞数的变异性。蛋白质浓度可以按照第 9 步进行评估。

8. 为LC-MS分析准备样品

1. 在室温下解冻冷冻样品，混合均好。将培养基的149.25μL转移到离心管（1.5 mL）中。
2. 添加 3NT 解决方案 0.1 克/升的 0.75 微升（内部标准）。关闭管子和漩涡很好。
3. 添加 150 μL 的冰镇在 -20 °C 甲醇含有 1% （v/v） FA 样品去蛋白化。关闭管子和漩涡很好。
4. 继续第 3 节（步骤 3.3-3.11）中描述的样品准备。
   注:一些癌细胞，如SK-OV-3，将大量的Kyn分泌到培养基中。要将数据放入校准曲线的线性范围内，需要对样品进行大约 100 倍的稀释。在这种情况下，在水中用 0.1% （v/v） FA 稀释部分样品，并分析未稀释的样品。校准曲线标准的参考样本应在100倍稀释的完整培养介质中编写。或者，在校准曲线中添加更多点（如果达到适当的溶解度和线性），使其调整到实验样本中 Kyn 的浓度水平。
5. 分析第 5 节中描述的 LC-MS 样本。构建一个工作列表，并将每个样本运行三次。
6. 工作表完成后，测量分析的峰值区域。
7. 使用可用的软件生成电子表格和获取的数字数据。
8. 在一个电子表格列中计算 3NT 峰值区域上的分析峰值区域比率。
9. 使用专用于每个分析量（从步骤 6.3.）的单个线性校准方程来计算实验样本中存在的分析物浓度。

9. 评估蛋白质含量和数据正常化

1. 将细胞颗粒从步骤 7.5 中重新悬生，在 1.5 mL 管中使用 100μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。
   注:在950mL超纯水中溶解8克氯化钠、0.2克氯化钾、1.44克磷酸二酸钠、磷酸二氢钾，准备PBS溶液。搅拌好。用盐酸（滴式）将pH调整为7.4。用超纯水调整体积高达 1 L。搅拌好，直到均匀。
   注意:盐酸具有高度腐蚀性，必须采取适当的安全防范措施。与人的皮肤接触可导致发红、疼痛、皮肤灼伤。在烟雾罩下工作;戴防护手套和外套。
2. 将样品冷冻在-20°C，然后在冰上解冻。重复此步骤3倍。
3. 在 4 °C 下将样品在 14，000 x g 下离心 15 分钟。 将超纳托收集到新管中。不要打扰颗粒。
4. 用PBS稀释超常剂10倍。
5. 构造一个校准曲线，每个井范围的蛋白质为 0 到 2 μg。
   1. 准备牛血清白蛋白 （BSA） 标准溶液进行校准。溶解 1.23 μg 的 BSA 在 1 mL 的超纯水和涡井。
   2. 在 96 井板上，装载不同数量的 BSA 标准解决方案（1.23 μg/mL）:0 μL、2 μL、4 μL、5 μL、7 μL、10 μL、15 μL、20 μL。
   3. 用 PBS 填充油井，最终体积为 50 μL。
6. 加载 10 - 15 μL 细胞从步骤 9.4 在同一 96 井板上解压。用 PBS 填充油井，达到 50 μL 的最终体积。
   注:如有必要，请调整每口井中细胞解液的量，以适应校准曲线的线性范围。将每个油井的样本最终体积保持在 50μL。
7. 在每个井中加入 200μL 的布拉德福德试剂（用超纯水稀释 5 次）。
8. 在室温下将96口井的馅饼孵育至少5分钟。将板插入微板读取器。测量λ=595nm的吸收量。
9. 使用电子表格程序构建校准曲线。绘制 BSA 量 （μg） 与吸收量。添加线性趋势线，在图表上显示校准曲线方程和回归系数。
10. 使用线性方程（y = ax +b，其中y对应于λ = 595 nm 的吸收，a是斜率，x是蛋白质含量（μg），b 指曲线截获）来计算样品中的蛋白质量。
    注:在计算中考虑样品稀释因子。
11. 使用估计的蛋白质含量来使每1毫克蛋白质样本中的基努他宁量正常化。为此，将第 8.9 步确定的 kynurenine 浓度与第 9.10 步的总蛋白质含量分开。

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结果

LC-MS在生物活性分子的量化方面具有无可争辩的优势，尽管复杂标本的某些成分会导致所谓的基质效应，并损害分析物的电位化。它导致离子抑制或离子增强，严重降低精度，并影响LC-MS的检测/量化极限，这被认为是该方法的"弱"点。在我们的协议中，离子是由正模式下的电喷雾电离子化（ESI）产生的，这也用于Trp代谢物测定¹³的其他研究。然而，与大气压力化学电化

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讨论

本文提出了一个详细的LC-SQ协议，用于同时量化四个主要的Trp代谢物（3HKyn，Kyn，3HAA，XA），这些代谢物是用 体外 培养的人类癌细胞的介质测量的。特别注意样品的准备、色谱/质谱过程和数据解释，这是分析中最重要的一点。

一般来说，LC-MS 分析由于灵敏度高，需要对二手材料的严格性和纯度进行最高标准的协议。它是指在整个标准程序中应用整齐清洁和正确洗涤的?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-hydroksy-DL-kynurenina	Sigma-Aldrich	H1771
3-hydroxyanthranilic acid	Sigma-Aldrich	148776	97%
3-nitro-L-tyrosine	Sigma-Aldrich	N7389
Acetonitrile	Supelco	1.00029	hypergrade for LC-MS LiChrosolv
Activated charcoal	Supelco	05105	powder
Analytical balance	Ohaus
Analytical column	Agilent Technologies	959764-902	Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µm)
Ammonium formate	Supelco	7022	eluent additive for LC-MS, LiChropur, ≥99.0%
Bovine Serum Albumin	Sigma	1001887398
Caps for chromatographic vials	Agilent Technologies	5185-5820	blue screw caps,PTFE/red sil sepa
Cell culture dish	Nest	704004	polystyrene, non-pyrogenic, sterile
Cell culture plate	Biologix	07-6012	12-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille
Cell incubator	Thermo Fisher Scientific		HERAcell 150i Cu
Centrifuge	Eppendorf		model 5415R
Centrifuge	Eppendorf		model 5428
Centrifuge tubes	Bionovo	B-2278	Eppendorf type, 1.5 mL
Centrifuge tubes	Bionovo	B-3693	Falcon type, 50 mL, PP
Chromatographic data acqusition and analysis software	Agilent Technologies		LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)
Chromatographic insert vials	Agilent Technologies	9301-1387	100 µL
Chromatographic vials	Agilent Technologies	5182-0714	2 mL, clear glass
Dimethyl sulfoxide	Supelco	1.02950	Uvasol
Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	PAN Biotech	P04-41450
Dual meter pH/conductivity	Mettler Toledo		SevenMulti
Evaporator	Genevac		model EZ-2.3 Elite
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F9665
Formic acid	Supelco	5.33002	for LC-MS LiChropur
Glass bottle for reagents storage	Bionovo	S-2070	50 mL, clear glass
Guard column	Agilent Technologies	959757-902	Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 µm)
Hydrochloric acid	Merck	1.00317.1000
L-kynurenine	Sigma-Aldrich	K8625	≥98% (HPLC)
Magnetic stirrer	Wigo		ES 21 H
Microbalance	Mettler Toledo		model XP6
Milli-Q system	Millipore	ZRQSVPO30	Direct-Q 3 UV with Pump
Quadrupole mass spectrometer	Agilent Technologies	G1948B	model 6120
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Adrich	048M4874V
Plate reader	Bio Tek		Synergy 2 operated by Gen5
Potassium chloride	Merck	1.04936.1000
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	1.05108.0500
Protein Assay Dye Reagent Concentrate	BioRad	500-0006
See-saw rocker	Stuart	SSL4
Serological pipette	Nest	326001	5 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Sodium phosphate dibasic	Merck	1.06346.1000
Solvent inlet filter	Agilent Technologies	5041-2168	glass filter, 20 μm pore size
Solvent reservoir (for LC-MS)	Agilent Technologies	9301-6524	1 L, clear glass
Solvent reservoir (for LC-MS)	Agilent Technologies	9301-6526	1 L, amber glass
Spreadsheet program	Microsoft Office		Microsoft Office Excel
Stir bar	Bionovo	6-2003	teflon coated
Syringe filters for culture medium filtration	Bionovo	7-8803	regenerated cellulose, Ø 30 mm, 0,45 µm
Syringe filters for mobile phase components filtration	Bionovo	6-0018	nylon, Ø 30 mm, 0,22 µm
Tissue culture plates	VWR	10062-900	96-wells, sterille
Trypsin-EDTA Solution	Sigma-Aldrih	T4049-100 mL
Ultra-High Performance Liquid Chromatography system	Agilent Technologies	G1367D, G1379B, G1312B, G1316C	1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C)
Ultrasound bath	Polsonic	104533	model 6D
Vortex	Biosan		model V-1 plus
Xanthurenic acid	Sigma-Aldrich	D120804	96%