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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí se describe un protocolo para la determinación de cuatro metabolitos triptófanos diferentes generados en la vía kynurenina (kynurenina, 3-hidroxikynurenina, ácido xanthurenic, ácido 3-hidroxiyanthranilic) en el medio recogido de cultivos celulares cancerosos analizados por cromatografía líquida junto con una sola espectrometría de masa cuadrúpeda.

Resumen

La vía kynurenina y los catabolitos de triptófano llamados kynurenines han recibido mayor atención por su participación en la regulación inmune y la biología del cáncer. Un ensayo de cultivo celular in vitro se utiliza a menudo para aprender sobre la contribución de diferentes catabolitos de triptófano en un mecanismo de la enfermedad y para probar estrategias terapéuticas. Medio de cultivo celular que es rico en metabolitos secretados y moléculas de señalización refleja el estado del metabolismo del triptófano y otros eventos celulares. Se desean nuevos protocolos para la cuantificación confiable de múltiples kynurenines en el complejo medio de cultivo celular para permitir un análisis fiable y rápido de múltiples muestras. Esto se puede lograr con cromatografía líquida junto con espectrometría de masas. Esta potente técnica se emplea en muchos laboratorios clínicos y de investigación para la cuantificación de metabolitos y se puede utilizar para medir kynurenines.

Aquí se presenta el uso de cromatografía líquida junto con espectrometría de masas de cuadrúpedo único (LC-SQ) para la determinación simultánea de cuatro kynureninas, es decir, kynurenina, 3-hidroxikynurenina, 3-hidroxiyanthranilic, y ácido xanthurenic en el medio recogido de células cancerosas cultivadas in vitro. Sq detector es fácil de usar y menos costoso en comparación con otros espectrómetros de masa. En el análisis SQ-MS, se generan y separan varios iones de la muestra según su relación de masa a carga específica(m/z),seguida de la detección mediante un modo de supervisión de iones únicos (SIM).

Este documento llama la atención sobre las ventajas del método notificado e indica algunos puntos débiles. Se centra en elementos críticos del análisis LC-SQ, incluida la preparación de muestras junto con la cromatografía y el análisis de espectrometría de masas. También se discuten el control de calidad, las condiciones de calibración del método y los problemas de efecto de matriz. Describimos una simple aplicación de 3-nitrotirosina como un estándar analógico para todos los analitos de destino. Como confirman los experimentos con óvulos humanos y células de cáncer de mama, el método LC-SQ propuesto genera resultados confiables y se puede aplicar aún más a otros modelos celulares in vitro.

Introducción

La vía kynurenina (KP) es la principal ruta del catabolismo del triptófano (Trp) en las células humanas. Indoleamina-2,3-dioxigenasa (IDO-1) en células extrahepáticas es la primera enzima limitante de KP y convierte Trp en N-formylkynurenine1. Otros pasos dentro de KP generan otros metabolitos secundarios, a saber, kynurenines que exhiben varias propiedades biológicas. Kynurenine (Kyn) es el primer catabolito Trp estable que muestra propiedades tóxicas y regula los eventos celulares después de unirse al receptor de hidrocarburos aryl (AhR)2. Posteriormente, Kyn se transforma en varias moléculas, ya sea espontáneamente o en los procesos mediados por enzimas, generando tales metabolitos como 3-hidroxikynurenine (3HKyn), ácido anthranilic (AA), ácido 3-hidroxiykynurenlic (3-HAA), ácido kynurenic (Kyna), y ácido xanthurenic (XA). Otro metabolito aguas abajo, 2-amino-3-ácido carboxímuconico-6-semialdehído (ACMS), se somete a cíclico no enzimático al ácido quinolinico (QA) o ácido picolínico (PA)1. Por último, qa se transforma aún más en nicotinamida-adenina dinucleótido (NAD+)3, el metabolito de punto final KP que es un cofactor enzimático importante. Algunas kynurenines tienen propiedades neuroprotectoras como Kyna y PA, mientras que las otras, es decir, 3HAA y 3HKyn, son tóxicas4. Ácido xanthurenic, que se forma a partir de 3HKyn, presenta propiedades antioxidantes y vasorelaxación5. XA se acumula en lentes de envejecimiento y conduce a la apoptosis de células epiteliales6. KP, descrito a mediados delsiglo XX, ganó más atención cuando se demostró su participación en varios trastornos. El aumento de la actividad de esta vía metabólica y la acumulación de algunas kynureninas modulan la respuesta inmune y se asocian con diferentes condiciones patológicas como depresión, esquizofrenia, encefalopatía, VIH, demencia, esclerosis lateral amiotrófica, malaria, Alzheimer, enfermedad de Huntington y cáncer4,7. Algunos cambios en el metabolismo del Trp se observan en microambientes tumorales y células cancerosas2,8. Además, las kynurenines se consideran marcadores prometedores de la enfermedad9. En la investigación del cáncer, los modelos de cultivo celular in vitro están bien establecidos y ampliamente utilizados para la evaluación preclínica de las respuestas a los medicamentos contra el cáncer10. Los metabolitos Trp son secretados por las células en el medio de cultivo y se pueden medir para evaluar el estado de la vía kynurenina. Por lo tanto, es necesario desarrollar métodos adecuados para la detección simultánea de tantos metabolitos KP como sea posible en una variedad de especímenes biológicos con un protocolo fácil, flexible y confiable.

En este artículo, describimos un protocolo para la determinación simultánea de cuatro metabolitos de vía kynurenina: Kyn, 3HKyn, 3HAA y XA por LC-SQ en un medio post-cultivo recogido de células cancerosas. En un enfoque analítico moderno, se prefiere la cromatografía líquida13,14,15,16 para la detección y cuantificación simultánea de los catabolitos de triptófano individuales, en contraste con los ensayos bioquímicos no específicos utilizando el reactivo Ehrlich11,12. En la actualidad, existen muchos métodos disponibles para la determinación de kynureninas en muestras humanas, principalmente basados en cromatografía líquida con detectores ultravioleta o de fluorescencia13,17,18,19. La cromatografía líquida junto con un detector de espectrometría de masas (LC-MS) parece más adecuada para este tipo de análisis, debido a su mayor sensibilidad (límites más bajos de detección), selectividad y repetibilidad.

Los metabolitos Trp ya se han determinado en suero humano, plasma y orina13,20,21,22,23,sin embargo, también se desean los métodos para otros especímenes biológicos, como el medio de cultivo celular. Anteriormente, LC-MS se utilizaba para compuestos derivados de Trp en un medio recogido después de la cultión de células de glioma humano, monocitos, células dendríticas o astrocitos tratados con gamma interferón (IFN-γ)24,25,26. Actualmente, existe la necesidad de nuevos protocolos validados que permitan una evaluación de varios metabolitos en diferentes medios de cultivo, células y tratamientos utilizados en modelos de cáncer.

El propósito del método desarrollado es cuantificar (dentro de una ejecución analítica) cuatro kynureninas principales que pueden indicar anomalías en KP. Aquí se presentan pasos críticos de nuestro protocolo recientemente publicado para el análisis cuantitativo LC-SQ de kynureninas significativas seleccionadas utilizando un estándar interno (3-nitrotirosina, 3NT) en el medio recogido de las células de cáncer humano cultivadas in vitro 27. Hasta donde sabemos, es el primer protocolo LC-SQ para la cuantificación simultánea de 3HKyn, 3HAA, Kyn y XA en un medio de cultivo obtenido de las células adultas in vitro. Tras algunas modificaciones, el método podría aplicarse aún más para estudiar los cambios en el metabolismo de Trp en una gama más amplia de modelos de cultivo celular.

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Protocolo

1. Preparación de soluciones estándar de stock estándar 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA

  1. Pesar los reactivos en un vial con la mayor precisión (0,3 mg cada uno). Para una mayor precisión, escale los reactivos, ajustando el volumen del disolvente según el paso 1.2.
  2. Disolver los reactivos en 300 μL del disolvente para obtener una solución de stock de 1 g/L. Disolver 3NT en 1% (v/v) ácido fórmico (FA) en agua; Kyn, 3HAA y XA en sulfóxido de dimetil (DMSO); 3HQuilino en agua acidificada al pH 2.5 con ácido clorhídrico (HCl).
    PRECAUCIÓN: 3HAA irrita los ojos, la nariz, la garganta y los pulmones. Es perjudicial cuando se inhala, en contacto con la piel y si se ingiere. Use la protección adecuada, es decir, guantes y máscara.
  3. Cierre bien el vial y colóquelo en un baño ultrasónico durante 1 minuto para acelerar la disolución.
    NOTA: Almacene las soluciones de stock a -20 °C y minimice la congelación/descongelación (3 ciclos máximos) debido a la inestabilidad de las soluciones de stock.

2. Preparación del medio de cultivo tratado con carbón

  1. En un tubo, pesar 280 mg de carbón activado y añadir 5 ml del medio líquido preparado para la cultivo de las células de interés.
  2. Agitar el tubo con el medio y el carbón en una sierra balancín durante 2 h, a temperatura ambiente (ajuste la velocidad a 50 oscilaciones/min). A continuación, centrífuga los tubos a 6000 x g durante 15 min.
  3. Retire el tubo de la centrífuga y recoja cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento. Repita la centrifugación si es necesario, para eliminar todos los residuos de carbón.
  4. Filtre el sobrenadante con un filtro de jeringa de 0,45 μm.
  5. Asegúrese de que el medio de cultivo pretratado del carbón se ve privado de rastros de kynurenines mediante la ejecución de una muestra piloto en LC-MS como se describe en el paso 6.3.2. De lo contrario, repita los pasos 2.1-2.4.
    NOTA: Si el medio de cultivo completo inicialmente no contiene kynurenines, es posible que se omita el paso de purificación que utiliza carbón vegetal. En este caso, prepare los estándares de calibración y las muestras de control de calidad utilizando el medio completo normalmente preparado para la culturing celular.
  6. Guarde el medio preparado a 4 °C hasta el análisis.

3. Hacer las soluciones de calibración y curvas de calibración

  1. Pinche el medio de cultivo pretratado de carbón con 0,75 μL de solución 0,1 g/L 3NT y añada cuatro estándares (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) al menos a seis concentraciones diferentes para cubrir los rangos de calibración. Mantenga el volumen final de cada muestra en 150 μL. Utilice tubos centrífugas de 1,5 ml para la preparación de muestras.
    NOTA: Puntos de calibración sugeridos para 3HKyn: 0.018, 0.045, 0.22, 1.12, 2.23, 4.46 μmol/L; para Kyn: 0,0096, 0,048, 0,24, 1,20, 2,40, 3,84 μmol/L; para 3HAA: 0,033, 0,16, 0,65, 3,27, 6,53, 13,06 μmol/L; para XA: 0,019, 0,13, 0,49, 1,22, 3,65, 4,87 μmol/L.
  2. Añadir 150 μL de metanol frío (mantenido a -20 °C) que contenga ácido fórmico del 1% (v/v) en cada tubo para la desproteinización de la muestra. Cierre bien los tubos y el vórtice.
  3. Incubar las muestras a -20 °C durante 40 min.
  4. Centrífuga las muestras a 14.000 x g durante 15 min a 4 °C. Retire los tubos de la centrífuga. Recoge sobrenautas en los nuevos tubos. No moleste el sedimento.
  5. Transfiera 270 μL del sobrenadante al vial de vidrio utilizando una pipeta automática. Ponga los viales en el evaporador y evapore suavemente hasta que se sequen. Utilice el programa adecuado para las fracciones de agua/metanol para evaporar componentes volátiles. No aplique temperatura superior a 40 °C y evite el secado excesivo.
    NOTA: Los viales de vidrio de fondo plano, es decir, los viales cromatográficos facilitan una evaporación más rápida y mayores recuperaciones en comparación con los tubos cónicos plásticos.
  6. Después de 30 min, compruebe el estado de evaporación. Si es necesario, continúe con la evaporación (por ejemplo, agregue 10 minutos adicionales). Evite el secado excesivo.
  7. Retire los viales del evaporador. Reconstituir cada muestra en 60 μL de ácido fórmico del 0,1% (v/v) en agua. Agregue el disolvente al vial que contiene el material residual. Cierre bien los viales y el vórtice-pozo.
  8. Transfiera la muestra a un tubo de 1,5 ml y gire a 14.000 x g durante 15 minutos a 4 °C para separar la proteína precipitada.
  9. Sin alterar el pellet proteico, transfiera los sobrenautas a viales cromatológicos con insertos cónicos de vidrio con una pipeta automática. Cierre bien los viales.
  10. Compruebe la presencia de burbujas de aire en el vial de inserción y retírelas si es necesario (por ejemplo, por vórtice).
  11. Transfiera los viales cromatográficos que contienen muestras al autoamplificador LC. Registre la posición de las muestras colocadas en una bandeja de muestreador automático.

4. Preparación de muestras de control de calidad (QC)

  1. Pinche el medio de cultivo pretratado con carbón (preparado en un tubo centrífugo de 1,5 ml) con 0,75 μL de solución 0,1 g/L 3NT y estándares de cuatro kynurenines (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) a una concentración seleccionada del rango lineal de las curvas de calibración. Mantenga el volumen final de la muestra en 150 μL.
    NOTA: Si procede, prepare varias muestras de control de calidad a diferentes concentraciones que caigan bajo el rango lineal de la curva de calibración.
  2. Siga el protocolo descrito en la sección 3 (pasos 3.2-3.11).

5. Configuración del sistema LC-MS

  1. Preparar los disolventes de fase móvil: Disolvente A: formato de amonio de 20 mmol/L en agua ultrapura (pH 4.3 ajustado con ácido fómico); Disolvente B: 100% acetonitrilo.
    NOTA: Utilice únicamente botellas de vidrio de borosilicato. Enjuague las botellas con agua ultrapura antes de rellenarla. No utilice botellas limpiadas con detergentes.
    PRECAUCIÓN: La acetonitrilo causa graves efectos sobre la salud o la muerte. Se enciende fácilmente por el calor. El líquido y el vapor de acetonitrilo pueden irritar los ojos, la nariz, la garganta y los pulmones.
    1. Preparar solución de 5 mol/L de formato de amonio disolviendo un reactivo cristalino (15,77 g) en 50 ml de agua ultrapura en una botella de vidrio. Revuelva hasta que todos los residuos se disuelvan. Filtre a través de la membrana de 0,45 μm para eliminar cualquier residuo residual (por ejemplo, mediante el uso de un filtro de jeringa de nylon). Almacene la solución de stock a 4 °C.
    2. Prepare el disolvente A añadiendo 4 ml de formato de amonio de 5 mol/L en agua a 980 ml de agua ultrapura en una botella de vidrio ámbar y revuelva bien. Sumerja una barra de agitación y coloque la botella con el disolvente en un agitador magnético. Sumerja un electrodo de pH en la solución y controle el pH bajo agitación. Añadir solución de stock de ácido fórmico (98%-100%) a continuación, con una pipeta automática con punta de 0,2 ml para obtener pH 4.3, ajustar el volumen hasta 1 L con agua ultrapura y revolver bien.
      NOTA: Prepare los disolventes al menos una vez a la semana para evitar cualquier crecimiento microbiano.
      PRECAUCIÓN: El ácido fórmico (FA) es tóxico cuando se inhala, causa quemaduras en la piel y daños oculares. Trabajar bajo el capó del humo; usar guantes y abrigos protectores.
    3. Filtre todas las soluciones a través de la membrana de 0,22 μm (por ejemplo, filtro de jeringa de nylon) para eliminar cualquier residuo residual. Opcionalmente, utilice los filtros de entrada de disolvente dedicados a los depósitos de disolventes LC para proteger el sistema de partículas entrantes.
  2. Inicie el software de control y adquisición de datos LC-MS.
  3. Purgue el sistema LC con la fase móvil para eliminar burbujas y preparar todos los canales solventes.
  4. Ensamble una columna de protección para proteger la columna analítica de la obstrucción.
  5. Enjuague el protector y la columna analítica (C18, 2,1 x 100 mm, 1,8 μm) con acetonitrilo al 100% durante unos 30 minutos, y luego con 100% disolvente A hasta que se observe una presión estable en la columna. Controle el rendimiento del sistema mediante el software de control.
  6. Fije los parámetros LC apropiados en el software de adquisición de datos.
    1. Configurar el programa de gradiente: 0-8 min disolvente B 0%; 8-17 min disolvente B 0-2%; 17-20 min disolvente B 2%; 20-32 min disolvente B 10-30%; 32-45 min disolvente B 0%.
    2. Ajuste el caudal de fase móvil a 0,15 ml/min, el tiempo total de ejecución del análisis durante 45 min, la temperatura de la columna a +40 °C y el volumen de inyección en 10 μL.
  7. Establezca los parámetros de adquisición del detector de espectrometría de masas.
    1. Aplicar parámetros de ionización: monitorización de iones únicos (SIM), ionización positiva, presión de nebulizador de 50 psi, +350 °C temperatura de gas de secado, flujo de gas de secado de 12 L/min y voltaje capilar de 5500 V.
    2. Seleccione los iones de monitoreo de analitos: para 3HKyn m/z 225.0 (período de escaneo: 2-6 min, voltaje fragmentor: 100 V); para Kyn m/z 209.0 (período de escaneo: 6-12 min, voltaje fragmentor: 80 V); para 3HAA m/z 154.0 (período de escaneo: 12-18 min, voltaje fragmentor: 80 V); para 3NT m/z 227.0 (período de escaneo: 18-23 min, voltaje fragmentor: 100 V); para XA m/z 206.0 (período de escaneo: 23-45 min, voltaje fragmentor: 100 V).
  8. Construya un pool de trabajo y ejecute muestras en el sistema LC.
  9. Al principio, antes del análisis de las muestras experimentales, ejecute una muestra en blanco (SolventE A) al menos en triplicados, seguida de una muestra de control de calidad.
  10. Abra el software de análisis de datos y cargue los resultados obtenidos para la muestra de control de calidad.
  11. Compruebe la posición de los picos de analitos en el cromatograma. Cuando las señales se desplazan más allá de la posición esperada, ajuste las puertas de tiempo para la recolección adecuada de señales de analito. Consulte el manual de software para obtener instrucciones sobre la integración de señales.

6. Construcción de la curva de calibración

  1. En el software de adquisición de datos, añada estándares de calibración al pool de trabajo y ejecute los estándares en triplicados.
  2. Integre y mida el área pico correspondiente a 3HKyn, Kyn, 3HAA, 3NT y XA en el tiempo de retención de aproximadamente 4,4 min, 10 min, 16 min, 21 min y 30 min, respectivamente.
  3. Construya curvas de calibración individuales para cada metabolito utilizando un programa de hoja de cálculo.
    1. Para crear el gráfico de calibración, trace el valor de una relación de área pico de analito sobre el área pico 3NT frente a la concentración del analito.
    2. Analice la muestra en blanco (medio de cultivo pretratado con carbón sólo con 3NT) para asegurarse de que no hay rastro de los analitos estudiados en el medio. De lo contrario, reste el valor obtenido de cada punto de calibración.
    3. Compruebe la linealidad de cada curva de calibración.
      1. Individualmente, para cada analito, cree una ecuación lineal de talud-intercepción (y = ax +b), donde y corresponde a la relación de la zona pico de analito frente a la superficie pico 3NT, a es la pendiente, x es la concentración de analito (μmol/L), y b se refiere a la intercepción de curva. Trazar el gráfico 'y' frente a 'x' generará la curva de calibración.
      2. Agregue una línea de tendencia lineal al gráfico, muestre la ecuación de la curva de calibración y el coeficiente de regresión en el gráfico. Asegúrese de que el coeficiente de regresión sea > 0,990. En caso de estándares de calibración no coincidentes, prepárese y/o analice estos una vez más. Opcionalmente, cambie el rango de concentración de la curva de calibración.
    4. Analice las muestras de control de calidad para comprobar el rendimiento del sistema antes de analizar las muestras experimentales. En caso de incompatibilidades (± desviación del 20% del valor de referencia), prepare las nuevas curvas de calibración.

7. Cultivo celular in vitro y recolección de muestras para su análisis

  1. Plañe las células cancerosas estudiadas (MDA-MB-231 o SK-OV-3) en DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) que contengan 4,5 g/L de ᴅ-glucosa, 10% (v/v) suero bovino fetal (FBS), 2 mmol/L ʟ-glutamina y 1 U penicilina/estreptomicina y cultivo a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% CO2 para expandirlos para el experimento. Pasar las células al 80% de la confluencia.
  2. Separa las células del plato de cultivo usando trippsina, semilla para el experimento en placas de 12 pozos a una densidad de 0.3 × 106 células por pozo y colóquela en una incubadora durante la noche.
  3. Al día siguiente, aspirar el medio de cultivo y añadir DMEM fresco con o sin la adición de los compuestos estudiados, dependiendo del diseño experimental.
  4. Después de 48 h, recoja el medio desde arriba de las células (aproximadamente 500 μL) en un tubo de 1,5 ml. Centrífuga a 14.000 x g durante 5 minutos para eliminar los restos celulares. Recoge el sobrenadante y guárdalo a -80 °C hasta el análisis.
  5. Guarde el pellet celular del paso 7.4 para la estimación de proteínas. Congele las muestras a -20 °C.
    NOTA: Los resultados obtenidos para un medio de diferentes pozos deben normalizarse al contenido total de proteínas para tener en cuenta la variabilidad en el número de células en pozos individuales. La concentración de proteínas se puede evaluar como se describe en el paso 9.

8. Preparar muestras para el análisis de LC-MS

  1. Descongele la muestra congelada a temperatura ambiente y mezcle bien. Transfiera 149,25 μL del medio de cultivo a un tubo de centrifugación (1,5 ml).
  2. Añadir 0,75 μL de 0,1 g/L de solución 3NT (estándar interno). Cierre bien los tubos y el vórtice.
  3. Añadir 150 μL de refrigerado a -20 °C de metanol que contiene 1% (v/v) FA para la desproteinización de muestras. Cierre bien los tubos y el vórtice.
  4. Continúe con la preparación de muestras como se describe en la sección 3 (pasos 3.3-3.11).
    NOTA: Algunas células cancerosas como SK-OV-3 secretan grandes cantidades de Kyn en un medio de cultivo. Para ajustar los datos a un rango lineal de la curva de calibración, es necesaria una dilución aproximadamente 100 veces de la muestra. En este caso, diluya una porción de la muestra con FA del 0,1% (v/v) en agua y analice además de la muestra sin diluir. Las muestras de referencia de las normas para la curva de calibración deben prepararse en un medio de cultivo completo diluido 100 veces. Alternativamente, agregue más puntos en la curva de calibración (si se logra la solubilidad y linealidad adecuadas) para ajustarla al nivel de concentración de Kyn en la muestra experimental.
  5. Analice las muestras por LC-MS como se describe en la sección 5. Construya un pool de trabajo y ejecute cada muestra en triplicado.
  6. Una vez completado el pool de trabajo, mida el área pico del analito.
  7. Genere una hoja de cálculo utilizando el software disponible y los datos numéricos de obtención.
  8. En una columna de hoja de cálculo calcular la relación del área pico de analito sobre el área pico 3NT.
  9. Utilice una ecuación de calibración lineal individual dedicada a cada analito (a partir del paso 6.3.) para calcular las concentraciones de analitos presentes en las muestras experimentales.

9. Evaluación del contenido de proteínas y normalización de datos

  1. Resuspend el pellet celular desde el paso 7.5 con 100 μL de solución salina amortiguada por fosfato (PBS) en tubo de 1.5 mL.
    NOTA: Preparar la solución PBS disolviendo 8 g de cloruro sódico, 0,2 g de cloruro de potasio, 1,44 g de fosfato sódico dibasico, fosfato dihidrógeno de potasio en 950 ml de agua ultrapura. Revuelve bien. Ajuste el pH a 7,4 con ácido clorhídrico (gota a gota). Ajuste el volumen hasta 1 L con agua ultrapura. Revuelva bien hasta que esté homogéneo.
    PRECAUCIÓN: El ácido clorhídrico es altamente corrosivo y debe manipularse con las precauciones de seguridad adecuadas. El contacto con la piel humana puede causar enrojecimiento, dolor, quemaduras en la piel. Trabajar bajo el capó del humo; usar guantes y abrigos protectores.
  2. Congele las muestras a -20 °C y luego descongele sobre hielo. Repita este paso 3x.
  3. Centrífuga las muestras a 14.000 x g durante 15 min a 4 °C. Recoge los sobrenadantes en los nuevos tubos. No moleste el pellet.
  4. Diluir los sobrenadantes 10x con PBS.
  5. Construir una curva de calibración de 0 a 2 μg de la proteína por rango de pozo.
    1. Prepare la solución estándar de albúmina sérica bovina (BSA) para la calibración. Disolver 1,23 μg de BSA en 1 ml de agua ultrapura y vórtice bien.
    2. En una placa de 96 pozos, cargue diferentes cantidades de solución estándar BSA (1,23 μg/ml): 0 μL, 2 μL, 4 μL, 5 μL, 7 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL.
    3. Llene el pozo con PBS hasta el volumen final de 50 μL.
  6. Cargue de 10 a 15 μL de lisato celular desde el paso 9.4 en la misma placa de 96 pozos. Llene los pozos con PBS para alcanzar el volumen final de 50 μL.
    NOTA: Si es necesario, ajuste el volumen de la licuada de la célula en cada pozo para que encaje en el rango lineal de la curva de calibración. Mantenga el volumen final a 50 μL de la muestra por pozo.
  7. Añadir 200 μL de un reactivo bradford (diluido 5 veces con agua ultrapura) a cada pozo.
  8. Incuba el paté de 96 pozos durante al menos 5 minutos a temperatura ambiente. Inserte la placa en un lector de microplacas. Mida la absorbancia a λ = 595 nm.
  9. Construya una curva de calibración utilizando un programa de hoja de cálculo. Trace la cantidad BSA (μg) frente a la absorbancia. Agregue una línea de tendencia lineal, muestre la ecuación de la curva de calibración y el coeficiente de regresión en el gráfico.
  10. Utilice la ecuación lineal (y = ax +b, donde y corresponde a la absorbancia a λ = 595 nm, a es la pendiente, x es un contenido proteico (μg), y b se refiere a la intercepción de curva) para calcular la cantidad de proteína en la muestra.
    NOTA: Considere un factor de dilución de la muestra en los cálculos.
  11. Utilice el contenido estimado de proteínas para normalizar la cantidad de kynurenina en la muestra por 1 mg de proteína. Para ello, divida la concentración de kynureninas determinada en el paso 8.9 con el contenido total de proteínas del paso 9.10.

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Resultados

LC-MS presenta ventajas indiscutibles en la cuantificación de moléculas biológicamente activas, a pesar de que algunos componentes de especímenes complejos causan los llamados efectos de matriz y comprometen la ionización de analitos. Conduce a la supresión de iones o mejora de iones, disminuyendo fuertemente la precisión y afectando a un límite de detección/cuantificación de LC-MS, que se considera como un punto ''débil' del método. En nuestro protocolo, los iones son generados por la ionización de electros...

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Discusión

Este documento presenta un protocolo detallado LC-SQ para la cuantificación simultánea de cuatro metabolitos Trp principales (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) que se miden en un medio a partir de células cancerosas humanas cultivadas in vitro. Se presta especial atención a la preparación de la muestra, el procedimiento de espectrometría cromatográfica/de masas y la interpretación de datos, los puntos más importantes dentro del análisis.

En general, el análisis LC-MS, debido a la alta ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Unión Europea del Fondo Europeo de Desarrollo Regional en el marco del Programa Operativo de Desarrollo de Polonia Oriental 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00), por la Facultad de Biotecnología y Ciencias Ambientales de la Universidad Católica Juan Pablo II de Lublin (Beca de Jóvenes Científicos para Ilona Sadok), Centro Nacional de Ciencias de Polonia, OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 para Magdalena Staniszewska, Investigadora Principal).  Los autores agradecen a la Profesora Agnieszka Ścibior del Laboratorio de Estrés Oxidativo, Centro de Investigación Interdisciplinaria, JPII CUL por compartir el equipo para la cultulación celular y cuantificación de proteínas.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
3-hydroksy-DL-kynureninaSigma-AldrichH1771
3-hydroxyanthranilic acidSigma-Aldrich14877697%
3-nitro-L-tyrosineSigma-AldrichN7389
AcetonitrileSupelco1.00029hypergrade for LC-MS LiChrosolv
Activated charcoalSupelco05105powder
Analytical balanceOhaus
Analytical columnAgilent Technologies959764-902Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µm)
Ammonium formateSupelco7022eluent additive for LC-MS, LiChropur, ≥99.0%
Bovine Serum AlbuminSigma1001887398
Caps for chromatographic vialsAgilent Technologies5185-5820blue screw caps,PTFE/red sil sepa
Cell culture dishNest704004polystyrene, non-pyrogenic, sterile
Cell culture plateBiologix07-601212-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille
Cell incubatorThermo Fisher ScientificHERAcell 150i Cu
CentrifugeEppendorfmodel 5415R
CentrifugeEppendorfmodel 5428
Centrifuge tubesBionovoB-2278Eppendorf type, 1.5 mL
Centrifuge tubesBionovoB-3693Falcon type, 50 mL, PP
Chromatographic data acqusition and analysis softwareAgilent TechnologiesLC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)
Chromatographic insert vialsAgilent Technologies9301-1387100 µL
Chromatographic vialsAgilent Technologies5182-07142 mL, clear glass
Dimethyl sulfoxideSupelco1.02950Uvasol
Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)PAN BiotechP04-41450
Dual meter pH/conductivityMettler ToledoSevenMulti
EvaporatorGenevacmodel EZ-2.3 Elite
Fetal bovine serumSigma-AldrichF9665
Formic acidSupelco5.33002for LC-MS LiChropur
Glass bottle for reagents storageBionovoS-207050 mL, clear glass
Guard columnAgilent Technologies959757-902Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 µm)
Hydrochloric acidMerck1.00317.1000
L-kynurenineSigma-AldrichK8625≥98% (HPLC)
Magnetic stirrerWigoES 21 H
MicrobalanceMettler Toledomodel XP6
Milli-Q systemMilliporeZRQSVPO30Direct-Q 3 UV with Pump
Quadrupole mass spectrometerAgilent TechnologiesG1948Bmodel 6120
Penicillin-StreptomycinSigma-Adrich048M4874V
Plate readerBio TekSynergy 2 operated by Gen5
Potassium chlorideMerck1.04936.1000
Potassium dihydrogen phosphateMerck1.05108.0500
Protein Assay Dye Reagent ConcentrateBioRad500-0006
See-saw rockerStuartSSL4
Serological pipetteNest3260015 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile
Sodium chlorideSigma-Aldrich7647-14-5
Sodium phosphate dibasicMerck1.06346.1000
Solvent inlet filterAgilent Technologies5041-2168glass filter, 20 μm pore size
Solvent reservoir (for LC-MS)Agilent Technologies9301-65241 L, clear glass
Solvent reservoir (for LC-MS)Agilent Technologies9301-65261 L, amber glass
Spreadsheet programMicrosoft OfficeMicrosoft Office Excel
Stir barBionovo6-2003teflon coated
Syringe filters for culture medium filtrationBionovo7-8803regenerated cellulose, Ø 30 mm, 0,45 µm
Syringe filters for mobile phase components filtrationBionovo6-0018nylon, Ø 30 mm, 0,22 µm
Tissue culture platesVWR10062-90096-wells, sterille
Trypsin-EDTA SolutionSigma-AldrihT4049-100 mL
Ultra-High Performance Liquid Chromatography systemAgilent TechnologiesG1367D, G1379B, G1312B, G1316C1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C)
Ultrasound bathPolsonic104533model 6D
VortexBiosanmodel V-1 plus
Xanthurenic acidSigma-AldrichD12080496%

Referencias

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