Generación de clones de células T reguladoras humanas

Resumen

Este protocolo describe la clonación y expansión de células T reguladoras humanas para la generación de Treg humanas viables de ultra alta pureza con desmetilación estable en la región desmetilada específica de Treg (TSDR) y características fenotípicas específicas de Treg.

Resumen

Las células T reguladoras humanas (Treg) son notoriamente difíciles de aislar en alta pureza dados los métodos actuales de enriquecimiento de Treg. Estos métodos se basan en la identificación de Treg a través de varios marcadores de superficie celular dependientes de la activación con diferentes niveles de expresión en diferentes condiciones fisiológicas y patológicas. Por lo tanto, las poblaciones aisladas como "Treg" a menudo contienen un número considerable de células efectoras no Treg (es decir, Teff) que dificultan la caracterización fenotípica y funcional precisa de estas células, su caracterización genómica y proteómica, su enumeración confiable en diferentes estados de salud y enfermedad, así como su aislamiento y expansión con fines terapéuticos. Esto último, en particular, sigue siendo un obstáculo importante, ya que la expansión inadvertida de las células efectoras que se encuentran en compartimentos celulares relevantes para Treg (por ejemplo, células T CD4 ⁺ CD25 ⁺ ) puede hacer que la inmunoterapia basada en Treg sea ineficaz o incluso perjudicial. Este trabajo presenta un método que evita los problemas asociados con el aislamiento y la expansión de Treg basados en la población y muestra que la generación de clones candidatos a Treg con la posterior selección, cultivo y expansión de solo células monoclonales cuidadosamente examinadas, permite la generación de un producto de células Treg ultrapuras que se puede mantener en cultivo durante muchos meses. permitiendo la investigación posterior de estas células, incluso para posibles aplicaciones terapéuticas.

Introducción

El propósito de este protocolo es permitir la propagación in vitro de Treg humano clonal de ultra alta pureza. El aislamiento de las poblaciones enriquecidas con Treg y la posterior clonación permiten la selección de los fenotipos deseados de Treg y su expansión para un estudio más detallado de la biología de estas células, la exploración de su posible utilidad terapéutica y otras aplicaciones experimentales posteriores.

La clonación de Treg producirá una pureza de Treg significativamente mejor que los enfoques de aislamiento y expansión policlonal. Esto se debe a la exclusión fiable y controlada de células T efectoras con fenotipos similares o diferentes de la población purificada, incluidas las que expresan FOXP3 (FOXP3^int, CD45RA,^neg, CD25^int), no Treg y CD4⁺, CD25⁺, FOXP3-Teff¹, entre otras. Las líneas celulares clonales obtenidas mediante este enfoque no se enfrentan al problema del crecimiento excesivo con clones no Treg de rápida expansión que hacen que la expansión a muy largo plazo (es decir, varios meses) y el cultivo in vitro de las células sean prácticamente imposibles o al menos extremadamente desafiantes. Las Treg clonales también permiten una investigación exhaustiva de sus características fenotípicas después de la expansión, incluso a través de métodos reconocidos como estándar para la evaluación de las características epigenéticas indicativas de^Treg 1,2,3,4 naturales humanas de buena fe (por ejemplo, desmetilación estable en el TSDR).

La expansión de Treg se ha realizado principalmente en forma de expansión de células policlonales tanto con fines investigativos como terapéuticos ^5,6,7. Los problemas con la contaminación por Teff son un obstáculo importante para la implementación exitosa de los enfoques de inmunoterapia basados en células Treg. Los intentos previos de expandir/generar Treg monoclonales en la literatura son escasos y no han demostrado el mantenimiento de las características de Treg a largo plazo⁸.

Este método será de interés para cualquier persona que estudie las propiedades celulares, moleculares y metabólicas de las Treg humanas genuinas . El producto Treg ultrapuro generado mediante el uso de este protocolo en particular se presta a análisis mediante enfoques genómicos. Dadas las tasas de expansión relativamente bajas que caracterizan a las Treg humanas en general, este método puede ser de uso limitado para aquellos que buscan la expansión rápida de un número masivo de células. Sin embargo, dada la pureza extremadamente alta de las Treg generadas con este protocolo, un número menor de Treg puede tener una eficacia similar o incluso mejor que las expansiones más grandes de líneas celulares policlonales que contienen células efectoras que limitan el potencial supresor general del producto generado.

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Protocolo

Este protocolo sigue todas las directrices institucionales relativas a la conducta ética de la investigación que implica el uso de muestras humanas. El trabajo con células humanas y otros productos sanguíneos humanos debe realizarse al menos en un entorno con certificación BSL-2 siguiendo las pautas de seguridad BLS-2 como mínimo.

1. Preenriquecimiento de células mononucleares de sangre periférica humana para células CD4 ⁺ CD127^loCD25^hi

PRECAUCIÓN: Utilice una técnica estéril en todo momento. Deseche los objetos punzocortantes inmediatamente en un recipiente adecuado para objetos punzocortantes. Blanquee cualquier cosa que haya entrado en contacto con sangre y/o productos sanguíneos antes de desecharlos. Trabaja en un gabinete de bioseguridad.

1. Obtener sangre periférica humana o productos sanguíneos preenriquecidos para leucocitos humanos (es decir, "leucópakos") a partir de extracciones de sangre periférica o leucoféresis. Procese las celdas inmediatamente.
   NOTA: Si no se puede evitar el almacenamiento durante la noche, almacene y transporte las celdas a temperatura ambiente (RT). Evite la exposición al frío.
2. Aislar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante centrifugación en gradiente sobre medio de gradiente de densidad como se describió anteriormente⁹.
3. Cuente cuidadosamente las PBMC usando un hemocitómetro o un contador de células. Si es posible, use al menos 300 x 10⁶ PBMC para continuar con el aislamiento de Treg.
4. Vuelva a suspender las PBMC en tampón de aislamiento (suero AB humano combinado al 2% [PHS-AB] con EDTA 1,5 mM en solución salina tamponada con fosfato [PBS]) a una concentración de 50 x 10⁶ células/ml y proceda con la clasificación magnética de acuerdo con las instrucciones del fabricante del kit de clasificación utilizado. Por ejemplo, utilice la clasificación por células magnéticas (Tabla de materiales) para el aislamiento negativo de una población de células T CD4⁺CD127^lo , seguida de una clasificación por selección positiva para las células CD25⁺ .
   NOTA: Se puede utilizar una variedad de productos para la purificación magnética de Treg, incluidos los enfoques basados en columnas y sin columnas. Alternativamente, se puede realizar la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) con compuerta en células T CD4^{+ CD4+ altas} en CD127^oCD25. Sin embargo, la esterilidad completa no es posible con el equipo FACS estándar, lo que representa un riesgo significativo de contaminación. Además, no se puede excluir el estrés celular y el daño conferido por el sistema de fluidos, y los láseres de los instrumentos pueden afectar los resultados.
5. Verifique la pureza de la población enriquecida con Treg resultante mediante tinción para CD4, CD3, CD127 y CD25 (Figura 1). Elija un anticuerpo anti-CD25 humano que reconozca un dominio de unión a CD25 diferente al utilizado en el kit de clasificación, como el especificado en la Tabla de Materiales, para obtener un resultado preciso. Teñir y fijar las células utilizando un protocolo estándar de tinción de superficies, como el descrito en Nowatzky et ^al.10.

2. Clonación de Treg a partir de una suspensión de células T CD4+ humanas CD4^{+ altamente} enriquecidas con CD127^loCD25

1. Vuelva a suspender las células enriquecidas con Treg (CD4⁺CD127^loCD25^hi) obtenidas en el paso 1.4 en medios de células T ([TCM]; RPMI 1640, 5% PHS-AB, 1% estreptomicina/penicilina, 1% HEPES, 1% aminoácidos no esenciales y 1% glutamina) con 300 UI/mL de interleucina-2 recombinante humana (IL-2) (Tabla de Materiales) con el objetivo de una concentración de ~1−3 x 10⁶ células/mL y recuento. Obtenga al menos tres recuentos de celdas separados y calcule el número promedio de celdas antes de continuar, ya que los recuentos precisos son absolutamente cruciales.
2. Prepare una suspensión de células de una sola célula a dos concentraciones: (1) 3 células/mL y (2) 6 células/mL. Cargue cinco placas de 96 pocillos de fondo redondo con 100 μL/pocillo de suspensión 1 y cinco placas con suspensión 2. Tenga mucho cuidado de mantener las células en suspensión al cargar las placas para garantizar una distribución de 0,3 y 0,6 células/pocillo, respectivamente.
   NOTA: No aumente la concentración celular a 1 célula/pocillo, ya que esto aumenta el riesgo de obtener líneas celulares oligoclonales y no clones verdaderos.
3. Prepare las células alimentadoras a partir de PBMC alogénicas humanas recién aisladas obtenidas mediante centrifugación en gradiente de densidad, como se indica en el paso 1.2.
4. Prepare al menos 10 x 10⁶ células alimentadoras por placa de clonación para la irradiación resuspendiendo PBMC alogénicas humanas en MTC sin IL-2 en un tubo de polipropileno de 50 mL a una concentración de ~10 x 10⁶ PBMC/mL. Cierre herméticamente el tubo e irradie con 35 Gy en un irradiador gamma o en un dispositivo de irradiación basado en rayos X.
   NOTA: La irradiación desencadena la secreción de grandes cantidades de citocinas de los alimentadores que facilitan la proliferación de Teff, pero pueden afectar negativamente la expansión de Treg. A continuación, se eliminarán mediante lavado.
5. Centrifugar las células a 450 x g y RT durante 5 min después de la irradiación y aspirar el sobrenadante. Lave las células resuspendiéndolas en TCM sin IL-2 utilizando al menos 10 veces el volumen de la célula alimentadora peletizada de medios/PBS.
   NOTA: Se recomienda determinar un perfil de expresión del antígeno leucocitario humano (HLA) de las células donantes a clonar. Esto se puede hacer a través de una tinción simple para uno o varios tipos de HLA que son comunes en la población de la que se deriva un donante respectivo (es decir, HLA-A2 o HLA-A24). Las PBMC utilizadas como células alimentadoras no deben expresar este HLA para permitir la reidentificación/aislamiento de las células diana de los cultivos en expansión antes de la apoptosis inducida por irradiación de los alimentadores.
6. Vuelva a suspender las células alimentadoras irradiadas y lavadas en TCM con 300 UI/mL de IL-2 a una concentración de 1 x 10⁶ células/mL.
7. Añada fitohemaglutinina-L (PHA-L) (tabla de materiales) a una concentración de 4 μg/mL (2 veces la concentración requerida en cultivo) y proceda rápidamente al paso 2.8.
8. Agregue 100,000 celdas alimentadoras irradiadas en 100 μL de MTC con 4 μg/mL de PHA-L y 300 UI/mL de IL-2 a las celdas enriquecidas con Treg en placas, lo que da como resultado un volumen total de 200 μL y una concentración de PHA-L de 2 μg/mL en cada pocillo. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5 veces. Limite el tiempo de exposición de las celdas alimentadoras a PHA-L antes de su adición al Treg al mínimo absoluto necesario, y manténgalas en suspensión hasta que estén placadas.
   NOTA: Asegure una concentración de PHA-L de 2 μg/mL en el cultivo en el paso inicial de siembra, pero utilice una concentración más baja de 1 μg/mL en la expansión posterior de los clones de Treg. Use 300 UI/mL de IL-2 en todo momento.
9. Incubar a 37 °C. Cambie el 50% de los medios usando TCM con 300 UI/mL de IL-2 pero sin PHA-L en los días 5-7.

3. Expansión de Treg y mantenimiento de clones en cultivo

1. A partir del día 12, verifique los cultivos para detectar la presencia de gránulos de células en proliferación.
   NOTA: Habrá gránulos formados por células alimentadoras, pero en el examen microscópico aparecerán como células pequeñas, redondas, moribundas o muertas, mientras que las células T en proliferación serán de mayor tamaño, con contraste brillante y apariencia saludable, a menudo formando grupos de células adyacentes que parecen marrones en el examen macroscópico.
2. Continúe examinando los cultivos cada 1 o 2 días. Aislar clones tentativos en proliferación transfiriéndolos a pocillos individuales. Coloque cada clon tentativo en una sola placa de 96 pocillos para evitar la contaminación cruzada de cualquier clon tentativo o establecido a través de la transferencia inadvertida de células desde otros pocillos.
3. Mantenga las celdas a través del 50% de los cambios de medio cada 2-3 días y divídalas según sea necesario. Monitoree las células de cerca.
   NOTA: Retrasar los cambios de medios y la división puede dañar las células y la "división excesiva" puede detener su proliferación y provocar la muerte de la célula.
4. Reestimule las células con alimentadores alogénicos irradiados como se describe en los pasos 2.3-2.9, pero use concentraciones más bajas de PHA-L (es decir, 1 μg/mL en TCM con 300 UI/mL IL-2). Reestimule cuando el tamaño de las células disminuye y las células se vuelven redondas en lugar de ovaladas alargadas, que suele ser después de 2-3 semanas.
   NOTA: Mantenga el cultivo de clonación original durante al menos 6 a 8 semanas. Muchos de los clones "tempranos" que se hacen visibles a las 2 semanas o poco después tienden a no ser verdaderas células Treg, sino células no Treg/Teff que proliferan rápidamente y tienen más probabilidades de fallar en la investigación que las células "tardías", algunas de las cuales tardarán más de 1 mes en aparecer visiblemente en cultivo.

4. Verificación de clones tentativos de Treg

1. Comience la investigación de los clones tentativos una vez que hayan proliferado a ~ 1 x 10⁶ células para la monoclonalidad y el estado de metilación de TSDR.
2. Opcionalmente, se preseleccionan las expansiones celulares mediante tinción para CD3, CD4, CD127 y CD25 con el fin de identificar las de interés (es decir, CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD127^aCD25^hi) para una evaluación posterior (Figura 2).
3. Establecer la monoclonalidad a través de la identificación de la presencia de una sola cadena Vβ en el producto celular mediante tinción de Vβ utilizando conjuntos de anticuerpos de tinción disponibles comercialmente (Tabla de materiales; Figura 3) siguiendo las instrucciones del fabricante. Asegúrese de adquirir al menos 1 x 10⁶ eventos al ejecutar muestras en un citómetro de flujo para un análisis confiable, de modo que se puedan detectar poblaciones contaminantes menores. Usa un tinte de viabilidad.
4. Tener el estado de metilación de TSDR en el locus FOXP3 evaluado por proveedores comerciales o internos^11,12. Obtenga al menos 1 x 10⁵ celdas para obtener resultados adecuados.
5. Una vez que se hayan confirmado la identidad y la clonalidad de Treg en los pasos 4.3 y 4.4, criopreservar las células o utilizarlas para aplicaciones posteriores.
   NOTA: Enfoques de investigación alternativos, pero mucho menos fiables, son la determinación del fenotipo Treg mediante tinciones FACS ^1,10 y ensayos de supresión in vitro o in vivo^13,14. Evite la dependencia excesiva de los ensayos de supresión de Treg¹³. Los ensayos se basan típicamente, pero no exclusivamente, en el cocultivo de Treg en números graduados con células T respondedoras (es decir, PBMC o células T purificadas, a veces con depleción de Treg) en presencia de células presentadoras de antígenos de terceros o CD3/CD28 con dilución de colorante que representa la proliferación como lectura. Muchos de estos ensayos tienen severas limitaciones y pueden sobrestimar o subestimar el grado real de supresión mediado por Treg. El estado de metilación de TSDR sigue siendo la medida más definida/fiable del fenotipo o "identidad" de Treg3,15,16. Tenga en cuenta que FOXP3 se encuentra en el cromosoma X y, en las mujeres, un cromosoma X es inactivado por la metilación del ADN, lo que afecta los resultados del análisis de metilación TSDR.

5. Criopreservación de Treg

NOTA: Treg se puede almacenar a largo plazo después de una criopreservación exitosa con DMSO y PHS-AB.

1. Determinar el número de crioviales necesarios para criopreservar las células. Esto es igual al volumen final total de la suspensión celular (en mL) que se va a criopreservar, porque se congela 1 mL por vial. Agregue un margen de seguridad del 10% a este volumen para tener en cuenta las pérdidas debidas al pipeteo/tensión superficial.
   NOTA: Las células se pueden criopreservar en una amplia gama de concentraciones, normalmente entre 0,1 y 100 x 10⁶ células/mL.
2. Etiquete los crioviales.
3. Generar solución A (SA): mezclar 50% RPMI y 50% PHS-AB o plasma humano. Si se utiliza plasma, centrifugar a 2.000 x g durante 20 min a 4 °C.
   NOTA: El volumen de SA debe ser el 75% del volumen final total de la suspensión celular que se va a criopreservar, según lo determinado en el paso 5.1.
4. Generar solución B (SB): mezclar 60% (v/v) de PBS o RPMI y 40% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO).
   NOTA: El volumen de SB debe ser el 25% del volumen final total de la suspensión celular a criopreservar, según lo determinado en el paso 5.1.
5. Enfríe ambas soluciones a 4 °C.
6. Prepare el medio de congelación mezclando todo SB con partes iguales de SA y manténgalo en hielo.
7. Gira Treg desde el paso 4.5 a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Aspire y deseche los medios, y vuelva a suspender las células en el SA helado restante y manténgalo en hielo.
8. Agregue lentamente el medio de congelación enfriado 1:1 a las células resuspendidas en SA en un tubo grande sobre hielo mientras agita el tubo.
9. Alícuota rápida en crioviales a 1 mL/vial. Coloque inmediatamente los crioviales en una caja de armario en RT y transfiéralos a un congelador de -80 °C sin demora. Trasvasar a líquido N₂ después de 24 h.

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Resultados

La implementación exitosa de este protocolo conducirá a la generación de clones y líneas de células T reguladoras humanas estables.

La preselección/preenriquecimiento de las células CD4⁺CD127^loCD25^hi fue un método sencillo para obtener una población inicial que contuviera la mayor parte de las células Treg humanas (Figura 1A-C). No todos los clones mostraron un fenotipo T...

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Discusión

Este protocolo describe la propagación de células T reguladoras humanas ultrapuras a través del aislamiento, la expansión y la investigación cuidadosa de las células obtenidas en un enfoque de dilución limitante y expansión basado en células alimentadoras a partir de poblaciones iniciales que contienen Treg.

Los pasos críticos en este enfoque son: 1) la elección de una población inicial apropiada. En general, el compartimento CD127^loCD25...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Stericup, 500 mL	Millipore	5500	Media storage and preparation
100x Nonessential amino acids	Gibco	11140-050	Media component
15 mL conical centrifuge tubes (50/bag, case of 500)	ThermoFisher Scientific	339650
1M HEPES	Gibco	15630-080	Media component
25 ml Single Well Pipet Basin	Fischer Scientific	13-681-508
50 mL Conical Centrifuge Tube (25/sleeve)	ThermoFisher Scientific	339652
50x Penicillin Streptomycin Soln	Corning	Corning, 30-001-Cl	Media component
CryoTube Vial Int Thread Round Btm Starfoot PP Screw Stopper Sterile PP 1.8 mL	Nalge Nunc	377267
DMSO	Corning	25-950-CQC
EasySep Human CD25 positive selection kit	Stemcell Technologies	18231	Alternatives are FACS or MACS column-based sorting
EasySep Human CD4+CD127low T cell Pre-Enrichment Kit	Stemcell Technologies	19231	Alternatives are FACS or MACS column-based sorting
EasySep Human CD4+CD127lowCD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit (alternative to item 12)	Stemcell Technologies	18063	Alternatives are FACS or MACS column-based sorting
Ficoll	GE Healthcare	17-5442-03	PBMC purification from peripheral blood of leukapheresis products; density gradient medium
Human AB Serum (PHS-AB)	Valley Biomedical Inc	HP1022	Media component
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation	Thermo Fischer	L-34962	Viability dye
Phytohemagglutinin-L (PHA-L)	Millipore/Sigma	11249738001	T cell stimulation
Recombinant IL-2 (e.g., PROLEUKINâ)	Prometheus		T cell stimulation and maintenance/ Media component
RPMI 1640	Gibco	21870-076	Media component
Staining antibodies for flowcytometry (Treg phenotyping)	See "Comments"	See "Comments"	Staining antibodies are enlisted in: Nowatzky et al. (2019) PubMed PMID: 30584695; PubMed Central PMCID: PMC6497402. In case EasySep Human CD25 positive selection kit is used, stain with 2A3 or BC96 anti-CD25 antibody, e.g.: Brilliant Violet 421 anti-human CD25 Antibody (Biolegend; 302629)
TCR Vβ Repertoire Kit; IOTest Beta Mark	Beckman Coulter	PN IM3497	Vetting of expansions for monoclonality
Tissue Culture Plate, 96 Well, U-Bottom with Low Evaporation Lid	Corning	353077