JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول استنساخ وتوسيع الخلايا التائية التنظيمية البشرية لتوليد Treg بشري عالي النقاء قابل للحياة مع إزالة ميثيل مستقرة في المنطقة المنزوعة الميثيل الخاصة ب Treg (TSDR) وميزات النمط الظاهري الخاصة ب Treg.

Abstract

من المعروف أن الخلايا التائية التنظيمية البشرية (Treg) يصعب عزلها بدرجة نقاء عالية نظرا للطرق الحالية لتخصيب Treg. تعتمد هذه الطرق على تحديد Treg من خلال العديد من علامات السطح الخلوي المعتمدة على التنشيط بمستويات تعبير متفاوتة في ظروف فسيولوجية ومرضية مختلفة. لذلك غالبا ما تحتوي المجموعات المعزولة باسم "Treg" على أعداد كبيرة من الخلايا المستجيبة غير Treg (أي Teff) التي تعيق التوصيف الدقيق للنمط الظاهري والوظيفي لهذه الخلايا ، وتوصيفها الجيني والبروتيني ، وتعددها الموثوق به في حالات مختلفة من الصحة والمرض ، فضلا عن عزلها وتوسعها للأغراض العلاجية. هذا الأخير ، على وجه الخصوص ، لا يزال يمثل عقبة رئيسية ، حيث أن التوسع غير المقصود للخلايا المستجيبة الموجهة في المقصورات الخلوية ذات الصلة ب Treg (على سبيل المثال ، الخلايا التائية CD4 + CD25 + ) قد يجعل العلاج المناعي القائم على Treg غير فعال ، أو حتى ضارا. يقدم هذا العمل طريقة تتحايل على المشاكل المرتبطة بالعزلة السكانية والتوسع في Treg وتظهر أن توليد المستنسخة المرشحة Treg مع الاختيار اللاحق والثقافة والتوسع في الخلايا أحادية النسيلة التي تم فحصها بعناية فقط ، يتيح توليد منتج خلية Treg فائق النقاء يمكن الاحتفاظ به في الثقافة لعدة أشهر ، تمكين التحقيق في نهاية المطاف لهذه الخلايا ، بما في ذلك التطبيقات العلاجية المحتملة.

Introduction

الغرض من هذا البروتوكول هو تمكين الانتشار في المختبر للنقاء الفائق ، Treg البشري النسيل. يسمح عزل المجموعات السكانية المخصبة ب Treg والاستنساخ اللاحق باختيار الأنماط الظاهرية المرغوبة من Treg وتوسعها لمزيد من الدراسة لبيولوجيا هذه الخلايا ، واستكشاف فائدتها العلاجية المحتملة ، وغيرها من التطبيقات التجريبية في المصب.

سينتج عن استنساخ Treg نقاء Treg أفضل بكثير من مناهج العزل والتوسع متعددة النسيحة. ويرجع ذلك إلى الاستبعاد الموثوق به والخاضع للرقابة لخلايا المستجيب التائية ذات الأنماط الظاهرية المتشابهة أو المختلفة من السكان المنقاة ، بما في ذلك التعبير عن FOXP3 (FOXP3intCD45RAnegCD25int) non-Treg و CD4 + CD25 + FOXP3- Teff1 ، من بين أمور أخرى. لا تواجه خطوط الخلايا النسيلية التي تم الحصول عليها من خلال هذا النهج مشكلة فرط النمو مع استنساخ غير Treg سريع التوسع والذي يجعل التوسع طويل المدى (أي عدة أشهر) والثقافة المختبرية للخلايا مستحيلة عمليا أو على الأقل صعبة للغاية. يسمح Clonal Treg أيضا بفحص شامل لميزاته المظهرية بعد التوسع ، بما في ذلك من خلال الطرق المعترف بها كمعيار لتقييم السمات اللاجينية التي تدل على حسن نية الإنسان الطبيعيTreg 1،2،3،4 (على سبيل المثال ، إزالة الميثيل المستقرة في TSDR).

تم إجراء توسيع Treg بشكل أساسي في شكل توسيع الخلايا متعددة النسيلة للأغراض الاستقصائية والعلاجية5،6،7. تعد مشاكل تلوث Teff عقبة رئيسية أمام التنفيذ الناجح لنهج العلاج المناعي القائم على خلايا Treg. المحاولات السابقة لتوسيع / توليد Treg أحادي النسيلة في الأدبيات نادرة وفشلت في إظهار الحفاظ على ميزات Treg على المدى الطويل8.

ستكون هذه الطريقة ذات أهمية لأي شخص يدرس الخصائص الخلوية والجزيئية والتمثيل الغذائي للإنسان حسن النية . منتج Treg فائق النقاء الذي تم إنشاؤه من خلال استخدام هذا البروتوكول على وجه الخصوص يفسح المجال للتحليلات باستخدام الأساليب الجينومية. نظرا لمعدلات التوسع المنخفضة نسبيا التي تميز Treg البشري بشكل عام ، قد تكون هذه الطريقة ذات فائدة محدودة لأولئك الذين يسعون إلى التوسع السريع لأعداد هائلة من الخلايا. ومع ذلك ، نظرا للنقاء العالي للغاية ل Treg الذي تم إنشاؤه باستخدام هذا البروتوكول ، قد يكون لأعداد أصغر من Treg فعالية مماثلة أو حتى أفضل من التوسعات الأكبر لخطوط الخلايا متعددة النسيلة التي تحتوي على خلايا مستجيبة تحد من الإمكانات القمعية الإجمالية للمنتج الذي تم إنشاؤه.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

يتبع هذا البروتوكول جميع المبادئ التوجيهية المؤسسية المتعلقة بالسلوك الأخلاقي للبحث الذي ينطوي على استخدام عينات بشرية. يجب أن يتم العمل مع الخلايا البشرية ومنتجات الدم البشرية الأخرى على الأقل في بيئة معتمدة من BSL-2 وفقا لإرشادات السلامة BLS-2 كحد أدنى.

1. التخصيب المسبق لخلايا الدم المحيطي البشرية أحادية النواةلخلايا CD4 + CD127loCD25 hi

تنبيه: استخدم تقنية معقمة طوال الوقت. تخلص من الأدوات الحادة على الفور في حاوية أدوات حادة مناسبة. قم بتبييض أي شيء لامس الدم و / أو منتجات الدم قبل التخلص منه. العمل في خزانة السلامة البيولوجية.

  1. الحصول على الدم المحيطي البشري أو منتجات الدم المخصبة مسبقا للكريات البيض البشرية (أي "الطلاوة") من سحب الدم المحيطي أو فصادة الكريات البيضاء. معالجة الخلايا على الفور.
    ملاحظة: إذا تعذر تجنب التخزين طوال الليل ، فقم بتخزين الخلايا ونقلها في درجة حرارة الغرفة (RT). تجنب التعرض للبرد.
  2. عزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) عن طريق الطرد المركزي المتدرج فوق وسط تدرج الكثافة كما هو موضحسابقا 9.
  3. عد PBMCs بعناية باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا. إذا أمكن ، استخدم ما لا يقل عن 300 × 106 PBMC لمتابعة عزل Treg.
  4. أعد تعليق PBMCs في المخزن المؤقت المعزول (2٪ مصل AB البشري المجمع [PHS-AB] مع 1.5 ملي مولار EDTA في محلول ملحي مخزن بالفوسفات [PBS]) بتركيز 50 × 106 خلايا / مل واستمر في الفرز المغناطيسي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لمجموعة الفرز المستخدمة. على سبيل المثال ، استخدم فرز الخلايا المغناطيسية (جدول المواد) للعزل السلبي لمجموعة الخلايا التائية CD4 + CD127lo ، متبوعا بفرز الاختيار الإيجابي لخلايا CD25 + .
    ملاحظة: يمكن استخدام مجموعة متنوعة من المنتجات للتنقية المغناطيسية ل Treg ، بما في ذلك الأساليب القائمة على الأعمدة والخالية من الأعمدة. بدلا من ذلك ، يمكن إجراء فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) مع البوابات على خلايا CD127loCD25عالية CD4 + T ومع ذلك ، فإن العقم الكامل غير ممكن مع معدات FACS القياسية ، مما يشكل خطرا كبيرا للتلوث. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن استبعاد الإجهاد الخلوي والضرر الناجم عن نظام السوائل ، وقد يؤثر ليزر الجهاز على النتائج.
  5. تحقق من السكان المخصبين ب Treg الناتج للتأكد من نقائهم من خلال تلطيخ CD4 و CD3 و CD127 و CD25 (الشكل 1). اختر جسما مضادا ل CD25 مضادا للإنسان يتعرف على مجال ربط CD25 مختلف عن المجال المستخدم في مجموعة الفرز ، مثل العنصر المحدد في جدول المواد ، للحصول على نتيجة دقيقة. تلطيخ الخلايا وإصلاحها باستخدام بروتوكول تلطيخ السطح القياسي مثل ذلك الموصوف في Nowatzky et al.10.

2. استنساخ Treg من CD127loCD25مرحبا معلق الخلايا التائية البشرية CD4 + T

  1. إعادة تعليق الخلايا المخصبة ب Treg (CD4 + CD127loCD25hi) التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.4 في وسائط الخلايا التائية ([TCM] ؛ RPMI 1640 ، 5٪ PHS-AB ، 1٪ ستربتومايسين / بنسلين ، 1٪ هيبيس ، 1٪ أحماض أمينية غير أساسية ، و 1٪ جلوتامين) مع 300 وحدة دولية / مل من الإنترلوكين المؤتلف البشري 2 (IL-2) (جدول المواد) بهدف تركيز ~ 1-3 × 106 خلايا / مل والعد. احصل على ثلاث أعداد منفصلة على الأقل من الخلايا واحسب متوسط أعداد الخلايا قبل المتابعة لأن التعداد الدقيق أمر بالغ الأهمية.
  2. قم بإعداد معلق خلية واحدة من الخلايا بتركيزين: (1) 3 خلايا / مل ، و (2) 6 خلايا / مل. قم بتحميل خمس ألواح بئر مستديرة القاع 96 مع 100 ميكرولتر / بئر من التعليق 1 ، وخمس ألواح مع تعليق 2. احرص بشدة على إبقاء الخلايا معلقة عند تحميل الألواح لضمان توزيع 0.3 و 0.6 خلية / بئر ، على التوالي.
    ملاحظة: لا تزيد تركيز الخلية إلى خلية واحدة / بئر ، لأن هذا يزيد من خطر الحصول على خطوط الخلايا قليلة النسيلة وليس المستنسخة الحقيقية.
  3. قم بإعداد الخلايا المغذية من PBMCs الخيفية البشرية المعزولة حديثا التي تم الحصول عليها من خلال الطرد المركزي المتدرج للكثافة كما في الخطوة 1.2.
  4. قم بإعداد ما لا يقل عن 10 × 106 خلايا مغذية لكل لوحة استنساخ للإشعاع عن طريق تعليق PBMCs الخيفية البشرية في الطب الصيني التقليدي بدون IL-2 في أنبوب بولي بروبيلين سعة 50 مل بتركيز ~ 10 ×10 6 PBMC / مل. أغلق الأنبوب بإحكام وقم بإشعاعه باستخدام 35 غراي إما في جهاز تشعيع جاما أو جهاز تشعيع قائم على الأشعة السينية.
    ملاحظة: يؤدي التشعيع إلى إفراز كميات كبيرة من السيتوكينات من المغذيات التي تسهل تكاثر التيف ، ولكنها قد تؤثر سلبا على توسع Treg. سيتم إزالتها بعد ذلك عن طريق الغسيل.
  5. خلايا الطرد المركزي عند 450 × جم و RT لمدة 5 دقائق بعد التشعيع ، وشفط المادة الطافية. اغسل الخلايا عن طريق تعليقها في الطب الصيني التقليدي بدون IL-2 باستخدام ما لا يقل عن 10 أضعاف حجم خلية التغذية المحببة للوسائط / PBS.
    ملاحظة: يوصى بتحديد ملف تعريف تعبير مستضد الكريات البيض البشري (HLA) للخلايا المانحة المراد استنساخها. يمكن القيام بذلك من خلال تلطيخ بسيط لواحد أو عدة أنواع من أنواع HLA الشائعة بين السكان الذين يشتق منها المتبرع المعني (على سبيل المثال ، HLA-A2 أو HLA-A24). يجب ألا يعبر PBMC المستخدم كخلايا مغذية عن HLA هذا لتمكين إعادة تحديد / عزل الخلايا المستهدفة من مزارع التمدد قبل موت الخلايا المبرمج الناجم عن الإشعاع للمغذيات.
  6. أعد تعليق الخلايا المغذية المشععة والمغسولة في الطب الصيني التقليدي ب 300 وحدة دولية / مل IL-2 بتركيز 1 × 106 خلايا / مل.
  7. أضف phytohemagglutinin-L (PHA-L) (جدول المواد) بتركيز 4 ميكروغرام / مل (2 ضعف التركيز المطلوب في المزرعة) وانتقل بسرعة إلى الخطوة 2.8.
  8. أضف 100,000 خلية تغذية مشعة في 100 ميكرولتر من الطب الصيني التقليدي مع 4 ميكروغرام / مل PHA-L و 300 وحدة دولية / مل IL-2 إلى الخلايا المخصبة ب Treg المطلية ، مما ينتج عنه حجم إجمالي يبلغ 200 ميكرولتر وتركيز PHA-L يبلغ 2 ميكروغرام / مل في كل بئر. تخلط جيدا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل 5 مرات. قلل من وقت تعرض خلايا التغذية إلى PHA-L قبل إضافتها إلى Treg إلى الحد الأدنى المطلق اللازم ، واحتفظ بها في حالة تعليق حتى يتم طلاؤها.
    ملاحظة: تأكد من تركيز PHA-L يبلغ 2 ميكروغرام / مل في المزرعة في خطوة البذر الأولية ، ولكن استخدم تركيزا أقل ، 1 ميكروغرام / مل عند التوسع اللاحق في استنساخ Treg. استخدم 300 وحدة دولية / مل من IL-2 طوال الوقت.
  9. احتضان عند 37 درجة مئوية. قم بتغيير 50٪ من الوسائط باستخدام الطب الصيني التقليدي باستخدام 300 وحدة دولية/مل IL-2 ولكن بدون PHA-L في الأيام 5-7.

3. توسيع Treg والحفاظ على المستنسخة في الثقافة

  1. ابتداء من اليوم 12 ، تحقق من الثقافات بحثا عن وجود حبيبات الخلايا المتكاثرة.
    ملاحظة: ستكون هناك كريات تتكون من الخلايا المغذية ، ولكن عند الفحص المجهري ستظهر هذه الخلايا كخلايا صغيرة أو مستديرة أو محتضرة أو ميتة ، في حين أن الخلايا التائية المتكاثرة ستكون أكبر حجما ، مع تباين ساطع ومظهر صحي ، وغالبا ما تشكل مجموعات من الخلايا المجاورة التي تظهر بنية اللون في الفحص العياني
  2. استمر في فحص الثقافات كل 1-2 أيام. عزل المستنسخة المؤقتة المتكاثرة عن طريق نقلها إلى آبار مفردة. ضع كل استنساخ مؤقت على صفيحة واحدة 96 بئر لتجنب التلوث المتبادل لأي استنساخ مؤقت أو ثابت على الرغم من نقل الخلايا غير المقصود من الآبار الأخرى.
  3. حافظ على الخلايا من خلال 50٪ من الوسائط التي تتغير كل 2-3 أيام وانقسمها حسب الضرورة. راقب الخلايا عن كثب.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي تأخير تغييرات الوسائط والانقسام إلى إلحاق الضرر بالخلايا ويمكن أن يؤدي "الانقسام المفرط" إلى إيقاف تكاثرها ويؤدي إلى موت الخلايا.
  4. إعادة تحفيز الخلايا بمغذيات خيفية مشعة كما هو موضح في الخطوات 2.3-2.9 ، ولكن استخدم تركيزات أقل من PHA-L (أي 1 ميكروغرام / مل في الطب الصيني التقليدي مع 300 وحدة دولية / مل IL-2). أعد التحفيز عندما ينخفض حجم الخلية وتصبح الخلايا مستديرة بدلا من الشكل البيضاوي الممدود الذي يحدث عادة بعد 2-3 أسابيع.
    ملاحظة: الحفاظ على مزرعة الاستنساخ الأصلية لمدة 6-8 أسابيع على الأقل. تميل العديد من المستنسخة "المبكرة" التي تصبح مرئية في أو بعد أسبوعين بقليل إلى أن تكون غير حقيقية ، ولكنها تتكاثر بسرعة الخلايا غير Treg / Teff ومن المرجح أن تفشل في التدقيق أكثر من الخلايا "المتأخرة" ، والتي سيستغرق بعضها أكثر من شهر واحد لتظهر بشكل واضح في الثقافة.

4. فحص استنساخ Treg المبدئي

  1. ابدأ في فحص المستنسخة المبدئية بمجرد تكاثرها إلى ~ 1 × 106 خلايا من أجل أحادية النسيلة وحالة مثيلة TSDR.
  2. اختياريا ، توسعات الخلايا قبل الغربلة عن طريق تلطيخ CD3 و CD4 و CD127 و CD25 من أجل تحديد تلك التي تهمك (على سبيل المثال ، CD3 + CD4 + CD127loCD25hi) لمزيد من التقييم (الشكل 2).
  3. إنشاء أحادية النسيلة من خلال تحديد وجود سلسلة Vβ واحدة في المنتج الخلوي عن طريق تلطيخ Vβ باستخدام مجموعات من الأجسام المضادة للتلطيخ المتاحة تجاريا (جدول المواد ؛ الشكل 3) اتباع تعليمات الشركة المصنعة. تأكد من الحصول على ما لا يقل عن 1 × 106 أحداث عند تشغيل العينات على مقياس التدفق الخلوي لإجراء تحليل موثوق به ، بحيث يمكن اكتشاف المجموعات الملوثة الطفيفة. استخدم صبغة قابلة للحياة.
  4. لديك حالة مثيلة TSDR في موضع FOXP3 الذي تم تقييمه من قبل مقدمي الخدمات التجاريين أوداخليا 11،12. احصل على ما لا يقل عن 1 × 105 خلايا للحصول على نتائج مناسبة.
  5. بمجرد تأكيد هوية Treg واستنساخها في الخطوتين 4.3 و 4.4 ، قم بالحفاظ على الخلايا بالتبريد أو استخدامها في التطبيقات النهائية.
    ملاحظة: تحدد مناهج التدقيق البديلة ، ولكن الأقل موثوقية ، النمط الظاهري Treg عن طريق صبغات FACS1،10 وفحوصات قمع في المختبر أو في الجسم الحي13،14. تجنب الاعتماد المفرط على فحوصات قمع Treg13. تعتمد المقايسات عادة ، ولكن ليس حصريا ، على الزراعة المشتركة ل Treg بأعداد متدرجة مع الخلايا التائية المستجيبة (أي PBMC أو الخلايا التائية المنقاة ، وأحيانا مستنفدة من Treg) في وجود خلايا مقدمة لمستضد طرف ثالث أو CD3 / CD28 مع تخفيف الصبغة الذي يمثل التكاثر كقراءة. العديد من هذه المقايسات لها قيود شديدة وقد تبالغ أو تقلل من تقدير الدرجة الفعلية للقمع بوساطة Treg. تظل حالة مثيلة TSDR هي المقياس الأكثر تحديدا / موثوقية للنمط الظاهري Treg أو "الهوية"3،15،16. لاحظ أن FOXP3 يقع على الكروموسوم X ، وفي الإناث ، يتم تعطيل كروموسوم X واحد عن طريق مثيلة الحمض النووي ، مما يؤثر على نتائج تحليل مثيلة TSDR.

5. الحفظ بالتبريد من Treg

ملاحظة: يمكن تخزين Treg على المدى الطويل بعد الحفظ بالتبريد الناجح باستخدام DMSO و PHS-AB.

  1. تحديد عدد المبردات المطلوبة لحفظ الخلايا بالتبريد. هذا يساوي الحجم النهائي الكلي لتعليق الخلية (بالمل) المراد حفظه بالتبريد ، لأنه يتم تجميد 1 مل لكل قارورة. أضف هامش أمان بنسبة 10٪ إلى هذا الحجم لحساب الخسائر الناجمة عن سحب العينات/التوتر السطحي.
    ملاحظة: يمكن حفظ الخلايا بالتبريد بمجموعة واسعة من التركيزات ، عادة ما بين 0.1-100 × 106 خلايا / مل.
  2. قم بتسمية cryovials.
  3. توليد الحل A (SA): امزج 50٪ RPMI و 50٪ PHS-AB أو البلازما البشرية. إذا تم استخدام البلازما ، فقم بالدوران عند 2,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يجب أن يكون حجم SA 75٪ من الحجم النهائي الكلي لتعليق الخلية المراد حفظه بالتبريد على النحو المحدد في الخطوة 5.1.
  4. توليد الحل B (SB): امزج 60٪ (حجم / حجم) PBS أو RPMI و 40٪ (حجم / حجم) ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
    ملاحظة: يجب أن يكون حجم SB 25٪ من الحجم النهائي الكلي لتعليق الخلية المراد حفظه بالتبريد كما هو محدد في الخطوة 5.1.
  5. قم بتبريد كلا المحاللين إلى 4 درجات مئوية.
  6. تحضير وسط التجميد عن طريق خلط كل SB مع أجزاء متساوية من SA واحتفظ بها على الجليد.
  7. قم بتدوير Treg من الخطوة 4.5 عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بشفط الوسائط والتخلص منها ، وأعد تعليق الخلايا في SA المثلج المتبقي واستمر في وضع الثلج.
  8. أضف ببطء وسط التجميد المبرد 1: 1 إلى الخلايا المعلقة في SA في أنبوب كبير على الجليد أثناء هز الأنبوب.
  9. قم بتقطيعه بسرعة إلى cryovials عند 1 مل / قارورة. ضع المبردات على الفور في صندوق خزانة في RT وانقلها إلى فريزر -80 درجة مئوية دون تأخير. نقل إلى السائل N2 بعد 24 ساعة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

سيؤدي التنفيذ الناجح لهذا البروتوكول إلى توليد استنساخ وخطوط مستقرة للخلايا التائية التنظيمية البشرية.

كان الاختيار المسبق / التخصيب المسبق للخلاياالمصاحبة CD4 + CD127loCD25 طريقة مباشرة للحصول على مجموعة أولية تحتوي على معظم البشر Treg (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يصف هذا البروتوكول انتشار الخلايا التائية التنظيمية البشرية فائقة النقاء من خلال عزل الخلايا التي تم الحصول عليها في نهج التخفيف المحدود والتوسع القائم على الخلايا المغذية من مجموعات البداية المحتوية على Treg.

الخطوات الحاسمة في هذا النهج هي: 1) اختيار مجم?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا المشروع من قبل المعهد الوطني للعيون التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم K08EY025324 (Nowatzky) وجائزة Colton Scholar من مركز جوديث وستيوارت كولتون للمناعة الذاتية (Nowatzky).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm Stericup, 500 mLMillipore5500Media storage and preparation
100x Nonessential amino acidsGibco11140-050Media component
15 mL conical centrifuge tubes (50/bag, case of 500)ThermoFisher Scientific339650
1M HEPESGibco15630-080Media component
25 ml Single Well Pipet BasinFischer Scientific13-681-508
50 mL Conical Centrifuge Tube (25/sleeve)ThermoFisher Scientific339652
50x Penicillin Streptomycin SolnCorningCorning, 30-001-ClMedia component
CryoTube Vial Int Thread Round Btm Starfoot PP Screw Stopper Sterile PP 1.8 mLNalge Nunc377267
DMSOCorning25-950-CQC
EasySep Human CD25 positive selection kitStemcell Technologies18231Alternatives are FACS or MACS column-based sorting
EasySep Human CD4+CD127low T cell Pre-Enrichment KitStemcell Technologies19231Alternatives are FACS or MACS column-based sorting
EasySep Human CD4+CD127lowCD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit (alternative to item 12)Stemcell Technologies18063Alternatives are FACS or MACS column-based sorting
FicollGE Healthcare17-5442-03PBMC purification from peripheral blood of leukapheresis products; density gradient medium
Human AB Serum (PHS-AB)Valley Biomedical IncHP1022Media component
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitationThermo FischerL-34962Viability dye
Phytohemagglutinin-L (PHA-L)Millipore/Sigma11249738001T cell stimulation
Recombinant IL-2 (e.g., PROLEUKINâ)PrometheusT cell stimulation and maintenance/ Media component
RPMI 1640Gibco21870-076Media component
Staining antibodies for flowcytometry (Treg phenotyping)See "Comments"See "Comments"Staining antibodies are enlisted in: Nowatzky et al. (2019) PubMed PMID: 30584695; PubMed Central PMCID: PMC6497402. In case EasySep Human CD25 positive selection kit is used, stain with 2A3 or BC96 anti-CD25 antibody, e.g.: Brilliant Violet 421 anti-human CD25 Antibody (Biolegend; 302629)
TCR Vβ Repertoire Kit; IOTest Beta MarkBeckman CoulterPN IM3497Vetting of expansions for monoclonality
Tissue Culture Plate, 96 Well, U-Bottom with Low Evaporation LidCorning353077

References

  1. Miyara, M., et al. Functional delineation and differentiation dynamics of human CD4+ T cells expressing the FoxP3 transcription factor. Immunity. 30 (6), 899-911 (2009).
  2. Polansky, J. K., et al. DNA methylation controls Foxp3 gene expression. European Journal of Immunology. 38 (6), 1654-1663 (2008).
  3. Toker, A., et al. Active demethylation of the Foxp3 locus leads to the generation of stable regulatory T cells within the thymus. The Journal of Immunology. 190 (7), 3180-3188 (2013).
  4. Garg, G., et al. Blimp1 Prevents Methylation of Foxp3 and Loss of Regulatory T Cell Identity at Sites of Inflammation. Cell Reports. 26 (7), 1854-1868 (2019).
  5. Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117 (3), 1061-1070 (2011).
  6. Hippen, K. L., et al. Massive ex vivo expansion of human natural regulatory T cells (T(regs)) with minimal loss of in vivo functional activity. Science Translational Medicine. 3 (83), 41(2011).
  7. Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Translational Medicine. 7 (315), 189(2015).
  8. Dromey, J. A., et al. Generation and expansion of regulatory human CD4(+) T-cell clones specific for pancreatic islet autoantigens. Journal of Autoimmunity. 36 (1), 47-55 (2011).
  9. Sabado, R. L., et al. Preparation of tumor antigen-loaded mature dendritic cells for immunotherapy. Journal of Visual Experiments. (78), e50085(2013).
  10. Nowatzky, J., Stagnar, C., Manches, O. OMIP-053: Identification, Classification, and Isolation of Major FoxP3 Expressing Human CD4(+) Treg Subsets. Cytometry A. 95 (3), 264-267 (2019).
  11. Zhang, Y., et al. Genome-wide DNA methylation analysis identifies hypomethylated genes regulated by FOXP3 in human regulatory T cells. Blood. 122 (16), 2823-2836 (2013).
  12. Spreafico, R., et al. A sensitive protocol for FOXP3 epigenetic analysis in scarce human samples. European Journal of Immunology. 44 (10), 3141-3143 (2014).
  13. Collison, L. W., Vignali, D. A. In vitro Treg suppression assays. Methods in Molecular Biology. 707, 21-37 (2011).
  14. Workman, C. J., et al. In vivo Treg suppression assays. Methods in Molecular Biology. 707, 119-156 (2011).
  15. Feng, Y., et al. Control of the inheritance of regulatory T cell identity by a cis element in the Foxp3 locus. Cell. 158 (4), 749-763 (2014).
  16. Toker, A., Huehn, J. To be or not to be a Treg cell: lineage decisions controlled by epigenetic mechanisms. Science Signaling. 4 (158), 4(2011).
  17. Liu, W., et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. Journal of Experimental Medicine. 203 (7), 1701-1711 (2006).
  18. Fuhrman, C. A., et al. Divergent Phenotypes of Human Regulatory T Cells Expressing the Receptors TIGIT and CD226. The Journal of Immunology. 195 (1), 145-155 (2015).
  19. Gu, J., et al. Human CD39(hi) regulatory T cells present stronger stability and function under inflammatory conditions. Cellular & Molecular Immunology. 14 (6), 521-528 (2017).
  20. Genevee, C., et al. An experimentally validated panel of subfamily-specific oligonucleotide primers (V alpha 1-w29/V beta 1-w24) for the study of human T cell receptor variable V gene segment usage by polymerase chain reaction. European Journal of Immunology. 22 (5), 1261-1269 (1992).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Treg Treg Treg Treg

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved