JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

המתואר כאן הוא פרוטוקול לקביעת ארבעה מטבוליטים שונים טריפטופן שנוצר במסלול קינורנין (קינורנין, 3-hydroxykynurenine, חומצה xanthurenic, 3-hydroxyanthranilic חומצה) במדיום שנאסף מתרביות תאים סרטניים נותחו על ידי כרומטוגרפיה נוזלית יחד עם ספקטרומטריית מסה מרובעת אחת.

Abstract

מסלול הקינורנין וקטבוליטים טריפטופן בשם kynurenines קיבלו תשומת לב מוגברת למעורבותם בוויסות המערכת החיסונית וביולוגיה של סרטן. מבחני תרבות תאים במבחנה משמש לעתים קרובות כדי ללמוד על תרומתם של קטבוליטים טריפטופן שונים במנגנון המחלה לבדיקת אסטרטגיות טיפוליות. מדיום תרבות התא עשיר מטבוליטים מופרשים ומולקולות איתות משקף את המצב של חילוף החומרים טריפטופן ואירועים תאיים אחרים. פרוטוקולים חדשים לכימות אמין של קינורנינים מרובים במדיום תרבות התא המורכב רצויים לאפשר ניתוח אמין ומהיר של דגימות מרובות. זה יכול להתבצע עם כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה. טכניקה רבת עוצמה זו משמשת במעבדות קליניות ומחקריות רבות לכימות מטבוליטים וניתן להשתמש בה למדידת קינורנינים.

מוצג כאן הוא השימוש כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה quadrupole יחיד (LC-SQ) לקביעה בו זמנית של ארבעה קינורנינים, כלומר, קינורנין, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, וחומצה xanthurenic במדיום שנאסף תאים סרטניים בתרבית ויטרו. גלאי SQ הוא פשוט לשימוש ופחות יקר בהשוואה לספקטרומטרים מסה אחרים. בניתוח SQ-MS, יונים מרובים מהמדגם נוצרים ומופרדים בהתאם ליחס המסה לטעינה הספציפי שלהם (m/z), ואחריו הזיהוי באמצעות מצב ניטור יונים יחיד (SIM).

מאמר זה מושך את תשומת הלב על היתרונות של השיטה המדווחת ומציין כמה נקודות תורפה. הוא מתמקד באלמנטים קריטיים של ניתוח LC-SQ כולל הכנת מדגם יחד עם כרומטוגרפיה וניתוח ספקטרומטריית מסה. בקרת האיכות, תנאי כיול השיטה ובעיות אפקט המטריצה נדונים גם הם. תיארנו יישום פשוט של 3-nitrotyrosine כסטנדרט אנלוגי אחד עבור כל analytes היעד. כפי שאושר על ידי ניסויים עם השחלות האנושיות ותאי סרטן השד, שיטת LC-SQ המוצעת מייצרת תוצאות אמינות וניתן ליישם אותה עוד יותר על מודלים תאיים במבחנה אחרים.

Introduction

מסלול קינורנין (KP) הוא המסלול העיקרי של קטבוליזם טריפטופן (Trp) בתאים אנושיים. אינדולאמין-2,3-דיוקסיגנאז (IDO-1) בתאים אקסטרה-הפטיים הוא האנזים הראשון והמגביל של KP וממיר את Trp ל- N-formylkynurenine1. צעדים נוספים בתוך KP ליצור מטבוליטים משניים אחרים, כלומר kynurenines המציגים תכונות ביולוגיות שונות. קינורנין (Kyn) הוא קטבוליט Trp היציב הראשון המציג תכונות רעילות ומווסת אירועים תאיים לאחר קשירה לקולטן פחמימנים aryl (AhR)2. לאחר מכן, Kyn הופך למספר מולקולות באופן ספונטני או בתהליכים בתיווך אנזימים, ויוצר מטבוליטים כאלה כמו 3-hydroxykynurenine (3HKyn), חומצה אנתרנילית (AA), חומצה 3-הידרוקסיאנתרנית (3-HAA), חומצה קינורינית (Kyna) וחומצה קסנתרנית (XA). מטבוליט נוסף במורד הזרם, 2-אמינו-3-קרבוקסיקוניק חומצה-6-semialdehyde (ACMS), עובר מחזוריות לא אנזימטית לחומצה קינולינית (QA) או חומצה פיקולינית (PA)1. לבסוף, QA הופך עוד יותר nicotinamide-אדנין דינוקלאוטיד (NAD+)3, המטבוליט נקודת קצה KP כי הוא קופקטור אנזים חשוב. כמה kynurenines יש תכונות neuroprotective כגון Kyna ו- PA, בעוד האחרים, כלומר, 3HAA ו 3HKyn, הם רעילים4. חומצה Xanthurenic, אשר נוצר 3HKyn, מציג תכונות נוגדות חמצון vasorelaxation5. XA מצטבר בעדשות הזדקנות ומוביל אפופטוזיס של תאי אפיתל6. KP, המתואר באמצע המאה ה-20, זכה לתשומת לב רבה יותר כאשר מעורבותו בהפרעות שונות הודגם. פעילות מוגברת של מסלול מטבולי זה הצטברות של כמה kynurenines לווסת את התגובה החיסונית קשורים עם תנאים פתולוגיים שונים כגון דיכאון, סכיזופרניה, אנצפלופתיה, HIV, דמנציה, טרשת לרוחב amyotrophic, מלריה, אלצהיימר, מחלת הנטינגטון, וסרטן4,7. כמה שינויים בחילוף החומרים של Trp נצפו microenvironments הגידול ותאי סרטן2,8. יתר על כן, kynurenines נחשבים סמני מחלה מבטיחים9. במחקר סרטן, אין ויטרו מודלים תרבות התא מבוססים היטב בשימוש נרחב להערכה פרה-קלינית של תגובות תרופות נגד סרטן10. מטבוליטים Trp מופרשים על ידי תאים לתוך מדיום התרבות ניתן למדוד כדי להעריך את המצב של מסלול kynurenine. לכן, יש צורך לפתח שיטות מתאימות לגילוי בו זמנית של מטבוליטים KP רבים ככל האפשר במגוון של דגימות ביולוגיות עם פרוטוקול קל, גמיש ואמין.

במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לקביעה בו זמנית של ארבעה מטבוליטים מסלול קינורנין: Kyn, 3HKyn, 3HAA, ו XA על ידי LC-SQ במדיום שלאחר התרבות שנאסף מתאי סרטן. בגישה אנליטית מודרנית, כרומטוגרפיה נוזלית13,14,15,16 עדיפה על גילוי וכימות בו זמנית של קטבוליטים טריפטופן בודדים, בניגוד מבחנים ביוכימיים לא ספציפיים ניצול Ehrlich ריאגנט11,12. כיום, ישנן שיטות רבות הזמינות לקביעת קינורנינים בדגימות אנושיות, המבוססות בעיקר על כרומטוגרפיה נוזלית עם גלאי אולטרה סגול או פלואורסצנטי13,17,18,19. כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם גלאי ספקטרומטריית מסה (LC-MS) נראה מתאים יותר עבור סוג זה של ניתוח, בשל הרגישות הגבוהה שלהם (גבולות נמוכים יותר של גילוי), סלקטיביות וחזרתיות.

מטבוליטים Trp כבר נקבעו בסרום אנושי, פלזמה ושתן13,20,21,22,23, עם זאת, השיטות עבור דגימות ביולוגיות אחרות, כמו מדיום תרבות התא רצויים גם. בעבר, LC-MS שימש תרכובות נגזרות Trp במדיום שנאסף לאחר culturing של תאי גליומה אנושיים, מונוציטים, תאים דנדריטיים או אסטרוציטים שטופלו גמא אינטרפרון (IFN-γ)24,25,26. נכון לעכשיו, יש צורך בפרוטוקולים מאומתים חדשים שיכולים לאפשר הערכה של מספר מטבוליטים במדיות תרבות שונות, תאים וטיפולים המשמשים במודלים של סרטן.

מטרת השיטה המפותחת היא לכמת (בתוך ריצה אנליטית אחת) ארבעה קינורנינים עיקריים שיכולים להצביע על חריגות ב- KP. מוצגים להלן צעדים קריטיים של הפרוטוקול שפורסם לאחרונה שלנו לניתוח כמותי LC-SQ של קינורנינים משמעותיים נבחרים באמצעות תקן פנימי אחד (3-nitrotyrosine, 3NT) במדיום שנאסף מתאי סרטן אנושיים בתרבית במבחנה 27. למיטב ידיעתנו, זהו פרוטוקול LC-SQ הראשון לכימות בו זמנית של 3HKyn, 3HAA, Kyn ו- XA במדיום תרבות המתקבל מהתאים הגדלים במבחנה. על כמה שינויים, השיטה עשויה להיות מיושמת עוד יותר כדי ללמוד את השינויים בחילוף החומרים Trp במגוון רחב יותר של מודלים של תרבות התא.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת פתרונות מלאי סטנדרטיים 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA סטנדרטיים

  1. שוקלים את ריאגנטים בבקבוקון עם הדיוק הגבוה ביותר (0.3 מ"ג כל אחד). לדיוק טוב יותר, הדרג את ריאגנטים, התאמת נפח הממס על פי שלב 1.2.
  2. להמיס את ריאגנטים ב 300 μL של הממס כדי לקבל פתרון מלאי של 1 g / L. להמיס 3NT ב 1% (v / v) חומצה פורמית (FA) במים; Kyn, 3HAA ו-XA בדימוסטיל סולפוקסיד (DMSO); 3HKyn במים חומצי pH 2.5 עם חומצה הידרוכלורית (HCl).
    התראה: 3HAA מגרה את העיניים, האף, הגרון והריאות. זה מזיק כאשר בשאיפה, במגע עם העור, ואם בלע. ללבוש הגנה מתאימה כלומר, כפפות ומסכה.
  3. סגור בחוזקה את הבקבוקון והנח אותו באמבטיה קולית במשך דקה כדי להאיץ את הפירוק.
    הערה: אחסן את פתרונות המלאי ב-20°C ומזער את ההקפאה/הפשרה (3 מחזורים לכל היותר) בשל חוסר היציבות של פתרונות המלאי.

2. הכנת מדיום תרבות המטופל בפחם

  1. בצינור, שוקלים 280 מ"ג פחם פעיל ומוסיפים 5 מ"ל של המדיום הנוזלי המוכן לצביעת תאי העניין.
  2. לנער את הצינור עם בינוני ופחם על נדנדה לראות לראות במשך 2 שעות, בטמפרטורת החדר (להגדיר מהירות ל 50 תנודות / דקה). לאחר מכן, צנטריפוגה הצינורות ב 6000 x g במשך 15 דקות.
  3. הסר את הצינור מן הצנטריפוגה בזהירות לאסוף את supernatant מבלי להפריע משקעים. חזור על צנטריפוגה במידת הצורך, כדי להסיר את כל שאריות הפחם.
  4. סנן את supernatant באמצעות מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר.
  5. ודא כי מדיום תרבות pretreated פחם נשלל עקבות kynurenines על ידי הפעלת מדגם פיילוט על LC-MS כמתואר בשלב 6.3.2. אחרת, חזור על שלבים 2.1-2.4.
    הערה: אם מדיום התרבות המלא בתחילה אינו מכיל קינורנינים, ייתכן שצעד הטיהור באמצעות פחם יושמט. במקרה זה, להכין תקני כיול ודגימות בקרת איכות באמצעות המדיום המלא בדרך כלל מוכן culturing התא.
  6. לאחסן את המדיום מוכן ב 4 מעלות צלזיוס עד ניתוח.

3. ביצוע פתרונות הכיול ועקומות הכיול

  1. תקצץ את מדיום התרבות של פחם עם 0.75 μL של פתרון 0.1 g/L 3NT והוסף ארבעה תקנים (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) לפחות שישה ריכוזים שונים לכיסוי טווחי כיול. שמור את הנפח הסופי של כל מדגם ב 150 μL. וורטקס היטב. השתמש 1.5 צינורות צנטריפוגה מ"ל להכנת מדגם.
    הערה: נקודות כיול מוצעות עבור 3HKyn: 0.018, 0.045, 0.22, 1.12, 2.23, 4.46 מיקרומול /L; עבור Kyn: 0.0096, 0.048, 0.24, 1.20, 2.40, 3.84 מיקרומול /L; עבור 3HAA: 0.033, 0.16, 0.65, 3.27, 6.53, 13.06 מיקרומול / ליטר; עבור XA: 0.019, 0.13, 0.49, 1.22, 3.65, 4.87 מיקרומול /L.
  2. הוסף 150 μL של מתנול קר (נשמר ב -20 מעלות צלזיוס) המכיל 1% (v / v) חומצה פורמית לתוך כל צינור עבור deproteinization מדגם. סגור היטב את הצינורות ואת המערבולת היטב.
  3. דגירה את הדגימות ב -20 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות.
  4. צנטריפוגה הדגימות ב 14,000 x g במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את הצינורות מהצנטריפוגה. לאסוף supernatants לתוך הצינורות החדשים. אל תפריעו למשקעים.
  5. העבר 270 μL של supernatant לתוך בקבוקון הזכוכית באמצעות פיפטה אוטומטית. מכניסים את הבקבוקונים לאייד ומתאדים בעדינות עד לייבוש. השתמש בתוכנית המתאימה עבור שברי מים / מתנול כדי לאדות רכיבים נדיפים. אין למרוח טמפרטורה גבוהה מ-40 מעלות צלזיוס ולהימנע מייבוש יתר.
    הערה: בקבוקוני זכוכית שטוחים תחתון, כלומר, בקבוקונים כרומטוגרפיים להקל על אידוי מהיר יותר ושחזורים גבוהים יותר בהשוואה צינורות חרוט פלסטיק.
  6. לאחר 30 דקות, בדוק את מצב האידוי. במידת הצורך, להמשיך אידוי (למשל, להוסיף 10 דקות נוספות). הימנע ייבוש יתר.
  7. הסר את הבקבוקונים מהמאדה. לשקם כל דגימה ב 60 μL של 0.1% (v / v) חומצה פורמית במים. מוסיפים את הממס לבקבוקון המכיל את שאריות החומר. סגור היטב את הבקבוקונים ואת המערבולת - ובכן.
  8. מעבירים את הדגימה לצינור של 1.5 מ"ל ומסתובבים במהירות של 14,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להפריד את החלבון המשקע.
  9. מבלי להפריע גלולת החלבון, להעביר את supernatants לתוך בקבוקונים כרומטוגרפיים עם מוסיף זכוכית חרוטית עם פיפטה אוטומטית. סגור היטב את הבקבוקונים.
  10. בדוק אם יש נוכחות של בועות אוויר בבקבוקון הכנס ולהסיר אותם במידת הצורך (למשל, על ידי מערבולת).
  11. העבר את הבקבוקונים הכרומטוגרפיים המכילים דגימות לתוך דגימה אוטומטית LC. רשום את מיקום הדגימות הממוקמות במגש דגימה אוטומטית.

4. הכנת דגימות בקרת איכות (QC)

  1. ספייק את מדיום התרבות pretreated פחם (מוכן בצינור צנטריפוגלי 1.5 מ"ל) עם 0.75 μL של 0.1 g / L 3NT פתרון ותקנים של ארבעה kynurenines (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) בריכוז אחד שנבחר מתוך הטווח הליניארי של עקומות הכיול. שמור את הנפח הסופי של המדגם ב 150 μL.
    הערה: אם רלוונטי, להכין כמה דגימות QC בריכוזים שונים נופלים תחת הטווח הליניארי של עקומת הכיול.
  2. בצע את הפרוטוקול המתואר בסעיף 3 (שלבים 3.2-3.11).

5. הגדרת מערכת LC-MS

  1. הכינו את ממיסי הפאזה הניידים: ממס A: 20 mmol / L אמוניום אסיר במים אולטרה סגולים (pH 4.3 מותאם עם חומצה פורמית); ממס B: 100% אצטוניטריל.
    הערה: יש להשתמש בבקבוקי זכוכית בורוסיליקט בלבד. יש לשטוף בקבוקים במים אולטרה-דקים לפני מילוים מחדש. אין להשתמש בבקבוקים שנוקו עם חומרי ניקוי.
    התראה: אצטוניטריל גורם להשפעות בריאותיות חמורות או למוות. הוא מוצת בקלות על ידי חום. נוזל אצטוניטריל ואדים יכול לגרות את העיניים, האף, הגרון והריאות.
    1. הכן 5 mol / L פתרון מלאי של אמוניום formate על ידי המסת מגיב גבישי (15.77 גרם) ב 50 מ"ל של מים אולטרה סגולים בבקבוק זכוכית. מערבבים עד שכל השיוריות מתמוססות. סנן דרך קרום 0.45 מיקרומטר כדי להסיר כל פסולת שיורית (למשל, באמצעות מסנן מזרק ניילון). אחסן את פתרון המלאי ב- 4 °C (69 °F).
    2. הכן ממס A על ידי הוספת 4 מ"ל של 5 מול / L אמוניום formate במים ל 980 מ"ל של מים אולטרה סגולים בבקבוק זכוכית ענבר ומערבבים היטב. לטבול בר ערבוב ולשים את הבקבוק עם הממס על stirrer מגנטי. לטבול אלקטרודה pH לתוך הפתרון ולשלוט על ה- pH תחת ערבוב. הוסף פתרון מלאי חומצה פורמית (98%-100%) dropwise באמצעות פיפטה אוטומטית עם קצה 0.2 מ"ל כדי להשיג pH 4.3, להתאים את עוצמת הקול עד 1 L עם מים אולטרה דקים ומערבבים היטב.
      הערה: הכינו את הממסים לפחות פעם בשבוע כדי למנוע צמיחה מיקרוביאלית.
      התראה: חומצה פורמית (FA) רעילה בשאיפה, גורמת לכוויות בעור ולנזק לעיניים. לעבוד מתחת למכסה המנוע אדים; ללבוש כפפות מגן ומעיל.
    3. לסנן את כל הפתרונות דרך קרום 0.22 מיקרומטר (למשל, מסנן מזרק ניילון) כדי להסיר את כל שאריות פסולת. לחלופין, השתמש במסנני כניסת ממס ייעודיים למאגרי ממס LC כדי להגן על המערכת מפני חלקיקים נכנסים.
  2. הפעל את תוכנת הבקרה ורכישת הנתונים LC-MS.
  3. לטהר את מערכת LC עם השלב הנייד כדי להסיר בועות, כדי prime כל ערוצי ממס.
  4. אנסמבל עמודת מגן כדי להגן על העמודה האנליטית מפני סתימה.
  5. רוקן את השומר ואת העמודה האנליטית (C18, 2.1 x 100 מ"מ, 1.8 מיקרומטר) עם 100% אצטוניטריל במשך כ 30 דקות, ולאחר מכן עם 100% ממס A עד לחץ יציב בעמודה נצפתה. שלוט בביצועי המערכת באמצעות תוכנת הבקרה.
  6. הגדר את פרמטרי ה- LC המתאימים בתוכנת רכישת הנתונים.
    1. הגדר את תוכנית השיפוע: 0-8 דקות ממס B 0%; 8-17 דקות ממס B 0-2%; 17-20 דקות ממס B 2%; 20-32 דקות ממס B 10-30%; 32-45 דקות ממס B 0%.
    2. הגדר את קצב זרימת הפאזה הנייד ב- 0.15 מ"ל/דקה, זמן ריצה כולל של ניתוח למשך 45 דקות, טמפרטורת עמודה ב- +40 °C (70 °F) ונפח הזרקה ב- 10 μL.
  7. הגדר את פרמטרי הרכישה של גלאי ספקטרומטריית המסה.
    1. החל פרמטרי יינון: ניטור יון יחיד (SIM), יינון חיובי, לחץ nebulizer של 50 psi, +350 מעלות צלזיוס ייבוש טמפרטורת הגז, ייבוש זרימת גז של 12 L / min, ו 5500 V מתח נימי.
    2. בחר את יוני ניטור האנלייט: עבור 3HKyn m/z 225.0 (תקופת סריקה: 2-6 דקות, מתח מקוטע: 100 V); עבור Kyn m/z 209.0 (תקופת סריקה: 6-12 דקות, מתח מפצל: 80 V); עבור 3HAA m/z 154.0 (תקופת סריקה: 12-18 דקות, מתח מפצל: 80 V); עבור 3NT m/z 227.0 (תקופת סריקה: 18-23 דקות, מתח מפצל: 100 V); עבור XA m/z 206.0 (תקופת סריקה: 23-45 דקות, מתח מפצל: 100 V).
  8. בנה רשימת עבודה והפעל דוגמאות במערכת LC.
  9. בהתחלה, לפני הניתוח של דגימות הניסוי, להפעיל מדגם ריק (ממס A) לפחות משולשים, ואחריו מדגם QC אחד.
  10. פתח את תוכנת ניתוח הנתונים וטען את התוצאות שהתקבלו עבור מדגם QC.
  11. בדוק את המיקום של פסגות אנלייט על הכרומטוגרמה. כאשר אותות זזים מעבר למיקום הצפוי, התאם את שערי הזמן לאיסוף אותות ניתוח מתאים. עיין במדריך התוכנה לקבלת הוראות אודות שילוב אותות.

6. בניית עקומת הכיול

  1. בתוכנת רכישת הנתונים, הוסף תקני כיול לרשימת העבודה והפעל את הסטנדרטים בטריפלים.
  2. שלב ומדוד את אזור השיא המתאים ל- 3HKyn, Kyn, 3HAA, 3NT ו- XA בזמן השמירה של כ- 4.4 דקות, 10 דקות, 16 דקות, 21 דקות ו- 30 דקות, בהתאמה.
  3. בנה עקומות כיול בודדות עבור כל מטבוליט באמצעות תוכנית גיליון אלקטרוני.
    1. כדי ליצור את תרשים הכיול, התווה את הערך עבור יחס של אזור שיא ניתוח מעל אזור השיא של 3NT לעומת ריכוז האנליסט.
    2. נתח את המדגם הריק (מדיום תרבות pretreated פחם זינק רק עם 3NT) כדי להבטיח שאין עקבות של האנליסטים שנחקרו במדיום. אחרת, הפחת את הערך המתקבל מכל נקודת כיול.
    3. בדוק את הליניאריות של כל עקומת כיול.
      1. בנפרד, עבור כל ניתוח, צור משוואה ליניארית ליירוט שיפוע (y = גרזן +b), כאשר y מתאים ליחס של אזור השיא של האנלייט לעומת אזור השיא של 3NT, a הוא השיפוע, x הוא ריכוז האנלייט (μmol/L) ו- b מתייחס ליירוט העקומה. התוויית הגרף 'y' לעומת 'x' תיצור את עקומת הכיול.
      2. הוסף קו מגמה ליניארי לתרשים, הצג את משוואת עקומת הכיול ואת מקדם הרגרסיה בתרשים. ודא שמקדם הרגרסיה הוא > 0.990. במקרה של תקני כיול לא תואמים, הכינו ו/או ניתחו אותם שוב. לחלופין, שנה את טווח הריכוז של עקומת הכיול.
    4. נתח את דגימות ה- QC כדי לבדוק את ביצועי המערכת לפני ניתוח הדגימות הניסיוניות. במקרה של אי-תאימות (סטייה של ± 20% מערך הייחוס), הכינו את עקומות הכיול החדשות.

7. תרבות תאי במבחנה ואיסוף מדגם לניתוח

  1. צלחת התאים הסרטניים שנחקרו (MDA-MB-231 או SK-OV-3) ב DMEM (מדיום הנשר שונה של Dulbecco) המכיל 4.5 גרם / ליטר של ᴅ גלוקוז, 10% (v / v) סרום שור עוברי (FBS), 2 mmol / L ʟ גלוטמין ו 1 U פניצילין / סטרפטומיצין ותרבות ב 37 °C (69 °F) באווירה לחה של 5% CO2 כדי להרחיב אותם לניסוי. מעבר התאים ב 80% של המפגש.
  2. נתק תאים מתבנית התרבות באמצעות טריפסין, זרע לניסוי על צלחות 12 באר בצפיפות של 0.3 × 106 תאים לבאר ומניחים באינקובטור בן לילה.
  3. למחרת, לשאוף את מדיום התרבות ולהוסיף DMEM טרי עם או בלי תוספת של תרכובות למד, בהתאם לעיצוב הניסיוני.
  4. לאחר 48 שעות, לאסוף את המדיום מעל התאים (כ 500 μL) לתוך צינור 1.5 מ"ל. צנטריפוגה ב 14, 000 x g במשך 5 דקות כדי להסיר את כל פסולת התא. לאסוף את supernatant ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד הניתוח.
  5. שמור את גלולה הסלולר משלב 7.4 להערכת חלבון. להקפיא את הדגימות ב -20 מעלות צלזיוס.
    הערה: יש לנרמל את התוצאות המתקבלות עבור מדיום מבארות שונות לתכולת החלבון הכוללת כדי להסביר את השונות במספר התאים בבארות בודדות. ניתן להעריך את ריכוז החלבון כמתואר בשלב 9.

8. הכנת דגימות לניתוח LC-MS

  1. מפשירים את הדגימה הקפואה בטמפרטורת החדר ומערבבים היטב. העבר 149.25 μL של מדיום התרבות לתוך צינור צנטריפוגה (1.5 מ"ל).
  2. הוסף 0.75 μL של 0.1 g/L של פתרון 3NT (תקן פנימי). סגור היטב את הצינורות והמערבולת.
  3. הוסף 150 μL של מצונן ב -20 °C מתנול המכיל 1% (v / v) FA עבור deproteinization מדגם. סגור היטב את הצינורות והמערבולת.
  4. המשך בהכנה לדוגמה כמתואר בסעיף 3 (שלבים 3.3-3.11).
    הערה: תאים סרטניים מסוימים כמו SK-OV-3 מפרישים כמויות גדולות של Kyn למדיום תרבות. כדי להתאים את הנתונים לטווח ליניארי של עקומת הכיול, יש צורך בדילול של המדגם בערך פי 100. במקרה זה, לדלל חלק של המדגם עם 0.1% (v / v) FA במים ולנתח בנוסף מדגם לא מדולל. דגימות הייחוס של תקנים עבור עקומת הכיול צריך להיות מוכן ב 100 פעמים מדולל מדיום תרבות מלאה. לחלופין, להוסיף נקודות נוספות בעקומת הכיול (אם מסיסות נכונה ליניאריות מושגים) כדי להתאים אותו לרמת הריכוז של Kyn במדגם הניסיוני.
  5. נתח את הדגימות על-ידי LC-MS כמתואר בסעיף 5. בנה רשימת עבודה והפעל כל דגימה בטריפל.
  6. לאחר השלמת רשימת העבודה, למדוד את אזור השיא של ניתוח.
  7. צור גיליון אלקטרוני באמצעות התוכנה הזמינה והשגת נתונים מספריים.
  8. בעמודת גיליון אלקטרוני אחת לחשב את היחס של אזור השיא של ניתוח מעל אזור השיא 3NT.
  9. השתמש במשוואת כיול ליניארית בודדת המוקדשת לכל ניתוח (משלב 6.3.) כדי לחשב ריכוזים של ניתוחים הקיימים בדגימות הניסוי.

9. הערכת תכולת החלבון ונורמליזציה של נתונים

  1. Resuspend גלולה הסלולר משלב 7.5 עם 100 μL של מלוחים אגירה פוספט (PBS) בצינור 1.5 מ"ל.
    הערה: להכין פתרון PBS על ידי המסת 8 גרם של נתרן כלורי, 0.2 גרם של אשלגן כלורי, 1.44 גרם של נתרן פוספט dibasic, אשלגן דיהידרוגן פוספט ב 950 מ"ל של מים אולטרה סגולים. מערבבים היטב. כוונן את ה- pH ל- 7.4 עם חומצה הידרוכלורית (dropwise). כוונן את הנפח עד 1 L עם מים אולטרה-דקים. מערבבים היטב עד הומוגני.
    התראה: חומצה הידרוכלורית היא מאכלת מאוד ויש לטפל בה באמצעי זהירות מתאימים. מגע עם עור האדם יכול לגרום לאאדמומיות, כאב, כוויות בעור. לעבוד מתחת למכסה המנוע אדים; ללבוש כפפות מגן ומעיל.
  2. להקפיא את הדגימות ב -20 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להפשיר על קרח. חזור על שלב זה 3x.
  3. צנטריפוגה הדגימות ב 14, 000 x g במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatants לתוך הצינורות החדשים. אל תפריעו לכדור.
  4. לדלל את supernatants 10x עם PBS.
  5. לבנות עקומת כיול מ 0 עד 2 מיקרוגרם של החלבון לכל טווח טוב.
    1. הכן פתרון סטנדרטי של אלבומין סרום שור (BSA) לכיול. להמיס 1.23 מיקרוגרם של BSA ב 1 מ"ל של מים אולטרה סגולים ומערבולת היטב.
    2. על צלחת 96-באר, לטעון כמויות שונות של פתרון סטנדרטי BSA (1.23 מיקרוגרם / מ"ל): 0 μL, 2 μL, 4 μL, 5 μL, 7 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL.
    3. למלא את הבאר עם PBS לנפח הסופי של 50 μL.
  6. טען 10 - 15 תאי μL lysate משלב 9.4 על אותה צלחת 96 באר. מלא את הבארות עם PBS כדי להגיע לנפח הסופי של 50 μL.
    הערה: במידת הצורך, כוונן את עוצמת הקול של aliquot lysate התא בכל באר כדי להתאים בטווח הליניארי של עקומת הכיול. שמור את הנפח הסופי ל 50 μL של המדגם לכל באר.
  7. הוסף 200 μL של ריאגנט ברדפורד (מדולל 5 פעמים עם מים אולטרה סגולים) לכל באר.
  8. דגירה פטה 96-באר לפחות 5 דקות בטמפרטורת החדר. הכנס את הלוח לקורא מיקרופלאט. מדידת ספיגה ב λ = 595 ננומטר.
  9. בנה עקומת כיול באמצעות תוכנית גיליון אלקטרוני. התווה את כמות BSA (μg) לעומת ספיגה. הוסף קו מגמה ליניארי, הצג את משוואת עקומת הכיול ואת מקדם הרגרסיה בתרשים.
  10. השתמש במשוואה הליניארית (y = ax +b, כאשר y מתאים לספיגה ב- μ = 595 ננומטר, a הוא השיפוע, x הוא תכולת חלבון (מיקרוגרם), ו- b מתייחס ליירוט העקומה) כדי לחשב את כמות החלבון במדגם.
    הערה: שקול גורם דילול לדוגמה בחישובים.
  11. השתמש בתכולת החלבון המשוערת כדי לנרמל את כמות הקיאנורנין במדגם לכל 1 מ"ג חלבון. כדי לעשות זאת, לחלק את הריכוז של kynurenines נקבע בשלב 8.9 עם תכולת החלבון הכוללת משלב 9.10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

LC-MS מציג יתרונות שאין עליה עוררין בכימות של מולקולות פעילות ביולוגית, למרות שרכיבים מסוימים של דגימות מורכבות גורמים למה שמכונה אפקטים מטריצתיים ויינון פשרה של אנליטים. זה מוביל דיכוי יון או שיפור יון, מאוד להקטין את הדיוק ומשפיע על מגבלה של זיהוי / כימות של LC-MS, אשר נחשב כנקודה "חלשה" של השי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מאמר זה מציג פרוטוקול LC-SQ מפורט לכימות בו זמנית של ארבעה מטבוליטים עיקריים של Trp (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) הנמדדים במדיום מתאי סרטן אנושיים בתרבית במבחנה. תשומת לב מיוחדת מקדישה להכנת המדגם, הליך ספקטרומטריה כרומטוגרפית / מסה, ופרשנות נתונים, הנקודות החשובות ביותר בתוך הניתוח.

באופן...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי האיחוד האירופי מהקרן האירופית לפיתוח אזורי במסגרת פיתוח התוכנית התפעולית של מזרח פולין 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00), על ידי הפקולטה לביוטכנולוגיה ומדעי הסביבה של האוניברסיטה הקתולית של ג'ון פול השני לובלין (מענק מדענים צעירים עבור אילונה סאדוק), המרכז הלאומי למדע פולני, OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 עבור מגדלנה סטניזווסקה, חוקרת עקרונות).  המחברים מודים לפרופ' אגניישקה שצ'יביור מהמעבדה ללחץ חמצוני, המרכז למחקר בינתחומי, JPII CUL על שיתוף הציוד לפולחן תאים וכימות חלבונים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3-hydroksy-DL-kynureninaSigma-AldrichH1771
3-hydroxyanthranilic acidSigma-Aldrich14877697%
3-nitro-L-tyrosineSigma-AldrichN7389
AcetonitrileSupelco1.00029hypergrade for LC-MS LiChrosolv
Activated charcoalSupelco05105powder
Analytical balanceOhaus
Analytical columnAgilent Technologies959764-902Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µm)
Ammonium formateSupelco7022eluent additive for LC-MS, LiChropur, ≥99.0%
Bovine Serum AlbuminSigma1001887398
Caps for chromatographic vialsAgilent Technologies5185-5820blue screw caps,PTFE/red sil sepa
Cell culture dishNest704004polystyrene, non-pyrogenic, sterile
Cell culture plateBiologix07-601212-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille
Cell incubatorThermo Fisher ScientificHERAcell 150i Cu
CentrifugeEppendorfmodel 5415R
CentrifugeEppendorfmodel 5428
Centrifuge tubesBionovoB-2278Eppendorf type, 1.5 mL
Centrifuge tubesBionovoB-3693Falcon type, 50 mL, PP
Chromatographic data acqusition and analysis softwareAgilent TechnologiesLC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)
Chromatographic insert vialsAgilent Technologies9301-1387100 µL
Chromatographic vialsAgilent Technologies5182-07142 mL, clear glass
Dimethyl sulfoxideSupelco1.02950Uvasol
Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)PAN BiotechP04-41450
Dual meter pH/conductivityMettler ToledoSevenMulti
EvaporatorGenevacmodel EZ-2.3 Elite
Fetal bovine serumSigma-AldrichF9665
Formic acidSupelco5.33002for LC-MS LiChropur
Glass bottle for reagents storageBionovoS-207050 mL, clear glass
Guard columnAgilent Technologies959757-902Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 µm)
Hydrochloric acidMerck1.00317.1000
L-kynurenineSigma-AldrichK8625≥98% (HPLC)
Magnetic stirrerWigoES 21 H
MicrobalanceMettler Toledomodel XP6
Milli-Q systemMilliporeZRQSVPO30Direct-Q 3 UV with Pump
Quadrupole mass spectrometerAgilent TechnologiesG1948Bmodel 6120
Penicillin-StreptomycinSigma-Adrich048M4874V
Plate readerBio TekSynergy 2 operated by Gen5
Potassium chlorideMerck1.04936.1000
Potassium dihydrogen phosphateMerck1.05108.0500
Protein Assay Dye Reagent ConcentrateBioRad500-0006
See-saw rockerStuartSSL4
Serological pipetteNest3260015 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile
Sodium chlorideSigma-Aldrich7647-14-5
Sodium phosphate dibasicMerck1.06346.1000
Solvent inlet filterAgilent Technologies5041-2168glass filter, 20 μm pore size
Solvent reservoir (for LC-MS)Agilent Technologies9301-65241 L, clear glass
Solvent reservoir (for LC-MS)Agilent Technologies9301-65261 L, amber glass
Spreadsheet programMicrosoft OfficeMicrosoft Office Excel
Stir barBionovo6-2003teflon coated
Syringe filters for culture medium filtrationBionovo7-8803regenerated cellulose, Ø 30 mm, 0,45 µm
Syringe filters for mobile phase components filtrationBionovo6-0018nylon, Ø 30 mm, 0,22 µm
Tissue culture platesVWR10062-90096-wells, sterille
Trypsin-EDTA SolutionSigma-AldrihT4049-100 mL
Ultra-High Performance Liquid Chromatography systemAgilent TechnologiesG1367D, G1379B, G1312B, G1316C1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C)
Ultrasound bathPolsonic104533model 6D
VortexBiosanmodel V-1 plus
Xanthurenic acidSigma-AldrichD12080496%

References

  1. Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment. International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).
  2. Heng, B., et al. Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immunobiology. Oncotarget. 7 (6), 6506-6520 (2015).
  3. Badawy, A. A. B. Kynurenine pathway and human systems. Experimental Gerontology. 129, (2020).
  4. Chen, Y., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites in humans: Disease and healthy states. International Journal of Tryptophan Research. 2 (1), 1-19 (2009).
  5. Sathyasaikumar, K. V., et al. Xanthurenic Acid Formation from 3-Hydroxykynurenine in the Mammalian Brain: Neurochemical Characterization and Physiological Effects. Neuroscience. 367, 85-97 (2017).
  6. Malina, H., Richter, C., Frueh, B., Hess, O. M. Lens epithelial cell apoptosis and intracellular Ca2+ increasein the presence of xanthurenic acid. BMC Ophthalmology. 2, 1-7 (2002).
  7. Colín-González, A. L., Maldonado, P. D., Santamaría, A. 3-Hydroxykynurenine: an intriguing molecule exerting dual actions in the central nervous system. Neurotoxicology. 34, 189-204 (2013).
  8. Xue, P., Fu, J., Zhou, Y. The aryl hydrocarbon receptor and tumor immunity. Frontiers in Immunology. 9 (286), 00286(2018).
  9. Tan, V. X., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites as biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis. Frontiers in Microbiology. 13 (1013), 1-11 (2019).
  10. Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Research. 14 (40), 2377-2384 (2015).
  11. Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity. Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).
  12. Park, A., et al. Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways. Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).
  13. Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M. Chromatographic analysis of tryptophan metabolites. Journal of Separation Science. 40 (15), 3020-3045 (2017).
  14. Fuertig, R., et al. LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain. Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).
  15. Marcos, J., et al. Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).
  16. Möller, M., Du Preez, J., Harvey, B. Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).
  17. Lesniak, W. G., et al. Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites. Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).
  18. Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection. International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).
  19. Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection. Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).
  20. Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum. Journal of Biological Methods. 4 (3), 75(2017).
  21. Arnhard, K., et al. A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma. Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).
  22. Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).
  23. Huang, Y., et al. A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients. Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).
  24. Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).
  25. Zhu, W., et al. Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).
  26. Hashioka, S., et al. Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes. Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).
  27. Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).
  28. Annesley, T. M. Ion suppression in mass spectrometry. Clinical Chemistry. 49 (7), 1041-1044 (2003).
  29. Houée-Lévin, C., et al. Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences. Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).
  30. Wei, H., et al. Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage. Reproductive Sciences. , e1933719119833788 (2019).
  31. Liu, P., et al. Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes. BMC Cancer. 9, 416(2009).
  32. Mailankot, M., et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

15933

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved