Geração de clones de células T reguladoras humanas

Resumo

Este protocolo descreve a clonagem e expansão de células T reguladoras humanas para a geração de Treg humano viável de pureza ultra-alta com desmetilação estável na região desmetilada específica de Treg (TSDR) e características fenotípicas específicas de Treg.

Resumo

As células T reguladoras humanas (Treg) são notoriamente difíceis de isolar em alta pureza, dados os métodos atuais de enriquecimento de Treg. Esses métodos são baseados na identificação de Treg por meio de vários marcadores de superfície celular dependentes de ativação com níveis de expressão variados em diferentes condições fisiológicas e patológicas. As populações isoladas como "Treg", portanto, geralmente contêm um número considerável de células efetoras não-Treg (ou seja, Teff) que dificultam a caracterização fenotípica e funcional precisa dessas células, sua caracterização genômica e proteômica, sua enumeração confiável em diferentes estados de saúde e doença, bem como seu isolamento e expansão para fins terapêuticos. Este último, em particular, continua sendo um grande obstáculo, pois a expansão inadvertida das células efetoras em compartimentos celulares relevantes para Treg (por exemplo, células T CD4 ⁺ CD25 ⁺ ) pode tornar a imunoterapia baseada em Treg ineficaz ou mesmo prejudicial. Este trabalho apresenta um método que contorna os problemas associados ao isolamento e expansão de base populacional de Treg e mostra que a geração de clones candidatos a Treg com a subsequente seleção, cultura e expansão apenas de células monoclonais cuidadosamente examinadas, permite a geração de um produto de células Treg ultrapuro que pode ser mantido em cultura por muitos meses, permitindo a investigação a jusante dessas células, inclusive para possíveis aplicações terapêuticas.

Introdução

O objetivo deste protocolo é permitir a propagação in vitro de Treg humano clonal de pureza ultra-alta. O isolamento de populações enriquecidas com Treg e a subsequente clonagem permitem a seleção dos fenótipos Treg desejados e sua expansão para um estudo mais aprofundado da biologia dessas células, exploração de sua potencial utilidade terapêutica e outras aplicações experimentais a jusante.

A clonagem de Treg produzirá uma pureza de Treg significativamente melhor do que as abordagens de isolamento e expansão policlonais. Isso se deve à exclusão confiável e controlada de células efetoras T com fenótipos semelhantes ou diferentes da população purificada, incluindo FOXP3 expressando (FOXP3^intCD45RA^negCD25^int) não-Treg e CD4 ⁺ CD25 ⁺ FOXP3^- Teff¹, entre outros. As linhagens celulares clonais obtidas por meio dessa abordagem não enfrentam o problema de crescimento excessivo com clones não-Treg em rápida expansão que tornam a expansão de longo prazo (ou seja, vários meses) e a cultura in vitro das células praticamente impossíveis ou pelo menos extremamente desafiadoras. O Treg clonal também permite uma verificação extensiva de suas características fenotípicas pós-expansão, inclusive por meio de métodos reconhecidos como padrão para a avaliação de características epigenéticas indicativas de^Treg 1,2,3,4 natural genuíno humano (por exemplo, desmetilação estável no TSDR).

A expansão de Treg tem sido realizada principalmente na forma de expansão celular policlonal para fins investigativos e terapêuticos ^5,6,7. Os problemas com a contaminação por Teff são um grande obstáculo para a implementação bem-sucedida de abordagens de imunoterapia baseadas em células Treg. Tentativas anteriores de expandir/gerar Treg monoclonal na literatura são escassas e não conseguiram mostrar manutenção das características de Treg a longo prazo⁸.

Este método será de interesse para qualquer pessoa que estude as propriedades celulares, moleculares e metabólicas da Treg humana genuína . O produto Treg ultrapuro gerado através do uso deste protocolo, em particular, presta-se a análises usando abordagens genômicas. Dadas as taxas de expansão relativamente baixas que caracterizam o Treg humano em geral, esse método pode ser de uso limitado para aqueles que buscam a rápida expansão de um grande número de células. No entanto, dada a pureza extremamente alta do Treg gerado com este protocolo, um número menor de Treg pode ter eficácia semelhante ou até melhor do que expansões maiores de linhagens celulares policlonais que contêm células efetoras que limitam o potencial supressor geral do produto gerado.

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Protocolo

Este protocolo segue todas as diretrizes institucionais relativas à conduta ética de pesquisas envolvendo o uso de amostras humanas. O trabalho com células humanas e outros produtos sanguíneos humanos deve ocorrer pelo menos em um ambiente certificado BSL-2, seguindo as diretrizes de segurança BLS-2, no mínimo.

1. Pré-enriquecimento de células mononucleares do sangue periférico humano para células ^CD4+CD127^loCD25^hi

CUIDADO: Use técnica estéril por toda parte. Descarte os objetos cortantes imediatamente em um recipiente apropriado para objetos cortantes. Alvejante qualquer coisa que tenha entrado em contato com sangue e/ou hemoderivados antes do descarte. Trabalhe em um gabinete de biossegurança.

1. Obter sangue periférico humano ou hemoderivados pré-enriquecidos para leucócitos humanos (ou seja, "leucopaks") a partir de colheitas de sangue periférico ou leucaférese. Processe as células imediatamente.
   NOTA: Se o armazenamento noturno não puder ser evitado, armazene e transporte as células em temperatura ambiente (RT). Evite a exposição ao frio.
2. Isole as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) por centrifugação gradiente sobre meio gradiente de densidade, conforme descrito anteriormente⁹.
3. Conte cuidadosamente as PBMCs usando um hemocitômetro ou contador de células. Se possível, use pelo menos 300 x 10⁶ PBMC para prosseguir com o isolamento Treg.
4. Ressuspenda PBMCs em tampão isolado (soro AB humano agrupado a 2% [PHS-AB] com EDTA 1,5 mM em solução salina tamponada com fosfato [PBS]) a uma concentração de 50 x 10⁶ células/mL e prossiga com a classificação magnética de acordo com as instruções do fabricante do kit de classificação usado. Por exemplo, use a classificação magnética de células (Tabela de Materiais) para isolamento negativo de uma população de células T^{CD4 +} CD127 lo, seguida de classificação de seleção positiva para células CD25 ⁺.
   NOTA: Uma variedade de produtos pode ser usada para a purificação magnética de Treg, incluindo abordagens baseadas em colunas e sem colunas. Alternativamente, pode ser realizada a classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) com gating em células T CD127^ouCD25^CD4+ altas. A esterilidade completa não é possível com o equipamento FACS padrão, no entanto, representando um risco significativo de contaminação. Além disso, o estresse celular e os danos conferidos pelo sistema fluídico não podem ser excluídos, e os lasers do instrumento podem afetar os resultados.
5. Verifique a pureza da população enriquecida com Treg resultante por meio da coloração para CD4, CD3, CD127 e CD25 (Figura 1). Escolha um anticorpo anti-CD25 humano que reconheça um domínio de ligação CD25 diferente daquele usado no kit de classificação, como o especificado na Tabela de Materiais, para obter um resultado preciso. Corar e fixar células usando um protocolo padrão de coloração de superfície, como o descrito em Nowatzky et ^al.10.

2. Clonagem de Treg de uma suspensão de células T CD4⁺ humanas pré-enriquecidas^{CD127 lo}CD25^hi

1. Ressuspenda as células enriquecidas com Treg (CD4 ⁺ CD127^loCD25^hi) obtidas na etapa 1.4 em meio de células T ([TCM]; RPMI 1640, 5% PHS-AB, 1% estreptomicina/penicilina, 1% HEPES, 1% aminoácidos não essenciais e 1% glutamina) com 300 UI/mL de interleucina-2 recombinante humana (IL-2) (Tabela de Materiais) visando uma concentração de ~1−3 x 10⁶ células/mL e contagem. Obtenha pelo menos três contagens de células separadas e calcule o número médio de células antes de prosseguir, porque contagens precisas são absolutamente cruciais.
2. Prepare uma suspensão celular única de células em duas concentrações: (1) 3 células / mL e (2) 6 células / mL. Carregue cinco placas de fundo redondo de 96 poços com 100 μL/poço de suspensão 1 e cinco placas com suspensão 2. Tome muito cuidado para manter as células em suspensão ao carregar as placas para garantir uma distribuição de 0,3 e 0,6 células/poço, respectivamente.
   NOTA: Não aumente a concentração celular para 1 célula/poço, pois isso aumenta o risco de obtenção de linhagens celulares oligoclonais e não clones verdadeiros.
3. Preparar células alimentadoras a partir de PBMCs alogénicas humanas recentemente isoladas, obtidas através de centrifugação por gradiente de densidade, como indicado no passo 1.2.
4. Preparar pelo menos 10 x 10⁶ células alimentadoras por placa de clonagem para irradiação, ressuspendendo PBMCs alogénicos humanos em MTC sem IL-2 num tubo de polipropileno de 50 ml a uma concentração de ~10 x 10⁶ PBMC/ml. Feche bem o tubo e irradie com 35 Gy em um irradiador gama ou em um dispositivo de irradiação baseado em raios-X.
   NOTA: A irradiação desencadeia a secreção de grandes quantidades de citocinas dos alimentadores que facilitam a proliferação de Teff, mas podem afetar adversamente a expansão do Treg. Em seguida, eles serão removidos por lavagem.
5. Centrifugar as células a 450 x g e RT durante 5 min após a irradiação e aspirar o sobrenadante. Lave as células ressuspendendo-as em TCM sem IL-2 usando pelo menos 10x o volume da célula alimentadora peletizada do meio / PBS.
   NOTA: Recomenda-se determinar um perfil de expressão do antígeno leucocitário humano (HLA) das células do doador a serem clonadas. Isso pode ser feito por meio de coloração simples para um ou vários tipos de HLA que são comuns na população da qual o respectivo doador é derivado (ou seja, HLA-A2 ou HLA-A24). PBMC usado como células alimentadoras não deve expressar este HLA para permitir a reidentificação/isolamento de células-alvo de culturas de expansão antes da apoptose induzida por irradiação dos alimentadores.
6. Ressuspenda as células alimentadoras irradiadas e lavadas em MTC com 300 UI / mL de IL-2 a uma concentração de 1 x 10⁶ células / mL.
7. Adicione a fitohemaglutinina-L (PHA-L) (Tabela de Materiais) a uma concentração de 4 μg/ml (2x a concentração necessária em cultura) e prossiga rapidamente para o passo 2.8.
8. Adicione 100.000 células alimentadoras irradiadas em 100 μL de TCM com 4 μg/mL de PHA-L e 300 UI/mL de IL-2 às células enriquecidas com Treg, resultando em um volume total de 200 μL e uma concentração de PHA-L de 2 μg/mL em cada poço. Misture bem pipetando para cima e para baixo 5x. Limitar o tempo de exposição das células alimentadoras ao PHA-L antes da sua adição ao Treg ao mínimo absolutamente necessário e manter em suspensão até à plaqueagem.
   NOTA: Garanta uma concentração de PHA-L de 2 μg/mL na cultura na etapa inicial de semeadura, mas use uma concentração menor de 1 μg/mL na expansão subsequente dos clones Treg. Use 300 UI / mL de IL-2 por toda parte.
9. Incubar a 37 °C. Troque 50% da mídia usando TCM com 300 UI / mL de IL-2, mas sem PHA-L nos dias 5 a 7.

3. Expansão de Treg e manutenção de clones em cultura

1. A partir do dia 12, verifique as culturas quanto à presença de pellets de células em proliferação.
   NOTA: Haverá pellets formados por células alimentadoras, mas no exame microscópico elas aparecerão como células pequenas, redondas, moribundas ou mortas, enquanto as células T em proliferação serão maiores em tamanho, com contraste brilhante e aparência saudável, muitas vezes formando aglomerados de células adjacentes que aparecem marrons no exame macroscópico.
2. Continue a examinar as culturas a cada 1-2 dias. Isole clones provisórios em proliferação, transferindo-os para poços únicos. Coloque cada clone provisório em uma única placa de 96 poços para evitar a contaminação cruzada de qualquer clone provisório ou estabelecido por meio da transferência inadvertida de células de outros poços.
3. Mantenha as células através de 50% de trocas de mídia a cada 2-3 dias e divida conforme necessário. Monitore as células de perto.
   NOTA: Atrasar as mudanças e divisões do meio pode prejudicar as células e a "divisão excessiva" pode interromper sua proliferação e resultar em morte celular.
4. Reestimule as células com alimentadores alogênicos irradiados, conforme descrito nas etapas 2.3 a 2.9, mas use concentrações mais baixas de PHA-L (ou seja, 1 μg / mL em TCM com 300 UI / mL de IL-2). Reestimule quando o tamanho da célula diminuir e as células se tornarem redondas, em oposição ao oval alongado, que normalmente ocorre após 2 a 3 semanas.
   NOTA: Mantenha a cultura de clonagem original por pelo menos 6 a 8 semanas. Muitos dos clones 'iniciais' que se tornam visíveis em ou logo após 2 semanas tendem a não ser verdadeiros Treg, mas células não-Treg/Teff de proliferação rápida e são mais propensos a falhar na verificação do que as células 'tardias', algumas das quais levarão mais de 1 mês para aparecer visivelmente em cultura.

4. Verificação de clones Treg provisórios

1. Comece a verificação de clones provisórios assim que eles proliferarem para ~ 1 x 10⁶ células para monoclonalidade e status de metilação do TSDR.
2. Opcionalmente, pré-selecione as expansões celulares por coloração para CD3, CD4, CD127 e CD25 para identificar aqueles de interesse (ou seja, CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD127^ouCD25^hi) para avaliação posterior (Figura 2).
3. Estabelecer a monoclonalidade por meio da identificação da presença de uma única cadeia Vβ no produto celular por coloração Vβ usando conjuntos de anticorpos de coloração disponíveis comercialmente (Tabela de Materiais; Figura 3) seguindo as instruções do fabricante. Certifique-se de adquirir pelo menos 1 x 10⁶ eventos ao executar amostras em um citômetro de fluxo para uma análise confiável, para que populações contaminantes menores possam ser detectadas. Use um corante de viabilidade.
4. Ter o status de metilação do TSDR no locus FOXP3 avaliado por provedores comerciais ou internamente^11,12. Obtenha pelo menos 1 x 10⁵ células para resultados adequados.
5. Uma vez confirmada a identidade e a clonalidade do Treg nas etapas 4.3 e 4.4, criopreserve as células ou use-as para aplicações a jusante.
   NOTA: Abordagens de verificação alternativas, mas muito menos confiáveis, estão determinando o fenótipo Treg por colorações FACS ^1,10 e ensaios de supressão in vitro ou in vivo^13,14. Evite confiar demais em ensaios de supressão de Treg¹³. Os ensaios são tipicamente, mas não exclusivamente, baseados na cocultura de Treg em números graduados com células T respondedoras (ou seja, PBMC ou células T purificadas, às vezes depletadas de Treg) na presença de células apresentadoras de antígenos de terceiros ou CD3/CD28 com diluição de corante representando proliferação como leitura. Muitos desses ensaios têm limitações severas e podem superestimar ou subestimar o grau real de supressão mediado por Treg. O status de metilação do TSDR continua sendo a medida mais definitiva / confiável do fenótipo Treg ou "identidade" ^{3 , 15 , 16} . Observe que o FOXP3 está localizado no cromossomo X e, nas mulheres, um cromossomo X é inativado pela metilação do DNA, o que afeta os resultados da análise de metilação do TSDR.

5. Criopreservação de Treg

NOTA: Treg pode ser armazenado a longo prazo após criopreservação bem-sucedida com DMSO e PHS-AB.

1. Determine o número de criogeniais necessários para criopreservar as células. Isso é igual ao volume final total da suspensão celular (em mL) a ser criopreservada, porque 1 mL é congelado por frasco. Adicione uma margem de segurança de 10% a este volume para compensar as perdas devido à pipetagem/tensão superficial.
   NOTA: As células podem ser criopreservadas em uma ampla gama de concentrações, normalmente entre 0,1 a 100 x 10⁶ células / mL.
2. Rotule os criogeniais.
3. Gerar solução A (SA): misturar 50% RPMI e 50% PHS-AB ou plasma humano. Se for usado plasma, gire a 2.000 x g por 20 min a 4 °C.
   NOTA: O volume de SA deve ser de 75% do volume final total da suspensão celular a ser criopreservada, conforme determinado na etapa 5.1.
4. Gerar solução B (SB): misturar 60% (v/v) de PBS ou RPMI e 40% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO).
   NOTA: O volume de SB deve ser de 25% do volume final total da suspensão celular a ser criopreservada, conforme determinado na etapa 5.1.
5. Refrigerar ambas as soluções a 4 °C.
6. Prepare o meio de congelamento misturando todo o SB com partes iguais de SA e mantenha no gelo.
7. Gire Treg da etapa 4.5 a 450 x g por 5 min a 4 ° C. Aspire e descarte o meio e ressuspenda as células no SA gelado restante e mantenha no gelo.
8. Adicione lentamente o meio de congelamento resfriado 1:1 às células ressuspensas em SA em um tubo grande no gelo enquanto agita o tubo.
9. Aliquota rapidamente em criogeniais a 1 mL / frasco. Coloque imediatamente os criogenianos em uma caixa de armário em RT e transfira para um freezer a -80 ° C sem demora. Transferir para o líquido N₂ após 24 h.

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Resultados

A implementação bem-sucedida deste protocolo levará à geração de clones e linhagens de células T reguladoras humanas estáveis.

A pré-seleção / pré-enriquecimento de células CD4 ⁺ CD127^loCD25^hi foi um método direto para obter uma população inicial que continha a maioria dos Treg humanos (Figura 1A-C). Nem todos os clones exibiram um fenótipo Treg. A pré-triagem de ...

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Discussão

Este protocolo descreve a propagação de células T reguladoras humanas ultrapuras por meio do isolamento, expansão e verificação cuidadosa de células obtidas em uma diluição limitante e abordagem de expansão baseada em células alimentadoras de populações iniciais contendo Treg.

As etapas críticas nesta abordagem são: 1) a escolha de uma população inicial apropriada. Geralmente, o CD127^ouCD25^hi compartimento de células T C...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Stericup, 500 mL	Millipore	5500	Media storage and preparation
100x Nonessential amino acids	Gibco	11140-050	Media component
15 mL conical centrifuge tubes (50/bag, case of 500)	ThermoFisher Scientific	339650
1M HEPES	Gibco	15630-080	Media component
25 ml Single Well Pipet Basin	Fischer Scientific	13-681-508
50 mL Conical Centrifuge Tube (25/sleeve)	ThermoFisher Scientific	339652
50x Penicillin Streptomycin Soln	Corning	Corning, 30-001-Cl	Media component
CryoTube Vial Int Thread Round Btm Starfoot PP Screw Stopper Sterile PP 1.8 mL	Nalge Nunc	377267
DMSO	Corning	25-950-CQC
EasySep Human CD25 positive selection kit	Stemcell Technologies	18231	Alternatives are FACS or MACS column-based sorting
EasySep Human CD4+CD127low T cell Pre-Enrichment Kit	Stemcell Technologies	19231	Alternatives are FACS or MACS column-based sorting
EasySep Human CD4+CD127lowCD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit (alternative to item 12)	Stemcell Technologies	18063	Alternatives are FACS or MACS column-based sorting
Ficoll	GE Healthcare	17-5442-03	PBMC purification from peripheral blood of leukapheresis products; density gradient medium
Human AB Serum (PHS-AB)	Valley Biomedical Inc	HP1022	Media component
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation	Thermo Fischer	L-34962	Viability dye
Phytohemagglutinin-L (PHA-L)	Millipore/Sigma	11249738001	T cell stimulation
Recombinant IL-2 (e.g., PROLEUKINâ)	Prometheus		T cell stimulation and maintenance/ Media component
RPMI 1640	Gibco	21870-076	Media component
Staining antibodies for flowcytometry (Treg phenotyping)	See "Comments"	See "Comments"	Staining antibodies are enlisted in: Nowatzky et al. (2019) PubMed PMID: 30584695; PubMed Central PMCID: PMC6497402. In case EasySep Human CD25 positive selection kit is used, stain with 2A3 or BC96 anti-CD25 antibody, e.g.: Brilliant Violet 421 anti-human CD25 Antibody (Biolegend; 302629)
TCR Vβ Repertoire Kit; IOTest Beta Mark	Beckman Coulter	PN IM3497	Vetting of expansions for monoclonality
Tissue Culture Plate, 96 Well, U-Bottom with Low Evaporation Lid	Corning	353077