ヒト制御性T細胞クローンの作製

要約

このプロトコルはTreg特異的なdemethylated領域（TSDR)およびTreg特異的表現型の特徴で安定したdemethylationの超高純度の生存可能な人間のTregの生成のための人間の制御性T細胞のクローニングそして拡大を記述する。

要約

ヒト制御性T細胞(Treg)は、現在のTreg濃縮方法を考えると、高純度で単離することが難しいことで有名です。これらの方法は、さまざまな生理学的および病理学的条件でさまざまな発現レベルを持ついくつかの活性化依存性細胞表面マーカーによるTregの同定に基づいています。したがって、「Treg」として単離された集団は、多くの場合、かなりの数の非Tregエフェクター細胞(すなわち、Teff)を含み、これらの細胞の正確な表現型および機能的特性評価、それらのゲノムおよびプロテオミクス特性評価、さまざまな健康状態および疾患状態におけるそれらの信頼性の高い列挙、ならびに治療目的でのそれらの単離および拡大を妨げる。特に後者は、Tregに関連する細胞コンパートメント(CD4⁺CD25⁺ T細胞など)にホーミングするエフェクター細胞の不注意な増殖により、Tregベースの免疫療法が無効になるか、さらには有害になる可能性があるため、依然として大きなハードルとなっています。この研究は、集団ベースのTregの単離と増殖に関連する問題を回避する方法を提示し、Treg候補クローンの生成とその後の選択、培養、および慎重に吟味されたモノクローナル細胞のみの増殖により、何ヶ月も培養に保持できる超高純度のTreg細胞製品の生成が可能になることを示しています。 これらの細胞の下流での研究を可能にし、治療用途の可能性も含めて。

概要

このプロトコールの目的は、超高純度のクローン性ヒトTregのin vitro増殖を可能にすることです。Tregが豊富な集団の単離とその後のクローニングにより、これらの細胞の生物学のさらなる研究、それらの潜在的な治療的有用性の探索、およびその他の実験的下流アプリケーションのための目的のTreg表現型の選択とその拡大が可能になります。

Tregのクローニングは、ポリクローナル単離および増殖アプローチよりも大幅に優れたTreg純度をもたらします。これは、FOXP3発現(FOXP3^intCD45RA^negCD25^int)非TregおよびCD4⁺ CD25⁺ FOXP3^- Teff¹などを含む、精製された集団から類似または異なる表現型を持つTエフェクター細胞を信頼性があり、制御された排除するためです。このアプローチで得られたクローン細胞株は、非常に長期的(すなわち、数ヶ月)の細胞の増殖およびin vitro培養を実質的に不可能または少なくとも非常に困難にする、急速に拡大する非Tregクローンによる過剰増殖の問題に直面しません。Clonal Tregは、ヒトの真正な自然Treg ^1,2,3,4を示すエピジェネティックな特徴の評価の標準として認められている方法(例えば、TSDRでの安定した脱メチル化)などを通じて、拡張後の表現型の特徴を広範囲に精査することもできます。

Tregの増殖は、主に^{研究目的と}治療目的の両方のためにポリクローナル細胞の増殖の形で行われてきた^5,6,7。Teff汚染の問題は、Treg細胞ベースの免疫療法アプローチを成功させるための大きな障害です。文献でモノクローナルTregを拡大/生成する以前の試みは少なく、長期的にTregの特徴の維持を示すことができません^でした8。

この方法は、 真正な ヒトTregの細胞、分子、および代謝特性を研究するすべての人にとって興味深いものです。特に、このプロトコルを使用して生成された超高純度Treg生成物は、ゲノムアプローチを使用した解析に適しています。一般にヒトTregを特徴付ける比較的低い増殖率を考えると、この方法は、大量の細胞の急速な増殖を求める人々にとっては限定的な有用性を有する可能性があります。しかし、このプロトコールで生成されたTregの純度が非常に高いことを考えると、生成された生成物の全体的な抑制可能性を制限するエフェクター細胞を含むポリクローナル細胞株の大規模な増殖よりも、少数のTregが同等またはそれ以上の有効性を有する可能性があります。

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プロトコル

このプロトコルは、ヒトサンプルの使用を含む研究の倫理的実施に関連するすべての機関ガイドラインに準拠しています。ヒト細胞やその他のヒト血液製剤の取り扱いは、少なくともBLS-2安全ガイドラインに従って、少なくともBSL-2認定環境で行う必要があります。

1. CD4⁺CD127^loCD25^hi 細胞に対するヒト末梢血単核細胞の濃縮

注意:全体を通して滅菌技術を使用してください。鋭利物は直ちに適切な鋭利物容器に廃棄してください。廃棄する前に、血液および/または血液製剤と接触したものを漂白します。バイオセーフティキャビネットで作業します。

1. ヒト末梢血またはヒト白血球用に事前に濃縮された血液製剤(すなわち、「ロイコパック」)を末梢採または白血球交換から入手します。セルをすぐに処理します。
   注:夜間の保管が避けられない場合は、細胞を室温(RT)で保管および輸送してください。寒さにさらされないようにしてください。
2. 前^述したように、密度勾配培地上の勾配遠心分離により末梢血単核細胞(PBMC)を単離する9。
3. 血球計算盤またはセルカウンターを使用してPBMCを慎重にカウントします。可能であれば、少なくとも 300 x 10⁶ PBMC を使用して Treg 分離を続行します。
4. PBMCを50 x 10⁶細胞/mLの濃度で分離バッファー(2%プールされたヒトAB血清[PHS-AB]と1.5 mM EDTAのリン酸緩衝生理食塩水[PBS])に再懸濁し、使用したソーティングキットの製造元の指示に従って磁気ソーティングを進めます。例えば、CD4⁺CD127^lo T細胞集団のネガティブ単離には磁気セルソーティング(材料表)を使用し、続いてCD25⁺細胞のポジティブセレクションソーティングを使用します。
   注:Tregの磁気精製には、カラムベースおよびカラムフリーアプローチなど、さまざまな製品を使用できます。あるいは、CD127^loCD25^高 CD4⁺ T細胞に対するゲーティングを用いた蛍光活性化細胞選別(FACS)を行い得る。しかし、標準的なFACS装置では完全な無菌性は不可能であり、汚染の重大なリスクをもたらします。さらに、流路系によってもたらされる細胞のストレスや損傷を排除することはできず、装置のレーザーが結果に影響を与える可能性があります。
5. 得られたTregが豊富な集団の純度を、CD4、CD3、CD127、およびCD25の染色を通じて確認します(図1)。正確な結果を得るためには、ソーティングキットに使用されているものとは異なるCD25結合ドメインを認識する抗ヒトCD25抗体を選択してください。Nowatzky et ^al.10に記載されているような標準的な表面染色プロトコルを使用して、細胞を染色および固定します。

2. CD127^loCD25^hi プリエンリッチヒトCD4⁺ T細胞懸濁液からのTregのクローニング

1. ステップ1.4で得られたTreg濃縮(CD4⁺CD127^loCD25^hi)細胞をT細胞培地([TCM];RPMI 1640、5% PHS-AB、1% ストレプトマイシン/ペニシリン、1% HEPES、1% 非必須アミノ酸、および 1% グルタミン) と 300 IU/mL のヒト組換えインターロイキン-2 (IL-2) (材料表) ~1-3 x 10⁶ 細胞/mL の濃度を目指してカウントします。正確なカウントが絶対に重要であるため、先に進む前に、少なくとも 3 つの個別のセル カウントを取得し、平均セル数を計算します。
2. (1)3細胞/mL、および(2)6細胞/mLの2つの濃度で細胞の単一細胞懸濁液を調製します。丸底96ウェルプレート5枚に懸濁液100μL/ウェルを、懸濁液2を5枚ロードします。プレートをロードする際には、細胞を懸濁状態に保つように細心の注意を払い、それぞれ0.3細胞/ウェルと0.6細胞/ウェルの分布を確保してください。
   注:細胞濃度を1細胞/ウェルに増やさないでください、これは、真のクローンではなくオリゴクローナル細胞株を取得するリスクを高めるためです。
3. ステップ1.2のように密度勾配遠心分離によって得られた新たに単離されたヒト同種PBMCからフィーダー細胞を調製します。
4. IL-2を含まないTCM中のヒト同種PBMCを50mLのポリプロピレンチューブに~10 x 10⁶ PBMC/mLの濃度で再懸濁することにより、クローニングプレートごとに少なくとも10 x 10⁶フィーダー細胞を照射用に調製します。チューブをしっかりと閉じ、ガンマ線照射器またはX線照射装置で35Gyを照射します。
   注:放射線照射は、Teffの増殖を促進するフィーダーからの大量のサイトカインの分泌を引き起こしますが、Tregの増殖に悪影響を与える可能性があります。これらは次に洗濯によって取り除かれます。
5. 照射後、細胞を450 x g およびRTで5分間遠心分離し、上清を吸引します。IL-2を含まないTCMで細胞を再懸濁することにより、ペレット状のフィーダーセルの培地/PBSの体積の少なくとも10倍を使用して細胞を洗浄します。
   注:クローニングするドナー細胞のヒト白血球抗原(HLA)発現プロファイルを決定することをお勧めします。これは、それぞれのドナーが由来する集団(すなわち、HLA-A2またはHLA-A24)に共通する1つまたは複数のHLAタイプを簡易染色することで行うことができます。フィーダー細胞として使用されるPBMCは、フィーダーの照射誘発アポトーシスの前に、増殖培養物からの標的細胞の再同定/単離を可能にするために、このHLAを発現してはなりません。
6. 照射および洗浄したフィーダー細胞をTCMで300 IU/mL IL-2を用いて1 x 10⁶ 細胞/mLの濃度で再懸濁します。
7. フィトヘマグルチニン-L(PHA-L)(材料表)を4 μg/mL(培養に必要な濃度の2倍)の濃度で添加し、速やかにステップ2.8に進みます。
8. 100 μLのTCMに100,000個の照射フィーダー細胞を4 μg/mLのPHA-Lおよび300 IU/mLのIL-2を添加したTreg濃縮細胞に加えると、各ウェルの総容量は200 μL、PHA-L濃度は2 μg/mLになります。ピペッティングで5回上下させてよく混ぜます。フィーダーセルをTregに添加する前に、フィーダーセルのPHA-Lへの曝露時間を必要最小限に制限し、めっきされるまで懸濁状態に保ちます。
   注:最初の播種ステップでは、培養物中のPHA-L濃度が2 μg/mLであることを確認してくださいが、その後のTregクローンの増殖時には、より低い1 μg/mLの濃度を使用してください。全体に300 IU / mLのIL-2を使用します。.
9. 37°Cでインキュベートします。 5〜7日目に、300 IU/mL IL-2 を含む TCM を使用して培地の 50% を交換しますが、PHA-L は使用しません。

3. Tregの増殖と培養中のクローンの維持

1. 12日目から、増殖細胞のペレットの存在について培養物を確認します。
   注:フィーダー細胞によって形成されるペレットがありますが、顕微鏡検査では、それらは小さく、丸く、死にかけている、または死んだ細胞として現れますが、増殖するT細胞はサイズが大きく、明るいコントラストと健康な外観で、多くの場合、肉眼検査で茶色に見える隣接する細胞のクラスターを形成します。
2. 1〜2日ごとに培養物の検査を続けます。増殖する仮のクローンを単一のウェルに移すことにより、それらを単離します。各仮定義クローンを1つの96ウェルプレート上に配置して、他のウェルからの不注意による細胞移入による特定の仮定義または確立されたクローンの相互汚染を回避します。
3. 2〜3日ごとに50%の培地交換を通じて細胞を維持し、必要に応じて分割します。セルを綿密に監視します。
   注:培地の変更や分裂を遅らせると、細胞に害を及ぼす可能性があり、「過剰分裂」は細胞の増殖を停止し、細胞死につながる可能性があります。
4. ステップ2.3−2.9で説明したように、照射された同種フィーダーで細胞を再刺激しますが、より低いPHA-L濃度(すなわち、TCMで1μg/mLと300IU/mLのIL-2)を使用します。細胞サイズが小さくなり、細胞が丸くなると、通常は2〜3週間後に細長い楕円形になるときに再刺激します。
   注:元のクローニング培養物を少なくとも6〜8週間保持します。2週間後または2週間後に見えるようになる「初期」クローンの多くは、真のTregではなく、急速に増殖する非Treg/Teff細胞であり、「後期」細胞よりも審査に失敗する可能性が高く、中には培養物に目に見える形で現れるまでに1ヶ月以上かかるものもあります。

4. 暫定的なTregクローンの審査

1. 暫定的なクローンが~1 x 10⁶ 細胞に増殖したら、モノクローナリティとTSDRメチル化状態のスクリーニングを開始します。
2. 必要に応じて、CD3、CD4、CD127、およびCD25を染色して細胞増殖を事前にスクリーニングし、目的のもの(すなわち、CD3⁺CD4⁺CD127^loCD25^hi)を同定し、さらなる評価を行います(図2)。
3. 市販の染色抗体のセットを使用したVβ染色により、細胞産物中の単一のVβ鎖の存在を同定することにより、モノクローナリティを確立します(材料表; 図3)製造元の指示に従ってください。フローサイトメーターでサンプルを泳動する際には、信頼性の高い解析のために少なくとも1 x 10⁶ イベントを取得し、軽度の汚染集団を検出できるようにしてください。生存率染料を使用してください。
4. -FOXP3遺伝子座でのTSDRメチル化ステータスがあり、商用プロバイダーまたは社内によって評価されています^11,12。適切な結果を得るには、少なくとも1 x 10⁵セルを入手してください。
5. ステップ4.3および4.4でTregの同一性とクローン性を確認したら、細胞を凍結保存するか、ダウンストリームアプリケーションに使用できます。
   注:代替の、しかしはるかに信頼性の低い審査アプローチは、FACS染色^1,10およびin vitroまたはin vivo抑制アッセイ^13,14によってTreg表現型を決定することです。Treg抑制アッセイへの過度の依存を避ける¹³.アッセイは、典型的には、排他的ではありませんが、第三者の抗原提示細胞または増殖を表す色素希釈をリードアウトとしてCD3/CD28の存在下で、レスポンダーT細胞(すなわち、PBMCまたは精製T細胞、時にはTregが枯渇している)との段階的な数のTregの共培養に基づいています。これらのアッセイの多くには厳しい制限があり、Tregによって媒介される実際の抑制の程度を過大評価または過小評価する可能性があります。TSDRメチル化状態は、Treg表現型または「同一^性」3,15,16の最も明確で信頼性の高い尺度であり続けています。なお、FOXP3はX染色体上に位置し、女性では1本のX染色体がDNAメチル化によって不活性化され、これがTSDRメチル化解析の結果に影響を与える点に注目してください。

5. Tregの凍結保存

注:Tregは、DMSOおよびPHS-ABによる凍結保存が成功した後、長期保存することができます。

1. 細胞を凍結保存するために必要なクライオバイアルの数を決定します。これは、バイアルあたり1 mLが凍結されるため、凍結保存する細胞懸濁液の最終総量(mL単位)に等しくなります。ピペッティング/表面張力による損失を考慮するために、この容量に10%の安全マージンを追加します。
   注:細胞は、通常0.1−100×10⁶ 細胞/mLの広範囲の濃度で凍結保存することができます。
2. クライオバイアルにラベルを付けます。
3. 溶液A(SA)の生成:50%RPMIと50%PHS-ABまたはヒトプラズマを混合します。プラズマを使用する場合は、2,000 x g で4°Cで20分間回転します。
   注:SAの量は、ステップ5.1で決定したように、凍結保存される細胞懸濁液の総最終量の75%である必要があります。
4. 溶液B(SB)を生成:60%(v / v)PBSまたはRPMIと40%(v / v)ジメチルスルホキシド(DMSO)を混合します。
   注:SBの容量は、ステップ5.1で決定したように、凍結保存される細胞懸濁液の総最終容量の25%である必要があります。
5. 両方の溶液を4°Cに冷やします。
6. SB全体を等量のSAと混合して凍結培地を準備し、氷上に保ちます。
7. ステップ 4.5 から Treg を 450 x g で 4 °C で 5 分間スピンします。 培地を吸引して廃棄し、残りの氷冷SAに細胞を再懸濁し、氷上に保ちます。
8. 冷やした凍結培地を、チューブを振とうしながら、氷上の大きなチューブ内のSAに再懸濁した細胞に1:1でゆっくりと加えます。
9. 1 mL/バイアルでクライオバイアルに迅速に分注します。クライオバイアルをすぐにRTの食器棚ボックスに入れ、遅滞なく-80°Cの冷凍庫に移します。24時間後に液体N₂ に移します。

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結果

このプロトコールの実施が成功すると、安定したヒト制御性T細胞クローンおよび系統が作製されます。

CD4⁺CD127^loCD25^hi 細胞の事前選択/濃縮は、ほとんどのヒトTregを含む開始集団を得るための簡単な方法でした(図1A–C)。すべてのクローンがTreg表現型を示したわけではありません。CD25

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ディスカッション

このプロトコルは、Treg含有開始集団からの限定希釈およびフィーダー細胞ベースの増殖アプローチで得られた細胞の単離、増殖、および慎重な審査による超高純度ヒト制御性T細胞の増殖を説明しています。

このアプローチの重要なステップは、1)適切な開始母集団の選択です。一般に、ヒトPBMC内のCD4⁺ T細胞のCD127^loCD25^hi?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Stericup, 500 mL	Millipore	5500	Media storage and preparation
100x Nonessential amino acids	Gibco	11140-050	Media component
15 mL conical centrifuge tubes (50/bag, case of 500)	ThermoFisher Scientific	339650
1M HEPES	Gibco	15630-080	Media component
25 ml Single Well Pipet Basin	Fischer Scientific	13-681-508
50 mL Conical Centrifuge Tube (25/sleeve)	ThermoFisher Scientific	339652
50x Penicillin Streptomycin Soln	Corning	Corning, 30-001-Cl	Media component
CryoTube Vial Int Thread Round Btm Starfoot PP Screw Stopper Sterile PP 1.8 mL	Nalge Nunc	377267
DMSO	Corning	25-950-CQC
EasySep Human CD25 positive selection kit	Stemcell Technologies	18231	Alternatives are FACS or MACS column-based sorting
EasySep Human CD4+CD127low T cell Pre-Enrichment Kit	Stemcell Technologies	19231	Alternatives are FACS or MACS column-based sorting
EasySep Human CD4+CD127lowCD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit (alternative to item 12)	Stemcell Technologies	18063	Alternatives are FACS or MACS column-based sorting
Ficoll	GE Healthcare	17-5442-03	PBMC purification from peripheral blood of leukapheresis products; density gradient medium
Human AB Serum (PHS-AB)	Valley Biomedical Inc	HP1022	Media component
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation	Thermo Fischer	L-34962	Viability dye
Phytohemagglutinin-L (PHA-L)	Millipore/Sigma	11249738001	T cell stimulation
Recombinant IL-2 (e.g., PROLEUKINâ)	Prometheus		T cell stimulation and maintenance/ Media component
RPMI 1640	Gibco	21870-076	Media component
Staining antibodies for flowcytometry (Treg phenotyping)	See "Comments"	See "Comments"	Staining antibodies are enlisted in: Nowatzky et al. (2019) PubMed PMID: 30584695; PubMed Central PMCID: PMC6497402. In case EasySep Human CD25 positive selection kit is used, stain with 2A3 or BC96 anti-CD25 antibody, e.g.: Brilliant Violet 421 anti-human CD25 Antibody (Biolegend; 302629)
TCR Vβ Repertoire Kit; IOTest Beta Mark	Beckman Coulter	PN IM3497	Vetting of expansions for monoclonality
Tissue Culture Plate, 96 Well, U-Bottom with Low Evaporation Lid	Corning	353077