İnsan Düzenleyici T Hücresi Klonlarının Üretilmesi

Özet

Bu protokol, Treg'e özgü demetillenmiş bölgede (TSDR) ve Treg'e özgü fenotipik özelliklerde stabil demetilasyon ile ultra yüksek saflıkta canlı insan Treg'inin üretilmesi için insan düzenleyici T hücrelerinin klonlanmasını ve genişletilmesini tanımlar.

Özet

İnsan düzenleyici T hücrelerinin (Treg), mevcut Treg zenginleştirme yöntemleri göz önüne alındığında, yüksek saflıkta izole edilmesi çok zordur. Bu yöntemler, farklı fizyolojik ve patolojik durumlarda değişen ekspresyon seviyelerine sahip çeşitli aktivasyona bağlı hücresel yüzey belirteçleri aracılığıyla Treg'in tanımlanmasına dayanmaktadır. Bu nedenle "Treg" olarak izole edilen popülasyonlar, bu hücrelerin kesin fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonunu, genomik ve proteomik karakterizasyonunu, farklı sağlık ve hastalık durumlarında güvenilir sayımlarını ve ayrıca terapötik amaçlar için izolasyonlarını ve genişlemelerini engelleyen önemli sayıda Treg efektör olmayan hücre (yani Teff) içerir. Özellikle ikincisi, Treg ile ilgili hücresel bölmelerde (örneğin, CD4 ⁺ CD25 ⁺ T hücreleri) bulunan efektör hücrelerin yanlışlıkla genişlemesi, Treg bazlı immünoterapiyi etkisiz ve hatta zararlı hale getirebileceğinden, büyük bir engel olmaya devam etmektedir. Bu çalışma, Treg'in popülasyona dayalı izolasyonu ve genişlemesi ile ilgili sorunları ortadan kaldıran bir yöntem sunmaktadır ve Treg aday klonlarının üretilmesinin, yalnızca dikkatlice incelenmiş, monoklonal hücrelerin müteakip seçimi, kültürü ve genişletilmesi ile birlikte, aylarca kültürde tutulabilen ultra saf bir Treg hücre ürününün üretilmesini sağlar, olası terapötik uygulamalar da dahil olmak üzere bu hücrelerin aşağı akış araştırmasını sağlamak.

Giriş

Bu protokolün amacı, ultra yüksek saflıkta, klonal insan Treg'in in vitro yayılımını sağlamaktır. Treg ile zenginleştirilmiş popülasyonların izolasyonu ve müteakip klonlama, istenen Treg fenotiplerinin seçilmesine ve bu hücrelerin biyolojisinin daha fazla incelenmesi, potansiyel terapötik yararlılıklarının araştırılması ve diğer deneysel aşağı akış uygulamaları için genişletilmesine izin verir.

Treg'in klonlanması, poliklonal izolasyon ve genişleme yaklaşımlarından önemli ölçüde daha iyi Treg saflığı sağlayacaktır. Bunun nedeni, diğerlerinin yanı sıra FOXP3 eksprese eden (FOXP3^intCD45RA^negCD25^int) Treg olmayan ve CD4⁺ CD25⁺ FOXP3- Teff¹ dahil olmak üzere saflaştırılmış popülasyondan benzer veya farklı fenotiplere sahip T efektör hücrelerinin güvenilir^, kontrollü bir şekilde dışlanmasıdır. Bu yaklaşımla elde edilen klonal hücre hatları, çok uzun süreli genişlemeyi (yani birkaç ay) ve hücrelerin in vitro kültürünü pratik olarak imkansız veya en azından son derece zorlayıcı hale getiren, hızla genişleyen Treg olmayan klonlarla aşırı büyüme sorunuyla karşı karşıya kalmaz. Klonal Treg ayrıca, insan iyi niyetli doğal Treg ^1,2,3,4'ü gösteren epigenetik özelliklerin değerlendirilmesi için standart olarak kabul edilen yöntemler de dahil olmak üzere, genişleme sonrası fenotipik özelliklerinin kapsamlı bir şekilde incelenmesine izin verir (örneğin, TSDR'de kararlı demetilasyon).

Treg genişlemesi esas olarak hem araştırma hem de terapötik amaçlar için poliklonal hücre genişlemesi şeklinde gerçekleştirilmiştir ^5,6,7. Teff kontaminasyonu ile ilgili sorunlar, Treg hücre bazlı immünoterapi yaklaşımlarının başarılı bir şekilde uygulanmasının önünde önemli bir engeldir. Literatürde monoklonal Treg'i genişletmek/oluşturmak için önceki girişimler azdır ve uzun vadede Treg özelliklerinin bakımını göstermede başarısız olmuştur⁸.

Bu yöntem, iyi niyetli insan Treg'in hücresel, moleküler ve metabolik özelliklerini inceleyen herkesin ilgisini çekecektir. Özellikle bu protokolün kullanılmasıyla üretilen ultra saf Treg ürünü, genomik yaklaşımlar kullanılarak yapılan analizlere uygundur. Genel olarak insan Treg'ini karakterize eden nispeten düşük genişleme oranları göz önüne alındığında, bu yöntem, çok sayıda hücrenin hızlı bir şekilde genişlemesini arayanlar için sınırlı bir kullanım olabilir. Bununla birlikte, bu protokolle üretilen Treg'in son derece yüksek saflığı göz önüne alındığında, daha az sayıda Treg, üretilen ürünün genel baskılayıcı potansiyelini sınırlayan efektör hücreler içeren poliklonal hücre hatlarının daha büyük genişlemelerine benzer veya hatta daha iyi etkinliğe sahip olabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu protokol, insan örneklerinin kullanımını içeren araştırmaların etik olarak yürütülmesine ilişkin tüm kurumsal yönergeleri takip eder. İnsan hücreleri ve diğer insan kan ürünleri ile çalışma, en azından BLS-2 güvenlik yönergelerine uygun olarak en azından BSL-2 sertifikalı bir ortamda gerçekleştirilmelidir.

1. CD4 ⁺ CD127^loCD25^hi hücreleri için insan periferik kan mononükleer hücrelerinin önceden zenginleştirilmesi

DİKKAT: Baştan sona steril teknik kullanın. Sivri uçları hemen uygun bir kesici alet kabına atın. Atmadan önce kan ve/veya kan ürünleri ile temas eden her şeyi ağartın. Biyogüvenlik kabininde çalışın.

1. Periferik kan alımlarından veya lökoferezden insan lökositleri (yani "lökopaklar") için önceden zenginleştirilmiş insan periferik kanı veya kan ürünleri elde edin. Hücreleri hemen işleyin.
   NOT: Gece boyunca depolamadan kaçınılamıyorsa, hücreleri oda sıcaklığında (RT) saklayın ve taşıyın. Soğuğa maruz kalmaktan kaçının.
2. Periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC'ler) daha önce tarif edildiği gibi yoğunluk gradyan ortamı üzerinde gradyan santrifüjleme ile izole edin⁹.
3. Bir hemositometre veya hücre sayacı kullanarak PBMC'leri dikkatlice sayın. Mümkünse, Treg izolasyonuna devam etmek için en az 300 x 10⁶ PBMC kullanın.
4. PBMC'leri 50 x 10⁶ hücre / mL konsantrasyonda izolasyon tamponunda (fosfat tamponlu salin [PBS] içinde 1.5 mM EDTA ile% 2 havuzlanmış insan AB serumu [PHS-AB]) içinde yeniden askıya alın ve üreticinin talimatlarına göre manyetik ayırmaya devam edin kullanılan ayırma kiti. Örneğin, bir CD4 ⁺ CD127^lo T hücre popülasyonunun negatif izolasyonu için manyetik hücre sıralaması (Malzeme Tablosu) kullanın, ardından CD25 ⁺ hücreleri için pozitif seçim sıralaması yapın.
   NOT: Treg'in manyetik saflaştırılması için kolon tabanlı ve kolonsuz yaklaşımlar dahil olmak üzere çeşitli ürünler kullanılabilir. Alternatif olarak, CD127^loCD25^yüksek CD4 ⁺ T hücreleri üzerinde geçit ile floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) yapılabilir. Bununla birlikte, standart FACS ekipmanı ile tam sterilite mümkün değildir, ancak önemli bir kontaminasyon riski oluşturur. Ek olarak, akışkan sistemi tarafından sağlanan hücresel stres ve hasar göz ardı edilemez ve alet lazerleri sonuçları etkileyebilir.
5. Elde edilen Treg ile zenginleştirilmiş popülasyonu CD4, CD3, CD127 ve CD25 için boyama yoluyla saflık açısından kontrol edin (Şekil 1). Doğru bir sonuç elde etmek için, Malzeme Tablosunda belirtilenden gibi, sıralama kitinde kullanılandan farklı bir CD25 bağlanma alanını tanıyan bir anti-insan CD25 antikoru seçin. Nowatzky ve ^ark.10'da tarif edilene benzer standart bir yüzey boyama protokolü kullanarak hücreleri boyayın ve sabitleyin.

2. Bir CD127^loCD25^hi önceden zenginleştirilmiş insan CD4 ⁺ T hücresi süspansiyonundan Treg'in klonlanması

1. Adım 1.4'te elde edilen Treg ile zenginleştirilmiş (CD4 ⁺ CD127^loCD25^hi) hücreleri T hücre ortamında ([TCM]; RPMI 1640, %5 PHS-AB, %1 streptomisin/penisilin, %1 HEPES, %1 esansiyel olmayan amino asitler ve %1 glutamin) ile 300 IU/mL insan rekombinant interlökin-2 (IL-2) (Malzeme Tablosu) ~1−3 x 10⁶ hücre/mL konsantrasyon ve sayım. Devam etmeden önce en az üç ayrı hücre sayımı elde edin ve ortalama hücre sayılarını hesaplayın, çünkü doğru sayımlar kesinlikle çok önemlidir.
2. İki konsantrasyonda tek hücreli bir hücre süspansiyonu hazırlayın: (1) 3 hücre / mL ve (2) 6 hücre / mL. 100 μL/kuyucuklu süspansiyon 1 ile beş yuvarlak tabanlı 96 kuyulu plaka ve süspansiyon 2 ile beş plaka yükleyin. Sırasıyla 0.3 ve 0.6 hücre / kuyu dağılımı sağlamak için plakaları yüklerken hücreleri süspansiyon halinde tutmaya büyük özen gösterin.
   NOT: Hücre konsantrasyonunu 1 hücreye/kuyuya çıkarmayın, çünkü bu, gerçek klonlar değil, oligoklonal hücre hatları elde etme riskini artırır.
3. Adım 1.2'deki gibi yoğunluk gradyanlı santrifüjleme yoluyla elde edilen taze izole edilmiş insan allojenik PBMC'lerinden besleyici hücreleri hazırlayın.
4. ~ 10 x 10⁶ PBMC / mL konsantrasyonda 50 mL'lik bir polipropilen tüpte IL-2 olmadan TCM'de insan allojenik PBMC'lerini yeniden süspanse ederek ışınlama için klonlama plakası başına en az 10 x 10⁶ besleyici hücre hazırlayın. Tüpü sıkıca kapatın ve bir gama ışınlayıcıda veya X-ışını tabanlı bir ışınlama cihazında 35 Gy ile ışınlayın.
   NOT: Işınlama, Teff'in proliferasyonunu kolaylaştıran besleyicilerden büyük miktarlarda sitokin salgılanmasını tetikler, ancak Treg genişlemesini olumsuz etkileyebilir. Bunlar daha sonra yıkanarak çıkarılacaktır.
5. Işınlamadan sonra hücreleri 450 x g ve RT'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Hücreleri, ortam/PBS'nin peletlenmiş besleyici hücre hacminin en az 2 katını kullanarak IL-10 olmadan TCM'de yeniden süspanse ederek yıkayın.
   NOT: Klonlanacak donör hücrelerin insan lökosit antijeni (HLA) ekspresyon profilinin belirlenmesi önerilir. Bu, ilgili bir donörün türetildiği popülasyonda yaygın olan bir veya birkaç HLA tipi için basit boyama yoluyla yapılabilir (yani, HLA-A2 veya HLA-A24). Besleyici hücreler olarak kullanılan PBMC, besleyicilerin ışınlamaya bağlı apoptozundan önce hedef hücrelerin genleşme kültürlerinden yeniden tanımlanmasını/izolasyonunu sağlamak için bu HLA'yı eksprese etmemelidir.
6. Işınlanmış ve yıkanmış besleyici hücreleri TCM'de 300 IU / mL IL-2 ile 1 x 10⁶ hücre / mL konsantrasyonda yeniden süspanse edin.
7. 4 μg/mL konsantrasyonda (kültürde gerekli konsantrasyonun 2 katı) fitohemaglutinin-L (PHA-L) (Malzeme Tablosu) ekleyin ve hızlı bir şekilde adım 2.8'e geçin.
8. Kaplanmış Treg ile zenginleştirilmiş hücrelere 4 μg / mL PHA-L ve 300 IU / mL IL-2 ile 100 μL TCM'de 100.000 ışınlanmış besleyici hücre ekleyin, bu da toplam 200 μL hacim ve her kuyucukta 2 μg / mL PHA-L konsantrasyonu ile sonuçlanır. 5 kat yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Besleyici hücrelerin Treg'e eklenmeden önce PHA-L'ye maruz kalma süresini gereken mutlak minimuma sınırlayın ve kaplanana kadar süspansiyon halinde tutun.
   NOT: İlk tohumlama adımında kültürde 2 μg/mL'lik bir PHA-L konsantrasyonu sağlayın, ancak Treg klonlarının müteakip genişlemesi üzerine daha düşük bir 1 μg/mL konsantrasyon kullanın. Boyunca 300 IU / mL IL-2 kullanın.
9. 37 °C'de inkübe edin. TCM kullanarak ortamın% 50'sini 300 IU / mL IL-2 ile değiştirin, ancak 5-7. günlerde PHA-L olmadan.

3. Treg'in genişletilmesi ve kültürde klonların bakımı

1. 12. günden başlayarak, çoğalan hücrelerin peletlerinin varlığı için kültürleri kontrol edin.
   NOT: Besleyici hücreler tarafından oluşturulan topaklar olacaktır, ancak mikroskobik incelemede bunlar küçük, yuvarlak, ölmekte olan veya ölü hücreler olarak görünecektir, oysa çoğalan T hücreleri boyut olarak daha büyük olacak, parlak kontrast ve sağlıklı görünüme sahip olacak ve genellikle makroskopik incelemede kahverengi görünen bitişik hücre kümeleri oluşturacaktır.
2. Her 1-2 günde bir kültürleri incelemeye devam edin. Çoğalan geçici klonları tek kuyucuklara aktararak izole edin. Diğer kuyucuklardan kasıtsız hücre transferi olsa da, herhangi bir geçici veya yerleşik klonun çapraz kontaminasyonunu önlemek için her bir geçici klonu tek bir 96 kuyulu plakaya yerleştirin.
3. Her 2-3 günde bir% 50 ortam değişikliği ile hücreleri koruyun ve gerektiği gibi bölün. Hücreleri yakından izleyin.
   NOT: Ortam değişikliklerini ve bölünmeyi geciktirmek hücrelere zarar verebilir ve "aşırı bölünme" çoğalmalarını durdurabilir ve hücre ölümüne neden olabilir.
4. Adım 2.3-2.9'da tarif edildiği gibi ışınlanmış allojenik besleyicilerle hücreleri yeniden uyarın, ancak daha düşük PHA-L konsantrasyonları kullanın (ör., 300 IU / mL IL-2 ile TCM'de 1 μg / mL). Hücre boyutu küçüldüğünde ve hücreler, tipik olarak 2-3 hafta sonra olan uzun ovalin aksine yuvarlak hale geldiğinde yeniden uyarın.
   NOT: Orijinal klonlama kültürünü en az 6-8 hafta koruyun. 2 hafta içinde veya kısa bir süre sonra görünür hale gelen 'erken' klonların çoğu gerçek Treg değil, hızlı çoğalan Treg/Teff olmayan hücreler olma eğilimindedir ve bazılarının kültürde gözle görülür şekilde görünmesi 1 aydan fazla sürecek olan 'geç' hücrelere göre incelemede başarısız olma olasılığı daha yüksektir.

4. Geçici Treg klonlarının incelenmesi

1. Monoklonalite ve TSDR metilasyon durumu için ~ 1 x 10⁶ hücreye çoğaldıktan sonra geçici klonların incelemesine başlayın.
2. İsteğe bağlı olarak, daha fazla değerlendirme için ilgilenenleri tanımlamak için CD3, CD4, CD127 ve CD25 için boyama yoluyla hücre genişlemelerini ön eleme yapın (yani, CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD127^loCD25^hi) (Şekil 2).
3. Ticari olarak temin edilebilen boyama antikorları setlerini kullanarak Vβ boyama ile hücresel üründe tek bir Vβ zincirinin varlığının tanımlanması yoluyla monoklonalite oluşturun (Malzeme Tablosu; Şekil 3) üreticinin talimatlarına uyarak. Güvenilir bir analiz için numuneleri bir akış sitometresinde çalıştırırken en az 1 x 10⁶ olay elde ettiğinizden emin olun, böylece küçük kirletici popülasyonlar tespit edilebilir. Bir canlılık boyası kullanın.
4. Ticari sağlayıcılar veya kurum içi^11,12 tarafından değerlendirilen FOXP3 lokusunda TSDR metilasyon durumuna sahip olun. Yeterli sonuçlar için en az 1 x 10⁵ hücre elde edin.
5. Adım 4.3 ve 4.4'te Treg kimliği ve klonalitesi doğrulandıktan sonra, hücreleri kriyoprezervasyon yapın veya aşağı akış uygulamaları için kullanın.
   NOT: Alternatif, ancak çok daha az güvenilir inceleme yaklaşımları, FACS boyamaları ^1,10 ve in vitro veya in vivo supresyon testleri^13,14 ile Treg fenotipini belirlemektir. Treg baskılama testlerine aşırı güvenmekten kaçının¹³. Tahliller tipik olarak, ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, üçüncü taraf antijen sunan hücrelerin varlığında yanıtlayıcı T hücreleri (yani, PBMC veya saflaştırılmış T hücreleri, bazen Treg tükenmiş) veya CD3 / CD28 ile dereceli sayılarda Treg'in kokültürüne dayanır. Bu tahlillerin birçoğunun ciddi sınırlamaları vardır ve Treg'in aracılık ettiği gerçek baskılama derecesini abartabilir veya hafife alabilir. TSDR metilasyon durumu, Treg fenotipinin veya "kimliğinin" en kesin / güvenilir ölçüsü olmaya devam etmektedir3,15,16. FOXP3'ün X kromozomu üzerinde bulunduğunu ve kadınlarda bir X kromozomunun DNA metilasyonu ile inaktive edildiğini ve bunun TSDR metilasyon analizinin sonuçlarını etkilediğini unutmayın.

5. Treg'in Kriyoprezervasyonu

NOT: Treg, DMSO ve PHS-AB ile başarılı bir kriyoprezervasyondan sonra uzun süreli saklanabilir.

1. Hücreleri kriyoprezervasyon yapmak için gereken kriyoviyal sayısını belirleyin. Bu, kriyoprezervasyon yapılacak toplam nihai hücre süspansiyonu hacmine (mL cinsinden) eşittir, çünkü flakon başına 1 mL dondurulur. Pipetleme/yüzey geriliminden kaynaklanan kayıpları hesaba katmak için bu hacme %10'luk bir güvenlik payı ekleyin.
   NOT: Hücreler, tipik olarak 0.1−100 x 10⁶ hücre / mL arasında olmak üzere geniş bir konsantrasyon aralığında kriyoprezervasyonla saklanabilir.
2. Kriyovialleri etiketleyin.
3. Çözelti A (SA) oluşturun:% 50 RPMI ve% 50 PHS-AB veya insan plazmasını karıştırın. Plazma kullanılıyorsa, 4 ° C'de 20 dakika boyunca 2.000 x g'da döndürün.
   NOT: SA hacmi, adım 5.1'de belirlendiği gibi kriyoprezervasyonla saklanacak hücre süspansiyonunun toplam nihai hacminin %75'i olmalıdır.
4. Çözelti B (SB) oluşturun:% 60 (h / v) PBS veya RPMI ve% 40 (h / h) dimetil sülfoksit (DMSO) karıştırın.
   NOT: SB hacmi, adım 5.1'de belirlendiği gibi kriyoprezervasyonla saklanacak toplam nihai hücre süspansiyonu hacminin %25'i olmalıdır.
5. Her iki çözeltiyi de 4 °C'ye soğutun.
6. SB'nin tamamını eşit miktarda SA ile karıştırarak dondurma ortamını hazırlayın ve buz üzerinde tutun.
7. Treg'i adım 4.5'ten itibaren 450 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca sıkın. Ortamı aspire edin ve atın ve kalan buz gibi SA'daki hücreleri yeniden askıya alın ve buz üzerinde tutun.
8. Soğutulmuş dondurma ortamını 1: 1 oranında, tüpü sallarken buz üzerinde büyük bir tüpte SA'da yeniden süspanse edilen hücrelere yavaşça ekleyin.
9. 1 mL / flakonda kriyoviyallere hızlı bir şekilde alikot edin. Kriyovialleri hemen RT'de bir dolap kutusuna yerleştirin ve gecikmeden -80 °C'lik bir dondurucuya aktarın. 24 saat sonra sıvı_N2'ye aktarın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanması, kararlı insan düzenleyici T hücresi klonlarının ve hatlarının üretilmesine yol açacaktır.

CD4 ⁺ CD127^loCD25^hi hücrelerinin ön seçimi/ön zenginleştirilmesi, çoğu insan Treg'ini içeren bir başlangıç popülasyonu elde etmek için basit bir yöntemdi (Şekil 1A-C). Tüm klonlar bir Treg fenotipi göstermedi. CD2...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokol, Treg içeren başlangıç popülasyonlarından sınırlayıcı bir seyreltme ve besleyici hücre bazlı genişleme yaklaşımında elde edilen hücrelerin izolasyonu, genişlemesi ve dikkatli bir şekilde incelenmesi yoluyla ultra saf insan düzenleyici T hücrelerinin yayılmasını tanımlar.

Bu yaklaşımdaki kritik adımlar şunlardır: 1) uygun bir başlangıç popülasyonunun seçimi. Genel olarak, insan PBMC'si içindeki CD4 ⁺ T ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Stericup, 500 mL	Millipore	5500	Media storage and preparation
100x Nonessential amino acids	Gibco	11140-050	Media component
15 mL conical centrifuge tubes (50/bag, case of 500)	ThermoFisher Scientific	339650
1M HEPES	Gibco	15630-080	Media component
25 ml Single Well Pipet Basin	Fischer Scientific	13-681-508
50 mL Conical Centrifuge Tube (25/sleeve)	ThermoFisher Scientific	339652
50x Penicillin Streptomycin Soln	Corning	Corning, 30-001-Cl	Media component
CryoTube Vial Int Thread Round Btm Starfoot PP Screw Stopper Sterile PP 1.8 mL	Nalge Nunc	377267
DMSO	Corning	25-950-CQC
EasySep Human CD25 positive selection kit	Stemcell Technologies	18231	Alternatives are FACS or MACS column-based sorting
EasySep Human CD4+CD127low T cell Pre-Enrichment Kit	Stemcell Technologies	19231	Alternatives are FACS or MACS column-based sorting
EasySep Human CD4+CD127lowCD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit (alternative to item 12)	Stemcell Technologies	18063	Alternatives are FACS or MACS column-based sorting
Ficoll	GE Healthcare	17-5442-03	PBMC purification from peripheral blood of leukapheresis products; density gradient medium
Human AB Serum (PHS-AB)	Valley Biomedical Inc	HP1022	Media component
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation	Thermo Fischer	L-34962	Viability dye
Phytohemagglutinin-L (PHA-L)	Millipore/Sigma	11249738001	T cell stimulation
Recombinant IL-2 (e.g., PROLEUKINâ)	Prometheus		T cell stimulation and maintenance/ Media component
RPMI 1640	Gibco	21870-076	Media component
Staining antibodies for flowcytometry (Treg phenotyping)	See "Comments"	See "Comments"	Staining antibodies are enlisted in: Nowatzky et al. (2019) PubMed PMID: 30584695; PubMed Central PMCID: PMC6497402. In case EasySep Human CD25 positive selection kit is used, stain with 2A3 or BC96 anti-CD25 antibody, e.g.: Brilliant Violet 421 anti-human CD25 Antibody (Biolegend; 302629)
TCR Vβ Repertoire Kit; IOTest Beta Mark	Beckman Coulter	PN IM3497	Vetting of expansions for monoclonality
Tissue Culture Plate, 96 Well, U-Bottom with Low Evaporation Lid	Corning	353077