JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיבוט והרחבה של תאי T רגולטוריים אנושיים ליצירת Treg אנושי בר-קיימא בטוהר גבוה במיוחד עם דה-מתילציה יציבה באזור דה-מתילציה ספציפי ל-Treg (TSDR) ותכונות פנוטיפיות ספציפיות ל-Treg.

Abstract

תאי T רגולטוריים אנושיים (Treg) ידועים לשמצה כקשים לבידוד בטוהר גבוה בהתחשב בשיטות הנוכחיות להעשרת Treg. שיטות אלו מבוססות על זיהוי Treg באמצעות מספר סמני משטח תאיים תלויי הפעלה עם רמות ביטוי משתנות בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. אוכלוסיות המבודדות כ-"Treg" מכילות לעתים קרובות מספר ניכר של תאים אפקטורים שאינם Treg (כלומר, Teff) הפוגעים באפיון הפנוטיפי והתפקודי המדויק של תאים אלה, באפיונם הגנומי והפרוטאומי, בספירה האמינה שלהם במצבי בריאות ומחלות שונים, כמו גם בבידודם והתרחבותם למטרות טיפוליות. האחרון, במיוחד, נותר מכשול גדול, שכן התרחבות לא מכוונת של תאי אפקטור הנמצאים בתאים תאיים רלוונטיים ל-Treg (למשל, תאי CD4+CD25+ T) עלולה להפוך את האימונותרפיה מבוססת Treg ללא יעילה, או אפילו מזיקה. עבודה זו מציגה שיטה העוקפת את הבעיות הקשורות לבידוד והרחבה מבוססי אוכלוסייה של Treg ומראה כי יצירת שיבוטים מועמדים ל-Treg עם הבחירה, התרבית וההרחבה של תאים חד-שבטיים שנבדקו בקפידה, מאפשרת יצירת מוצר תאי Treg טהור במיוחד שניתן לשמור בתרבית במשך חודשים רבים. המאפשר חקירה במורד הזרם של תאים אלה, כולל ליישומים טיפוליים אפשריים.

Introduction

מטרת פרוטוקול זה היא לאפשר התפשטות חוץ גופית של Treg אנושי משובט בטוהר גבוה במיוחד. בידוד של אוכלוסיות מועשרות ב-Treg ושיבוט לאחר מכן מאפשר בחירה של פנוטיפים רצויים של Treg והרחבתם למחקר נוסף של הביולוגיה של תאים אלה, חקר התועלת הטיפולית הפוטנציאלית שלהם ויישומים ניסיוניים אחרים במורד הזרם.

שיבוט Treg יניב טוהר Treg טוב יותר משמעותית מאשר גישות בידוד והתפשטות רב-שבטיות. זאת בשל הדרה אמינה ומבוקרת של תאי אפקטור T עם פנוטיפים דומים או שונים מהאוכלוסייה המטוהרת, כולל ביטוי FOXP3 (FOXP3intCD45RAnegCD25int) non-Treg ו-CD4+ CD25+ FOXP3- Teff1, בין היתר. קווי תאים משובטים המתקבלים בגישה זו אינם מתמודדים עם בעיית צמיחת יתר עם שיבוטים שאינם Treg המתרחבים במהירות שהופכים את ההתרחבות לטווח ארוך מאוד (כלומר, מספר חודשים) ותרבית חוץ גופית של התאים כמעט בלתי אפשרית או לפחות מאתגרת ביותר. Clonal Treg מאפשר גם בדיקה מקיפה של המאפיינים הפנוטיפיים שלהם לאחר ההתרחבות, כולל באמצעות שיטות המוכרות כסטנדרט להערכת תכונות אפיגנטיות המעידות על Treg טבעי אנושי בתום לב 1,2,3,4 (למשל, דה-מתילציה יציבה ב-TSDR).

הרחבת Treg בוצעה בעיקר בצורה של הרחבת תאים רב-שבטיים למטרות חקירה וטיפוליותכאחד 5,6,7. הבעיות בזיהום טף מהוות מכשול מרכזי ליישום מוצלח של גישות אימונותרפיה מבוססות תאי Treg. ניסיונות קודמים להרחיב/ליצור Treg חד-שבטי בספרות הם נדירים ולא הצליחו להראות שמירה על תכונות Treg בטווח הארוך8.

שיטה זו תעניין את כל מי שחוקר תכונות תאיות, מולקולריות ומטבוליות של Treg אנושי אמיתי . מוצר Treg האולטרה-טהור שנוצר באמצעות שימוש בפרוטוקול זה מתאים במיוחד לניתוחים באמצעות גישות גנומיות. בהתחשב בשיעורי ההתפשטות הנמוכים יחסית המאפיינים את Treg האנושי באופן כללי, שיטה זו עשויה להיות שימושית מוגבלת למי שמחפש התרחבות מהירה של מספר עצום של תאים. עם זאת, בהתחשב בטוהר הגבוה במיוחד של ה-Treg שנוצר עם פרוטוקול זה, למספרים קטנים יותר של Treg עשויה להיות יעילות דומה או אפילו טובה יותר מאשר הרחבות גדולות יותר של קווי תאים רב-שבטיים המכילים תאי אפקטור המגבילים את פוטנציאל הדיכוי הכולל של המוצר שנוצר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

פרוטוקול זה עוקב אחר כל ההנחיות המוסדיות הנוגעות לניהול אתי של מחקר הכרוך בשימוש בדגימות אנושיות. עבודה עם תאים אנושיים ומוצרי דם אנושיים אחרים חייבת להתבצע לפחות בסביבה מוסמכת BSL-2 בהתאם להנחיות הבטיחות של BLS-2 לכל הפחות.

1. העשרה מוקדמת של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי לתאיHI CD4 + CD127loCD25

זהירות: השתמש בטכניקה סטרילית לאורך כל הדרך. השליכו מיד חדים למיכל חד מתאים. הלבינו כל דבר שבא במגע עם דם ו/או מוצרי דם לפני השלכתו. עבוד בארון בטיחות ביולוגית.

  1. השג דם היקפי אנושי או מוצרי דם מועשרים מראש ללויקוציטים אנושיים (כלומר, "לויקופקים") משאיבת דם היקפית או לויקפרזיס. עבד תאים באופן מיידי.
    הערה: אם לא ניתן להימנע מאחסון לילה, אחסן והובל תאים בטמפרטורת החדר (RT). הימנע מחשיפה לקור.
  2. לבודד תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) על ידי צנטריפוגה שיפוע על מדיום שיפוע צפיפות כפי שתואר קודם לכן9.
  3. ספרו בזהירות PBMCs באמצעות המוציטומטר או מונה תאים. במידת האפשר, השתמש לפחות ב-300 x 106 PBMC כדי להמשיך בבידוד Treg.
  4. השעו PBMCs במאגר בידוד (2% סרום AB אנושי מאוגד [PHS-AB] עם 1.5 מ"מ EDTA בתמיסת מלח חוצצת פוספט [PBS]) בריכוז של 50 x 106 תאים/מ"ל והמשך במיון מגנטי בהתאם להוראות היצרן של ערכת המיון בה נעשה שימוש. לדוגמה, השתמש במיון תאים מגנטיים (טבלת חומרים) לבידוד שלילי של אוכלוסיית תאי CD4+CD127lo T, ואחריו מיון בחירה חיובי עבור תאי CD25+ .
    הערה: ניתן להשתמש במגוון מוצרים לטיהור מגנטי של Treg, כולל גישות מבוססות עמודות ונטולות עמודות. לחלופין, ניתן לבצע מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) עם שער על תאי CD127loCD25 CD4+ Tגבוהים. סטריליות מוחלטת אינה אפשרית עם ציוד FACS סטנדרטי, עם זאת, מה שמהווה סיכון משמעותי לזיהום. בנוסף, לא ניתן לשלול מתח סלולרי ונזק שנגרמו על ידי מערכת הנוזל, ולייזרי המכשיר עשויים להשפיע על התוצאות.
  5. בדוק את האוכלוסייה המועשרת ב-Treg המתקבלת לטוהר באמצעות צביעה עבור CD4, CD3, CD127 ו-CD25 (איור 1). בחר נוגדן CD25 אנטי-אנושי המזהה תחום קשירת CD25 שונה מזה המשמש בערכת המיון, כגון זה המצוין בטבלת החומרים, כדי לקבל תוצאה מדויקת. לצבוע ולתקן תאים באמצעות פרוטוקול צביעת משטח סטנדרטי כמו זה המתואר ב- Nowatzky et al.10.

2. שיבוט של Treg מתלה תאי CD127loCD25אנושי מועשר מראש CD4+ T

  1. השעו מחדש את התאים המועשרים ב-Treg (CD4+CD127loCD25hi) שהתקבלו בשלב 1.4 במדיה של תאי T ([TCM]; RPMI 1640, 5% PHS-AB, 1% סטרפטומיצין/פניצילין, 1% HEPES, 1% חומצות אמינו לא חיוניות ו-1% גלוטמין) עם 300 IU/mL של אינטרלוקין-2 רקומביננטי אנושי (IL-2) (טבלת חומרים) במטרה להגיע לריכוז של ~1-3 x 106 תאים/מ"ל וספירה. השג לפחות שלוש ספירות תאים נפרדות וחשב את מספרי התאים הממוצעים לפני שתמשיך, מכיוון שספירה מדויקת היא קריטית לחלוטין.
  2. הכן תרחיף תא בודד של תאים בשני ריכוזים: (1) 3 תאים/מ"ל, ו-(2) 6 תאים/מ"ל. טען חמש צלחות 96 בארות עגולות עם 100 מיקרוליטר/באר מתלה 1, וחמש צלחות עם מתלה 2. הקפד מאוד לשמור על תאים בהשעיה בעת העמסת הלוחות כדי להבטיח חלוקה של 0.3 ו-0.6 תאים לבאר, בהתאמה.
    הערה: אין להגדיל את ריכוז התאים לתא אחד/באר, מכיוון שהדבר מגדיל את הסיכון לקבלת קווי תאים אוליגוקלונליים ולא שיבוטים אמיתיים.
  3. הכן תאי הזנה מ-PBMCs אלוגניים אנושיים מבודדים טריים המתקבלים באמצעות צנטריפוגה של שיפוע צפיפות כמו בשלב 1.2.
  4. הכן לפחות 10 x 106 תאי הזנה לכל צלחת שיבוט להקרנה על ידי השעיית PBMCs אלוגניים אנושיים ב-TCM ללא IL-2 בצינור פוליפרופילן של 50 מ"ל בריכוז של ~10 x 106 PBMC/mL. סגור היטב את הצינור והקרין עם 35 Gy במכשיר הקרנה גמא או במכשיר הקרנה מבוסס רנטגן.
    הערה: הקרנה מפעילה הפרשת כמויות גדולות של ציטוקינים מהמזינים המאפשרים את התפשטות הטף, אך עלולים להשפיע לרעה על התפשטות הטף. אלה יוסרו לאחר מכן על ידי כביסה.
  5. תאי צנטריפוגה ב-450 x g ו-RT למשך 5 דקות לאחר ההקרנה, ושואבים את הסופרנטנט. שטפו תאים על ידי השעייתם מחדש ברפואה הסינית המסורתית ללא IL-2 באמצעות לפחות פי 10 מנפח תאי ההזנה של מדיה/PBS.
    הערה: מומלץ לקבוע פרופיל ביטוי אנטיגן לויקוציטים אנושיים (HLA) של תאי התורם לשיבוט. ניתן לעשות זאת באמצעות צביעה פשוטה עבור סוג HLA אחד או יותר הנפוצים באוכלוסייה ממנה נגזר התורם המתאים (כלומר, HLA-A2 או HLA-A24). PBMC המשמש כתאי הזנה לא אמור לבטא HLA זה כדי לאפשר זיהוי מחדש/בידוד של תאי מטרה מתרביות התפשטות לפני אפופטוזיס המושרה על ידי הקרנה של המזינים.
  6. יש להשעות מחדש את תאי ההזנה המוקרנים והשטופים ברפואה הסינית המסורתית עם 300 יחב"ל/מ"ל IL-2 בריכוז של 1 x 106 תאים/מ"ל.
  7. הוסף פיטוהמגלוטינין-L (PHA-L) (טבלת החומרים) בריכוז של 4 מיקרוגרם/מ"ל (פי 2 מהריכוז הנדרש בתרבית) והמשך במהירות לשלב 2.8.
  8. הוסף 100,000 תאי הזנה מוקרנים ב-100 מיקרוליטר של TCM עם 4 מיקרוגרם/מ"ל PHA-L ו-300 IU/mL IL-2 לתאים המועשרים ב-Treg, וכתוצאה מכך נפח כולל של 200 מיקרוליטר וריכוז PHA-L של 2 מיקרוגרם/מ"ל בכל באר. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה פי 5. הגבל את זמן החשיפה של תאי ההזנה ל-PHA-L לפני הוספתם ל-Treg למינימום המוחלט ההכרחי, ושמור בתרחיף עד לציפוי.
    הערה: הקפידו על ריכוז PHA-L של 2 מיקרוגרם/מ"ל בתרבית בשלב הזריעה הראשוני, אך השתמשו בריכוז נמוך יותר, 1 מיקרוגרם/מ"ל עם התרחבות לאחר מכן של שיבוטי Treg. השתמש ב-300 IU/mL של IL-2 לאורך כל הדרך.
  9. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. החלף 50% מהמדיה באמצעות TCM עם 300 IU/mL IL-2 אך ללא PHA-L בימים 5-7.

3. הרחבת Treg ותחזוקת שיבוטים בתרבות

  1. החל מהיום ה-12, בדוק את התרביות לנוכחות כדורים של תאים מתרבים.
    הערה: יהיו כדורים שנוצרו על ידי תאי הזנה, אך בבדיקה מיקרוסקופית הם יופיעו כתאים קטנים, עגולים, גוססים או מתים, בעוד שתאי T מתרבים יהיו גדולים יותר בגודלם, עם ניגודיות בהירה ומראה בריא, ולעתים קרובות יוצרים אשכולות של תאים סמוכים שנראים חומים בבדיקה מקרוסקופית.
  2. המשיכו לבחון תרביות כל 1-2 ימים. בודד שיבוטים טנטטיביים מתרבים על ידי העברתם לבארות בודדות. הנח כל שיבוט טנטטיבי על צלחת אחת של 96 בארות כדי למנוע זיהום צולב של כל שיבוט טנטטיבי או מבוסס נתון באמצעות העברת תאים בשוגג מבארות אחרות.
  3. שמור על תאים באמצעות 50% החלפות מדיה כל 2-3 ימים ופצל לפי הצורך. עקוב אחר תאים מקרוב.
    הערה: עיכוב שינויים במדיה ופיצול עלול לפגוע בתאים ו"פיצול יתר" יכול לעצור את התפשטותם ולגרום למוות של תאים.
  4. לעורר מחדש תאים עם מזינים אלוגניים מוקרנים כמתואר בשלבים 2.3-2.9, אך השתמש בריכוזי PHA-L נמוכים יותר (כלומר, 1 מיקרוגרם/מ"ל ב-TCM עם 300 IU/mL IL-2). עורר מחדש כאשר גודל התא קטן והתאים הופכים עגולים בניגוד לאליפסה מוארכת שהיא בדרך כלל לאחר 2-3 שבועות.
    הערה: שמור על תרבית השיבוט המקורית למשך 6-8 שבועות לפחות. רבים מהשיבוטים ה'מוקדמים' שהופכים לגלויים לאחר שבועיים או זמן קצר לאחר מכן נוטים להיות לא Treg אמיתיים, אלא מתרבים במהירות תאים שאינם Treg/Teff ויש להם סיכוי גבוה יותר להיכשל בבדיקה מאשר תאים 'מאוחרים', שלחלקם ייקח יותר מחודש להופיע באופן גלוי בתרבית.

4. בדיקה של שיבוטים טנטטיביים של Treg

  1. התחל בבדיקה של שיבוטים טנטטיביים לאחר שהם התרבו ל-~1 x 106 תאים עבור חד-שבטיות ומצב מתילציה של TSDR.
  2. לחלופין, הרחבות תאים מוקדמות על ידי צביעה עבור CD3, CD4, CD127 ו-CD25 על מנת לזהות את אלה המעניינים (כלומר, CD3+CD4+CD127אוCD25hi) להערכה נוספת (איור 2).
  3. ביסוס חד-שבטיות באמצעות זיהוי נוכחות של שרשרת Vβ בודדת במוצר הסלולרי על ידי צביעת Vβ באמצעות סטים של נוגדנים לצביעה זמינים מסחרית (טבלת חומרים; איור 3) בהתאם להוראות היצרן. הקפד לרכוש לפחות 1 x 106 אירועים בעת הפעלת דגימות על ציטומטר זרימה לניתוח אמין, כך שניתן יהיה לזהות אוכלוסיות מזהמות קלות. השתמש בצבע חי.
  4. יש סטטוס מתילציה של TSDR בלוקוס FOXP3 המוערך על ידי ספקים מסחריים או פנימיים11,12. השג לפחות 1 x 105 תאים לקבלת תוצאות נאותות.
  5. לאחר אישור הזהות והשיבוט של Treg בשלבים 4.3 ו-4.4, שימור בהקפאה של התאים או שימוש ביישומים במורד הזרם.
    הערה: גישות בדיקה חלופיות, אך הרבה פחות אמינות, קובעות את פנוטיפ Treg על ידי צביעות FACS 1,10 ומבחני דיכוי in vitro או in vivo13,14. הימנע מהסתמכות יתר על מבחני דיכוי Treg13. הבדיקות מבוססות בדרך כלל, אך לא רק, על קוקולטורציה של Treg במספרים מדורגים עם תאי T מגיבים (כלומר, PBMC או תאי T מטוהרים, לפעמים מדוללי Treg) בנוכחות תאים מציגי אנטיגן של צד שלישי או CD3/CD28 עם דילול צבע המייצג התפשטות כקריאה. לרבות מהבדיקות הללו יש מגבלות חמורות ועשויות להעריך יתר על המידה או להמעיט במידת הדיכוי האמיתית המתווכת על ידי Treg. סטטוס המתילציה של TSDR נותר המדד המובהק/אמין ביותר לפנוטיפ או "זהות" Treg 3,15,16. שימו לב ש-FOXP3 ממוקם על כרומוזום X, ואצל נקבות, כרומוזום X אחד מושבת על ידי מתילציה של DNA, מה שמשפיע על תוצאות ניתוח המתילציה של TSDR.

5. שימור בהקפאה של Treg

הערה: ניתן לאחסן Treg לטווח ארוך לאחר שימור מוצלח בהקפאה עם DMSO ו-PHS-AB.

  1. קבע את מספר הקריובילים הנדרשים לשימור התאים בהקפאה. זה שווה לנפח הסופי הכולל של תרחיף התאים (במ"ל) שיש לשמר בהקפאה, מכיוון ש-1 מ"ל קפוא לכל בקבוקון. הוסף מרווח בטיחות של 10% לנפח זה על מנת לקחת בחשבון הפסדים עקב פיפטינג/מתח פנים.
    הערה: ניתן לשמר תאים בהקפאה במגוון רחב של ריכוזים, בדרך כלל בין 0.1-100 x 106 תאים/מ"ל.
  2. סמן את הקריוביאלים.
  3. צור פתרון A (SA): מערבבים 50% RPMI ו-50% PHS-AB או פלזמה אנושית. אם משתמשים בפלזמה, סובב ב-2,000 x גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: נפח ה-SA צריך להיות 75% מהנפח הסופי הכולל של תרחיף התאים שיש לשמור בהקפאה כפי שנקבע בשלב 5.1.
  4. צור תמיסה B (SB): מערבבים 60% (v/v) PBS או RPMI ו-40% (v/v) דימתיל סולפוקסיד (DMSO).
    הערה: נפח ה-SB צריך להיות 25% מהנפח הסופי הכולל של תרחיף התאים שיש לשמר בהקפאה כפי שנקבע בשלב 5.1.
  5. מצננים את שני התמיסות ל -4 מעלות צלזיוס.
  6. מכינים את מדיום ההקפאה על ידי ערבוב כל ה-SB עם חלקים שווים של SA ושומרים על קרח.
  7. סובב Treg משלב 4.5 ב-450 x g למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שאפו והשליכו מדיה, והשעו מחדש תאים ב-SA הקר כקרח שנותר והמשיכו על קרח.
  8. הוסף לאט את אמצעי ההקפאה המצונן 1:1 לתאים התלויים מחדש ב-SA בצינור גדול על קרח תוך כדי ניעור הצינור.
  9. מכניסים במהירות לקריוביאלים ב-1 מ"ל/בקבוקון. הכניסו מיד את הקריוביאל לקופסת ארון ב-RT והעבירו למקפיא של -80 מעלות צלזיוס ללא דיחוי. מעבירים לנוזל N2 לאחר 24 שעות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

יישום מוצלח של פרוטוקול זה יוביל ליצירת שיבוטים וקווים יציבים של תאי T רגולטוריים אנושיים.

בחירה מוקדמת/העשרה מוקדמת של תאי CD4+CD127אוCD25הייתה שיטה פשוטה להשגת אוכלוסייה התחלתית שהכילה את רוב תאי ה-Treg האנושיים (איור 1A-C).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את ההתפשטות של תאי T רגולטוריים אנושיים טהורים במיוחד באמצעות בידוד, הרחבה ובדיקה קפדנית של תאים המתקבלים בגישת דילול מגבילה והתרחבות מבוססת תאי הזנה מאוכלוסיות התחלתיות המכילות Treg.

צעדים קריטיים בגישה זו הם: 1) בחירת אוכלוסיית התחלה מתאי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

פרויקט זה נתמך על ידי המכון הלאומי לעיניים של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר K08EY025324 (נובצקי) ועל ידי פרס קולטון מלומד ממרכז ג'ודית וסטיוארט קולטון לאוטואימוניות (נובצקי).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm Stericup, 500 mLMillipore5500Media storage and preparation
100x Nonessential amino acidsGibco11140-050Media component
15 mL conical centrifuge tubes (50/bag, case of 500)ThermoFisher Scientific339650
1M HEPESGibco15630-080Media component
25 ml Single Well Pipet BasinFischer Scientific13-681-508
50 mL Conical Centrifuge Tube (25/sleeve)ThermoFisher Scientific339652
50x Penicillin Streptomycin SolnCorningCorning, 30-001-ClMedia component
CryoTube Vial Int Thread Round Btm Starfoot PP Screw Stopper Sterile PP 1.8 mLNalge Nunc377267
DMSOCorning25-950-CQC
EasySep Human CD25 positive selection kitStemcell Technologies18231Alternatives are FACS or MACS column-based sorting
EasySep Human CD4+CD127low T cell Pre-Enrichment KitStemcell Technologies19231Alternatives are FACS or MACS column-based sorting
EasySep Human CD4+CD127lowCD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit (alternative to item 12)Stemcell Technologies18063Alternatives are FACS or MACS column-based sorting
FicollGE Healthcare17-5442-03PBMC purification from peripheral blood of leukapheresis products; density gradient medium
Human AB Serum (PHS-AB)Valley Biomedical IncHP1022Media component
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitationThermo FischerL-34962Viability dye
Phytohemagglutinin-L (PHA-L)Millipore/Sigma11249738001T cell stimulation
Recombinant IL-2 (e.g., PROLEUKINâ)PrometheusT cell stimulation and maintenance/ Media component
RPMI 1640Gibco21870-076Media component
Staining antibodies for flowcytometry (Treg phenotyping)See "Comments"See "Comments"Staining antibodies are enlisted in: Nowatzky et al. (2019) PubMed PMID: 30584695; PubMed Central PMCID: PMC6497402. In case EasySep Human CD25 positive selection kit is used, stain with 2A3 or BC96 anti-CD25 antibody, e.g.: Brilliant Violet 421 anti-human CD25 Antibody (Biolegend; 302629)
TCR Vβ Repertoire Kit; IOTest Beta MarkBeckman CoulterPN IM3497Vetting of expansions for monoclonality
Tissue Culture Plate, 96 Well, U-Bottom with Low Evaporation LidCorning353077

References

  1. Miyara, M., et al. Functional delineation and differentiation dynamics of human CD4+ T cells expressing the FoxP3 transcription factor. Immunity. 30 (6), 899-911 (2009).
  2. Polansky, J. K., et al. DNA methylation controls Foxp3 gene expression. European Journal of Immunology. 38 (6), 1654-1663 (2008).
  3. Toker, A., et al. Active demethylation of the Foxp3 locus leads to the generation of stable regulatory T cells within the thymus. The Journal of Immunology. 190 (7), 3180-3188 (2013).
  4. Garg, G., et al. Blimp1 Prevents Methylation of Foxp3 and Loss of Regulatory T Cell Identity at Sites of Inflammation. Cell Reports. 26 (7), 1854-1868 (2019).
  5. Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117 (3), 1061-1070 (2011).
  6. Hippen, K. L., et al. Massive ex vivo expansion of human natural regulatory T cells (T(regs)) with minimal loss of in vivo functional activity. Science Translational Medicine. 3 (83), 41(2011).
  7. Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Translational Medicine. 7 (315), 189(2015).
  8. Dromey, J. A., et al. Generation and expansion of regulatory human CD4(+) T-cell clones specific for pancreatic islet autoantigens. Journal of Autoimmunity. 36 (1), 47-55 (2011).
  9. Sabado, R. L., et al. Preparation of tumor antigen-loaded mature dendritic cells for immunotherapy. Journal of Visual Experiments. (78), e50085(2013).
  10. Nowatzky, J., Stagnar, C., Manches, O. OMIP-053: Identification, Classification, and Isolation of Major FoxP3 Expressing Human CD4(+) Treg Subsets. Cytometry A. 95 (3), 264-267 (2019).
  11. Zhang, Y., et al. Genome-wide DNA methylation analysis identifies hypomethylated genes regulated by FOXP3 in human regulatory T cells. Blood. 122 (16), 2823-2836 (2013).
  12. Spreafico, R., et al. A sensitive protocol for FOXP3 epigenetic analysis in scarce human samples. European Journal of Immunology. 44 (10), 3141-3143 (2014).
  13. Collison, L. W., Vignali, D. A. In vitro Treg suppression assays. Methods in Molecular Biology. 707, 21-37 (2011).
  14. Workman, C. J., et al. In vivo Treg suppression assays. Methods in Molecular Biology. 707, 119-156 (2011).
  15. Feng, Y., et al. Control of the inheritance of regulatory T cell identity by a cis element in the Foxp3 locus. Cell. 158 (4), 749-763 (2014).
  16. Toker, A., Huehn, J. To be or not to be a Treg cell: lineage decisions controlled by epigenetic mechanisms. Science Signaling. 4 (158), 4(2011).
  17. Liu, W., et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. Journal of Experimental Medicine. 203 (7), 1701-1711 (2006).
  18. Fuhrman, C. A., et al. Divergent Phenotypes of Human Regulatory T Cells Expressing the Receptors TIGIT and CD226. The Journal of Immunology. 195 (1), 145-155 (2015).
  19. Gu, J., et al. Human CD39(hi) regulatory T cells present stronger stability and function under inflammatory conditions. Cellular & Molecular Immunology. 14 (6), 521-528 (2017).
  20. Genevee, C., et al. An experimentally validated panel of subfamily-specific oligonucleotide primers (V alpha 1-w29/V beta 1-w24) for the study of human T cell receptor variable V gene segment usage by polymerase chain reaction. European Journal of Immunology. 22 (5), 1261-1269 (1992).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

TTregTeffTregTregTreg

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved