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Resumo

Descrito aqui é um protocolo para a determinação de quatro metabólitos triptofanos diferentes gerados na via kynurenine (kynurenine, 3-hidroxikynurenine, ácido xanthurenic, ácido 3-hidroxyanthranilic) no meio coletado de culturas de células cancerosas analisadas por cromatografia líquida acoplada com uma única espectrometria de massa quadrupole.

Resumo

O caminho da kynurenine e os catabólitos do triptofano chamados kynurenines têm recebido maior atenção por seu envolvimento na regulação imunológica e biologia do câncer. Um ensaio de cultura in vitro é frequentemente usado para aprender sobre a contribuição de diferentes catabólitos triptofanos em um mecanismo de doença e para testar estratégias terapêuticas. O meio de cultura celular rico em metabólitos secretos e moléculas de sinalização reflete o status do metabolismo triptofano e outros eventos celulares. Novos protocolos para a quantificação confiável de múltiplas kynureninas no complexo meio de cultura celular são desejados para permitir uma análise confiável e rápida de múltiplas amostras. Isso pode ser realizado com cromatografia líquida aliada à espectrometria de massa. Esta poderosa técnica é empregada em muitos laboratórios clínicos e de pesquisa para quantificação de metabólitos e pode ser usada para medir kynurenines.

Apresentado aqui é o uso de cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa quadrupole única (LC-SQ) para a determinação simultânea de quatro kynurenines, ou seja, kynurenine, 3-hidroxikynurenine, 3-hidroxyanthranilic, e ácido xanturnic no meio coletado de células cancerígenas in vitro cultivadas. O detector SQ é simples de usar e menos caro em comparação com outros espectrômetros de massa. Na análise SQ-MS, vários íons da amostra são gerados e separados de acordo com sua relação massa-carga específica(m/z),seguida pela detecção usando um modo de Monitoramento de Íons Únicos (SIM).

Este artigo chama a atenção sobre as vantagens do método relatado e indica alguns pontos fracos. É focado em elementos críticos da análise LC-SQ, incluindo preparação de amostras, juntamente com cromatografia e análise de espectrometria de massa. Também são discutidas as condições de controle de qualidade, as condições de calibração do método e os problemas de efeito matricial. Descrevemos uma simples aplicação de 3-nitrotyrosina como um padrão analógico para todos os analitos alvo. Como confirmado por experimentos com ovário humano e células cancerígenas de mama, o método LC-SQ proposto gera resultados confiáveis e pode ser ainda mais aplicado a outros modelos celulares in vitro.

Introdução

O caminho de kynurenine (KP) é a principal rota do catabolismo triptofano (Trp) em células humanas. Indoleamina-2,3-dioxygenase (IDO-1) em células extrahêspticas é a primeira enzima limitante de KP e converte Trp em N-formylkynurenine1. Outros passos dentro do KP geram outros metabólitos secundários, ou seja, kynurenines que exibem várias propriedades biológicas. Kynurenine (Kyn) é o primeiro catabólito Trp estável que mostra propriedades tóxicas e regula eventos celulares após a ligação ao receptor de hidrocarbonetos aryl (AhR)2. Posteriormente, Kyn é transformado em várias moléculas espontaneamente ou nos processos mediados por enzimas, gerando metabólitos como 3-hidroxikynurenine (3HKyn), ácido antoraniano (AA), ácido 3-hidroxyanthranilic (3-HAA), ácido kynurênico (Kyna) e ácido xanturênico (XA). Outro metabólito a jusante, 2-amino-3-carboxymuconic acid-6-semialdeído (ACMS), sofre ciclização não enzimática para ácido quinolínico (QA) ou ácido picolínico (PA)1. Finalmente, a QA é ainda transformada em dinucleotídeo de nicotinamida-adenina (NAD+)3, o metabólito de ponto final KP que é um importante cofator de enzimas. Algumas kynurenines têm propriedades neuroprotetoras como Kyna e PA, enquanto as outras, ou seja, 3HAA e 3HKyn, são tóxicas4. O ácido xanthurenic, formado a partir de 3HKyn, apresenta propriedades antioxidantes e vasorelaxação5. XA se acumula em lentes de envelhecimento e leva à apoptose das células epiteliais6. KP, descrito em meados do séculoXX, ganhou mais atenção quando seu envolvimento em vários transtornos foi demonstrado. O aumento da atividade dessa rota metabólica e o acúmulo de algumas kynurenines modulam a resposta imune e estão associados a diferentes condições patológicas como depressão, esquizofrenia, encefalopatia, HIV, demência, esclerose lateral amiotrófica, malária, Alzheimer, doença de Huntington e câncer4,7. Algumas alterações no metabolismo Trp são observadas em microambientes tumorais e células cancerosas2,8. Além disso, as kynurenines são consideradas como marcadores promissores da doença9. Na pesquisa sobre câncer, os modelos de cultura in vitro são bem estabelecidos e amplamente utilizados para avaliação pré-clínica de respostas a medicamentos anticancerígenos10. Os metabólitos trp são secretados pelas células no meio da cultura e podem ser medidos para avaliar o status da via kynurenina. Portanto, é necessário desenvolver métodos apropriados para a detecção simultânea de tantos metabólitos KP quanto possível em uma variedade de espécimes biológicos com um protocolo fácil, flexível e confiável.

Neste artigo, descrevemos um protocolo para a determinação simultânea de quatro metabólitos de via kynurenina: Kyn, 3HKyn, 3HAA e XA pela LC-SQ em um meio pós-cultura coletado de células cancerosas. Em uma abordagem analítica moderna, a cromatografia líquida13,14,15,16 é preferida para a detecção e quantificação simultâneas dos catabólitos triptofanos individuais, em contraste com ensaios bioquímicos inespecíficos utilizando o reagente Ehrlich11,12. Atualmente, existem muitos métodos disponíveis para a determinação de kynurenines em espécimes humanos, principalmente baseados na cromatografia líquida com detectores de ultravioleta ou fluorescência13,17,18,19. A cromatografia líquida aliada a um detector de espectrometria de massa (LC-MS) parece mais adequada para este tipo de análise, devido à sua maior sensibilidade (limites mais baixos de detecção), seletividade e repetibilidade.

Metabólitos trp já foram determinados em soro humano, plasma e urina13,20,21,22,23, no entanto, os métodos para outros espécimes biológicos, como o meio de cultura celular também são desejados. Anteriormente, o LC-MS era utilizado para compostos derivados de TRP em um meio coletado após acultura de células de glioma humanos, monócitos, células dendríticas ou astrócitos tratados com gama de interferon (IFN-γ)24,25,26. Atualmente, há a necessidade de novos protocolos validados que possam permitir uma avaliação de vários metabólitos em diferentes mídias culturais, células e tratamentos usados em modelos de câncer.

O objetivo do método desenvolvido é quantificar (dentro de uma corrida analítica) quatro kynurenines principais que podem indicar anormalidades em KP. Apresentados aqui estão etapas críticas do nosso protocolo recentemente publicado para análise quantitativa lc-SQ de kynurenines significativas selecionadas usando um padrão interno (3-nitrotyrosina, 3NT) no meio coletado de células cancerígenas humanas in vitro cultivadas 27. Para nosso melhor conhecimento, é o primeiro protocolo LC-SQ para quantificação simultânea de 3HKyn, 3HAA, Kyn e XA em um meio de cultura obtido a partir das células cultivadas in vitro. Após algumas modificações, o método pode ser aplicado ainda mais para estudar as mudanças no metabolismo Trp em uma gama mais ampla de modelos de cultura celular.

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Protocolo

1. Preparação das soluções de estoque padrão 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA standard

  1. Pesar os reagentes em um frasco com a maior precisão (0,3 mg cada). Para melhor precisão, dimensione os reagentes, ajustando o volume do solvente de acordo com a etapa 1.2.
  2. Dissolver os reagentes em 300 μL do solvente para obter uma solução de estoque de 1 g/L. Dissolver 3NT em 1% (v/v) ácido fórmico (FA) na água; Kyn, 3HAA e XA em sulfóxido de dimetil (DMSO); 3HKyn em água acidificada para pH 2.5 com ácido clorídrico (HCl).
    ATENÇÃO: 3HAA irrita olhos, nariz, garganta e pulmões. É prejudicial quando inalado, em contato com a pele, e se engolido. Use proteção apropriada, ou seja, luvas e máscara.
  3. Feche bem o frasco e coloque-o em um banho ultrassônico por 1 minuto para acelerar a dissolução.
    NOTA: Armazene as soluções de estoque a -20 °C e minimize o congelamento/degelo (3 ciclos no máximo) devido à instabilidade das soluções de estoque.

2. Preparação do meio de cultura tratada com carvão

  1. Em um tubo, pese 280 mg de carvão ativado e adicione 5 mL do meio líquido preparado para a cultura das células de interesse.
  2. Agite o tubo com o médio e o carvão em um see saw rocker por 2h, em temperatura ambiente (velocidade definida para 50 oscilações/min). Em seguida, centrifugar os tubos a 6000 x g por 15 min.
  3. Remova o tubo da centrífuga e colete cuidadosamente o supernatante sem perturbar o sedimento. Repita a centrifugação, se necessário, para remover todos os resíduos de carvão.
  4. Filtre o supernatante usando um filtro de seringa de 0,45 μm.
  5. Certifique-se de que o meio de cultura pré-tratada de carvão seja privado de traços de kynurenines executando uma amostra piloto em LC-MS, conforme descrito na etapa 6.3.2. Caso contrário, repita as etapas 2.1-2.4.
    NOTA: Se o meio de cultura completo inicialmente não contiver kynurenines, a etapa de purificação usando carvão pode ser omitida. Neste caso, prepare padrões de calibração e amostras de controle de qualidade utilizando o meio completo geralmente preparado para cultivo celular.
  6. Armazene o meio preparado a 4 °C até a análise.

3. Fazendo as soluções de calibração e curvas de calibração

  1. Espetar o meio de cultura pré-tratada de carvão com 0,75 μL de solução 0,1 g/L 3NT e adicionar quatro padrões (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) pelo menos em seis concentrações diferentes para cobrir as faixas de calibração. Mantenha bem o volume final de cada amostra em 150 μL. Vortex. Use tubos de centrífugas de 1,5 mL para preparação da amostra.
    NOTA: Pontos de calibração sugeridos para 3HKyn: 0,018, 0,045, 0,22, 1.12, 2.23, 4,46 μmol/L; para Kyn: 0,0096, 0,048, 0,24, 1,20, 2,40, 3,84 μmol/L; para 3HAA: 0,033, 0,16, 0,65, 3,27, 6,53, 13,06 μmol/L; para XA: 0,019, 0,13, 0,49, 1,22, 3,65, 4,87 μmol/L.
  2. Adicione 150 μL de metanol frio (mantido a -20 °C) contendo 1% (v/v) ácido fórmico em cada tubo para desproteinização da amostra. Feche bem os tubos e o vórtice.
  3. Incubar as amostras a -20 °C por 40 min.
  4. Centrifugar as amostras a 14.000 x g por 15 min a 4 °C. Remova os tubos da centrífuga. Colete supernantes nos novos tubos. Não perturbe o sedimento.
  5. Transfira 270 μL do supernante para o frasco de vidro usando uma pipeta automática. Coloque os frascos no evaporador e evapore suavemente até secar. Use o programa apropriado para frações de água/metanol para evaporar componentes voláteis. Não aplique temperatura superior a 40 °C e evite a secagem excessiva.
    NOTA: Frascos de vidro de fundo plano, ou seja, frascos cromatográficos facilitam evaporação mais rápida e recuperações mais altas em comparação com tubos cônicos plásticos.
  6. Depois de 30 min, verifique o estado de evaporação. Se necessário, continue evaporando (por exemplo, adicione 10 min extras). Evite a secagem excessiva.
  7. Remova os frascos do evaporador. Reconstituir cada amostra em 60 μL de ácido fórmico (v/v) na água. Adicione o solvente no frasco que contém o material residual. Feche bem os frascos e o vórtice.
  8. Transfira a amostra para um tubo de 1,5 mL e gire a 14.000 x g por 15 min a 4 °C para separar a proteína precipitada.
  9. Sem perturbar a pelota de proteína, transfira os supernantes em frascos cromatográficos com pastilhas cônicas de vidro com uma pipeta automática. Feche bem os frascos.
  10. Verifique se há presença de bolhas de ar no frasco de inserção e remova-as se necessário (por exemplo, por vórtice).
  11. Transfira os frascos cromatográficos contendo amostras para o autosampler LC. Registo a posição das amostras colocadas em uma bandeja de autosampler.

4. Preparação de amostras de controle de qualidade (QC)

  1. Espetar o meio de cultura pré-tratamento de carvão (preparado em um tubo centrífugo de 1,5 ml) com 0,75 μL de solução 0,1 g/L 3NT e padrões de quatro kynurenines (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) em uma concentração selecionada da faixa linear das curvas de calibração. Mantenha o volume final da amostra em 150 μL.
    NOTA: Se for o caso, prepare várias amostras de QC em diferentes concentrações que caem sob a faixa linear da curva de calibração.
  2. Siga o protocolo descrito na seção 3 (etapas 3.2-3.11).

5. Configuração do sistema LC-MS

  1. Preparar os solventes de fase móvel: Solvente A: formato de amônio de 20 mmol/L em água ultrauso (pH 4.3 ajustado com ácido fórmico); Solvente B: 100% acetonitrila.
    NOTA: Use apenas garrafas de vidro borossilicato. Enxágüe garrafas com água ultrauso antes de reabaste farpá-la. Não use garrafas limpas com detergentes.
    ATENÇÃO: A acetonitrila causa graves efeitos na saúde ou morte. É facilmente inflamado pelo calor. Líquido de acetonitrila e vapor podem irritar olhos, nariz, garganta e pulmões.
    1. Prepare 5 soluçãos de estoque mol/L de formato de amônio dissolvendo um reagente cristalino (15,77 g) em 50 mL de água ultrapura em uma garrafa de vidro. Mexa até que todos os resíduos se dissolvam. Filtre através da membrana de 0,45 μm para remover quaisquer detritos residuais (por exemplo, usando um filtro de seringa de nylon). Armazene a solução de estoque a 4 °C.
    2. Prepare o Solvente A adicionando 4 mL de 5 formatos de amônio mol/L na água até 980 mL de água ultrauso em uma garrafa de vidro âmbar e mexa bem. Mergulhe uma barra de agitação e coloque a garrafa com o solvente em um agitador magnético. Mergulhe um eletrodo pH na solução e controle o pH em agitação. Adicionar solução de estoque de ácido fórmico (98%-100%) dropwise usando uma pipeta automática com ponta de 0,2 mL para obter pH 4.3, ajuste o volume até 1 L com água ultrauso e mexa bem.
      NOTA: Prepare os solventes pelo menos uma vez por semana para evitar qualquer crescimento microbiano.
      ATENÇÃO: O ácido fórmico (FA) é tóxico quando inalado, causa queimaduras na pele e danos oculares. Trabalhe sob o capô da fumaça; usar luvas de proteção e casaco.
    3. Filtre todas as soluções através da membrana de 0,22 μm (por exemplo, filtro de seringa de nylon) para remover quaisquer detritos residuais. Opcionalmente, use os filtros de entrada de solventes dedicados aos reservatórios de solventes LC para proteger o sistema contra partículas de entrada.
  2. Inicie o software de controle e aquisição de dados LC-MS.
  3. Purgue o sistema LC com a fase móvel para remover bolhas e para preparar todos os canais de solvente.
  4. Ensemble uma coluna de guarda para proteger a coluna analítica de entupimento.
  5. Lave a coluna de proteção e analítica (C18, 2,1 x 100 mm, 1,8 μm) com acetonitrilo de 100% por cerca de 30 min e, em seguida, com 100% de solvente A até que se observe uma pressão estável na coluna. Controle o desempenho do sistema usando o software de controle.
  6. Defina os parâmetros LC apropriados no software de aquisição de dados.
    1. Configurar o programa de gradiente: 0-8 min solvente B 0%; 8-17 min solvente B 0-2%; 17-20 min solvente B 2%; 20-32 min solvente B 10-30%; 32-45 min solvente B 0%.
    2. Defina a taxa de fluxo de fase móvel em 0,15 mL/min, o tempo total de execução da análise por 45 minutos, a temperatura da coluna a +40 °C e o volume de injeção a 10 μL.
  7. Defina os parâmetros de aquisição do detector de espectrometria de massa.
    1. Aplicar parâmetros de ionização: monitoramento de íons únicos (SIM), ionização positiva, pressão nebulizadora de 50 psi, +350 °C de temperatura do gás seco, fluxo de gás seco de 12 L/min e tensão capilar de 5500 V.
    2. Selecione os íons de monitoramento de analitos: para 3HKyn m/z 225.0 (período de varredura: 2-6 min, tensão fragmentor: 100 V); para Kyn m/z 209.0 (período de varredura: 6-12 min, tensão fragmentor: 80 V); para 3HAA m/z 154,0 (período de varredura: 12-18 min, tensão fragmentor: 80 V); para 3NT m/z 227,0 (período de varredura: 18-23 min, tensão fragmentor: 100 V); para XA m/z 206,0 (período de varredura: 23-45 min, tensão fragmentor: 100 V).
  8. Construa uma lista de trabalho e execute amostras no sistema LC.
  9. Inicialmente, antes da análise das amostras experimentais, execute uma amostra em branco (Solvente A) pelo menos em triplicados, seguida por uma amostra de QC.
  10. Abra o software de análise de dados e carregue os resultados obtidos para a amostra de QC.
  11. Verifique a posição dos picos de analito no cromatograma. Quando os sinais mudam além da posição esperada, ajuste os portões de tempo para coleta adequada de sinais analitos. Consulte o manual de software para instruções sobre integração de sinal.

6. Construindo a curva de calibração

  1. No software de aquisição de dados, adicione padrões de calibração na lista de trabalho e execute os padrões em triplicados.
  2. Integre e meça a área de pico correspondente a 3HKyn, Kyn, 3HAA, 3NT e XA no tempo de retenção de cerca de 4,4 min, 10 min, 16 min, 21 min e 30 min, respectivamente.
  3. Construa curvas de calibração individuais para cada metabólito usando um programa de planilha.
    1. Para criar o gráfico de calibração, plote o valor para uma razão de área de pico de analito sobre a área de pico de 3NT versus a concentração do analito.
    2. Analise a amostra em branco (meio de cultura pré-tratada de carvão e apenas com 3NT) para garantir que não haja vestígios dos analitos estudados no meio. Caso contrário, subtraia o valor obtido de cada ponto de calibração.
    3. Verifique a linearidade de cada curva de calibração.
      1. Individualmente, para cada analito, crie uma equação linear de interceptação de inclinação (y = ax +b), onde y corresponde à razão da área de pico de analito versus área de pico de 3NT, a é a inclinação, x é a concentração de analito (μmol/L), e b refere-se à interceptação da curva. Traçar o gráfico 'y' versus 'x' gerará a curva de calibração.
      2. Adicione uma linha de tendência linear ao gráfico, exiba a equação da curva de calibração e o coeficiente de regressão no gráfico. Certifique-se de que o coeficiente de regressão é > 0,990. Em caso de padrões de calibração incompatíveis, prepare-os e/ou analise-os mais uma vez. Opcionalmente, altere a faixa de concentração da curva de calibração.
    4. Analise as amostras de QC para verificar o desempenho do sistema antes de analisar as amostras experimentais. Em caso de incompatibilidade (± desvio de 20% do valor de referência), prepare as novas curvas de calibração.

7. Cultura celular in vitro e coleta de amostras para análise

  1. Placa das células cancerígenas estudadas (MDA-MB-231 ou SK-OV-3) em DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) contendo 4,5 g/L de glicose, 10% (v/v) soro bovino fetal (FBS), 2 mmol/L e 1 U penicilina/estreptomicina e cultura a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% CO2 para expandi-los para o experimento. Passagem das células em 80% de confluência.
  2. Desprender células do prato de cultura usando trippsina, semente para o experimento em placas de 12 poços a uma densidade de 0,3 × 106 células por poço e colocar em uma incubadora durante a noite.
  3. No dia seguinte, aspire o meio de cultura e adicione DMEM fresco com ou sem a adição dos compostos estudados, dependendo do desenho experimental.
  4. Após 48 h, colete o meio de cima das células (cerca de 500 μL) em um tubo de 1,5 mL. Centrífuga a 14.000 x g por 5 min para remover qualquer detrito celular. Colete o supernatante e armazene a -80 °C até a análise.
  5. Salve a pelota celular do passo 7.4 para estimativa de proteína. Congele as amostras a -20 °C.
    NOTA: Os resultados obtidos para um meio de diferentes poços devem ser normalizados ao conteúdo proteico total para explicar a variabilidade do número celular em poços individuais. A concentração proteica pode ser avaliada conforme descrito na etapa 9.

8. Prepare amostras para análise de LC-MS

  1. Descongele a amostra congelada à temperatura ambiente e misture bem. Transfira 149,25 μL do meio de cultura para um tubo de centrifugação (1,5 mL).
  2. Adicione 0,75 μL de 0,1 g/L de solução 3NT (padrão interno). Feche bem os tubos e vórtices.
  3. Adicione 150 μL de metanol refrigerado a -20 °C contendo 1% (v/v) FA para desproteinização da amostra. Feche bem os tubos e vórtices.
  4. Continue com a preparação da amostra conforme descrito na seção 3 (etapas 3.3-3.11).
    NOTA: Algumas células cancerígenas como SK-OV-3 secretam grandes quantidades de Kyn em um meio cultural. Para encaixar os dados em uma faixa linear da curva de calibração, é necessária aproximadamente 100 vezes a diluição da amostra. Neste caso, diluir uma porção da amostra com 0,1% (v/v) FA na água e analisar, além da amostra não diluída. As amostras de referência das normas para a curva de calibração devem ser preparadas em meio de cultura completa diluída 100 vezes. Alternativamente, adicione mais pontos na curva de calibração (se for possível a solubilidade e a linearidade adequadas) para ajustá-la ao nível de concentração de Kyn na amostra experimental.
  5. Analise as amostras por LC-MS conforme descrito na seção 5. Construa uma lista de trabalho e execute cada amostra em triplicado.
  6. Após a conclusão da lista de trabalho, meça a área de pico do analito.
  7. Gere uma planilha usando o software disponível e obter dados numéricos.
  8. Em uma coluna de planilha, calcule a razão da área de pico de analito sobre a área de pico de 3NT.
  9. Use uma equação de calibração linear individual dedicada para cada analito (a partir da etapa 6.3.) para calcular as concentrações de analitos presentes nas amostras experimentais.

9. Avaliação do conteúdo proteico e da normalização dos dados

  1. Resuspende a pelota celular a partir da etapa 7.5 com 100 μL de soro fisco tamponado de fosfato (PBS) em tubo de 1,5 mL.
    NOTA: Prepare a solução PBS dissolvendo 8 g de cloreto de sódio, 0,2 g de cloreto de potássio, 1,44 g de fosfato de sódio dibasic, fosfato de dihidrogênio de potássio em 950 mL de água ultrapura. Mexa bem. Ajuste o pH para 7,4 com ácido clorídrico (dropwise). Ajuste o volume até 1 L com água ultrapura. Mexa bem até ficar homogêneo.
    ATENÇÃO: O ácido clorídrico é altamente corrosivo e deve ser manuseado com precauções de segurança adequadas. O contato com a pele humana pode causar vermelhidão, dor, queimaduras na pele. Trabalhe sob o capô da fumaça; usar luvas de proteção e casaco.
  2. Congele as amostras a -20 °C e descongele no gelo. Repita esta etapa 3x.
  3. Centrifugar as amostras a 14.000 x g por 15 min a 4 °C. Colete os supernantes nos novos tubos. Não perturbe a pelota.
  4. Diluir os supernantes 10x com PBS.
  5. Construa uma curva de calibração de 0 a 2 μg da proteína por faixa de poço.
    1. Prepare a solução padrão de albumina de soro bovino (BSA) para a calibração. Dissolva 1,23 μg de BSA em 1 mL de água ultrauso e bem vórtice.
    2. Em uma placa de 96 poços, carregue diferentes quantidades de solução padrão BSA (1,23 μg/mL): 0 μL, 2 μL, 4 μL, 5 μL, 7 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL.
    3. Encha o poço com PBS até o volume final de 50 μL.
  6. Carga 10 - 15 μL de lise celular a partir da etapa 9.4 na mesma placa de 96 poços. Encha os poços com PBS para chegar ao volume final de 50 μL.
    NOTA: Se necessário, ajuste o volume da alíquota de lisato celular em cada poço para caber na faixa linear da curva de calibração. Mantenha o volume final a 50 μL da amostra por poço.
  7. Adicione 200 μL de um reagente Bradford (diluído 5 vezes com água ultrauso) a cada poço.
  8. Incubar o patê de 96 poços por pelo menos 5 minutos em temperatura ambiente. Insira a placa em um leitor de microplacão. Medir a absorvância em λ = 595 nm.
  9. Construa uma curva de calibração usando um programa de planilha. Plote a quantidade BSA (μg) versus absorvância. Adicione uma linha de tendência linear, exiba a equação da curva de calibração e o coeficiente de regressão no gráfico.
  10. Use a equação linear (y = ax +b, onde y corresponde à absorvância em λ = 595 nm, a é a inclinação, x é um teor proteico (μg), e b refere-se à interceptação curva) para calcular a quantidade de proteína na amostra.
    NOTA: Considere um fator de diluição amostral nos cálculos.
  11. Use o teor de proteína estimado para normalizar a quantidade de kynurenina na amostra por 1 mg de proteína. Para isso, divida a concentração de kynurenines determinada na etapa 8.9 com o teor total de proteínas da etapa 9.10.

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Resultados

A LC-MS apresenta vantagens indiscutíveis na quantificação de moléculas biologicamente ativas, embora alguns componentes de espécimes complexos causem os chamados efeitos matriciais e comprometam a ionização dos analitos. Leva à supressão de íons ou ao aprimoramento de íons, diminuindo fortemente a precisão e afetando um limite de detecção/quantificação de LC-MS, que é considerado como um ponto ''fraco' do método. Em nosso protocolo, os íons são gerados pela ionização eletrospray (ESI) no modo posit...

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Discussão

Este artigo apresenta um protocolo LC-SQ detalhado para a quantificação simultânea de quatro principais metabólitos Trp (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) que são medidos em um meio a partir de células cancerígenas humanas in vitro cultivadas. Atenção especial é dada à preparação da amostra, procedimento de espectrometria cromatográfica/de massa e interpretação dos dados, os pontos mais importantes dentro da análise.

Em geral, a análise da LC-MS, devido à alta sensibilidade, re...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela União Europeia do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional no âmbito do Programa Operacional Desenvolvimento da Polônia Oriental 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00), pela Faculdade de Biotecnologia e Ciências Ambientais da Universidade Católica John Paul II de Lublin (Young Scientists grant for Ilona Sadok), Centro Nacional de Ciências Poloneses, OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 para Magdalena Staniszewska, Pesquisadora-Princípio).  Os autores agradecem ao Prof. Agnieszka Ścibior, do Laboratório de Estresse Oxidativo, Centro de Pesquisa Interdisciplinar, JPII CUL por compartilhar os equipamentos para cultivo celular e quantificação de proteínas.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
3-hydroksy-DL-kynureninaSigma-AldrichH1771
3-hydroxyanthranilic acidSigma-Aldrich14877697%
3-nitro-L-tyrosineSigma-AldrichN7389
AcetonitrileSupelco1.00029hypergrade for LC-MS LiChrosolv
Activated charcoalSupelco05105powder
Analytical balanceOhaus
Analytical columnAgilent Technologies959764-902Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µm)
Ammonium formateSupelco7022eluent additive for LC-MS, LiChropur, ≥99.0%
Bovine Serum AlbuminSigma1001887398
Caps for chromatographic vialsAgilent Technologies5185-5820blue screw caps,PTFE/red sil sepa
Cell culture dishNest704004polystyrene, non-pyrogenic, sterile
Cell culture plateBiologix07-601212-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille
Cell incubatorThermo Fisher ScientificHERAcell 150i Cu
CentrifugeEppendorfmodel 5415R
CentrifugeEppendorfmodel 5428
Centrifuge tubesBionovoB-2278Eppendorf type, 1.5 mL
Centrifuge tubesBionovoB-3693Falcon type, 50 mL, PP
Chromatographic data acqusition and analysis softwareAgilent TechnologiesLC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)
Chromatographic insert vialsAgilent Technologies9301-1387100 µL
Chromatographic vialsAgilent Technologies5182-07142 mL, clear glass
Dimethyl sulfoxideSupelco1.02950Uvasol
Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)PAN BiotechP04-41450
Dual meter pH/conductivityMettler ToledoSevenMulti
EvaporatorGenevacmodel EZ-2.3 Elite
Fetal bovine serumSigma-AldrichF9665
Formic acidSupelco5.33002for LC-MS LiChropur
Glass bottle for reagents storageBionovoS-207050 mL, clear glass
Guard columnAgilent Technologies959757-902Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 µm)
Hydrochloric acidMerck1.00317.1000
L-kynurenineSigma-AldrichK8625≥98% (HPLC)
Magnetic stirrerWigoES 21 H
MicrobalanceMettler Toledomodel XP6
Milli-Q systemMilliporeZRQSVPO30Direct-Q 3 UV with Pump
Quadrupole mass spectrometerAgilent TechnologiesG1948Bmodel 6120
Penicillin-StreptomycinSigma-Adrich048M4874V
Plate readerBio TekSynergy 2 operated by Gen5
Potassium chlorideMerck1.04936.1000
Potassium dihydrogen phosphateMerck1.05108.0500
Protein Assay Dye Reagent ConcentrateBioRad500-0006
See-saw rockerStuartSSL4
Serological pipetteNest3260015 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile
Sodium chlorideSigma-Aldrich7647-14-5
Sodium phosphate dibasicMerck1.06346.1000
Solvent inlet filterAgilent Technologies5041-2168glass filter, 20 μm pore size
Solvent reservoir (for LC-MS)Agilent Technologies9301-65241 L, clear glass
Solvent reservoir (for LC-MS)Agilent Technologies9301-65261 L, amber glass
Spreadsheet programMicrosoft OfficeMicrosoft Office Excel
Stir barBionovo6-2003teflon coated
Syringe filters for culture medium filtrationBionovo7-8803regenerated cellulose, Ø 30 mm, 0,45 µm
Syringe filters for mobile phase components filtrationBionovo6-0018nylon, Ø 30 mm, 0,22 µm
Tissue culture platesVWR10062-90096-wells, sterille
Trypsin-EDTA SolutionSigma-AldrihT4049-100 mL
Ultra-High Performance Liquid Chromatography systemAgilent TechnologiesG1367D, G1379B, G1312B, G1316C1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C)
Ultrasound bathPolsonic104533model 6D
VortexBiosanmodel V-1 plus
Xanthurenic acidSigma-AldrichD12080496%

Referências

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