Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

لدراسة مرافق مرافق ومرافق التفاعلات الركيزة، ونحن أداء شاشات التفاعل الاصطناعية في Elegans Caenorhabditis باستخدام تدخل الجيش الملكي النيبالي في تركيبة مع الطفرات الخفيفة أو الإفراط في التعبير عن المرافقين ورصد خلل البروتين الأنسجة محددة على مستوى الكائن الحي.

Abstract

للطي الصحيح وتجميع البروتينات ومجمعات البروتين ضرورية لوظيفة الخلوية. تستخدم الخلايا مسارات مراقبة الجودة التي تصحح البروتينات التالفة أو تعزلها أو تقضي عليها للحفاظ على بروتيوم صحي ، وبالتالي ضمان البروتيستاسيس الخلوي ومنع المزيد من تلف البروتين. بسبب الوظائف الزائدة داخل شبكة البروتيوستاسي ، يؤدي فحص الأنماط الظاهرية القابلة للكشف باستخدام الضربة القاضية أو الطفرات في الجينات ترميز المرافقين في الكائن الحي متعدد الخلايا Caenorhabditis elegans إلى الكشف عن الأنماط الظاهرية البسيطة أو معدومة في معظم الحالات. لقد وضعنا استراتيجية فحص مستهدفة لتحديد المرافقين المطلوبين لوظيفة محددة وبالتالي سد الفجوة بين النمط الظاهري والوظيفة. على وجه التحديد ، نحن نراقب تفاعلات المرافق الجديدة باستخدام شاشات التفاعل الاصطناعية RNAi ، والتعبير عن المرافق ، ومرافق واحد في وقت واحد ، في الحيوانات التي تحمل طفرة في جين ترميز المرافق أو الإفراط في التعبير عن مرافق من الاهتمام. من خلال تعطيل اثنين من المرافقين التي تقدم بشكل فردي أي النمط الظاهري الإجمالي، يمكننا تحديد المرافقين التي تفاقم أو فضح النمط الظاهري محددة عندما يكون كل من المضطربة. ونحن نثبت أن هذا النهج يمكن تحديد مجموعات محددة من المرافقين التي تعمل معا لتعديل طي مجمعات البروتين أو البروتين المرتبطة النمط الظاهري معين.

Introduction

الخلايا التعامل مع تلف البروتين عن طريق استخدام آلات مراقبة الجودة التي إصلاح, عزل أو إزالة أي البروتينات التالفة1,2. ويدعم للطي وتجميع مجمعات البروتين من قبل المرافقين الجزيئية، ومجموعة متنوعة من البروتينات المحفوظة للغاية التي يمكن إصلاح أو عزل البروتينات التالفة3،4،5،6،7. تتم إزالة البروتينات التالفة بوساطة نظام ubiquitin-proteasome (UPS)8 أو بواسطة الآلات autophagy9 بالتعاون مع المرافقين10،11،12. البروتين التوازن (proteostasis) هو، لذلك، التي تحتفظ بها شبكات مراقبة الجودة تتألف من للطي والآلات تدهور3،13. ومع ذلك ، فإن فهم التفاعلات بين المكونات المختلفة لشبكة البروتيوستازي في الجسم الحي هو تحد كبير. في حين أن شاشات التفاعل البروتين البروتين تسهم بمعلومات هامة عن التفاعلات المادية والمجمعاتالمرافقين 14،15، فهم التنظيم وآليات تعويضية داخل شبكات المرافقين الأنسجة الخاصة في الجسم الحي غير موجود.

وغالبا ما تستخدم التفاعلات الجينية كأداة قوية لدراسة العلاقة بين أزواج من الجينات التي تشارك في المسارات البيولوجية المشتركة أو التعويضية16،17،18. ويمكن قياس هذه العلاقات من خلال الجمع بين أزواج من الطفرات وتحديد تأثير طفرة في جين واحد على شدة phenotypic الناجمة عن طفرة في الجين الثاني16. في حين أن معظم هذه المجموعات لا تظهر أي تأثير من حيث النمط الظاهري، يمكن لبعض التفاعلات الجينية إما أن تفاقم أو تخفف من شدة النمط الظاهري المقاس. ويلاحظ الطفرات المشددة عندما يكون النمط الظاهري للحذف المزدوج متحولة أكثر حدة من النمط الظاهري المتوقع ينظر عند الجمع بين المسوخ حذف واحد، مما يعني أن الجينات اثنين تعمل في مسارات متوازية، مما يؤثر معا على وظيفة معينة. في المقابل ، لوحظ تخفيف الطفرات عندما يكون النمط الظاهري للحذف المزدوج متحولة أقل حدة من النمط الظاهري ينظر مع المسوخ حذف واحد ، مما يعني أن الجينين تعمل معا كمعقدة أو المشاركة في نفس المسار16،18. وبناء على ذلك، استخدمت أنماط ظاهرة متنوعة يمكن قياسها كميا، بما في ذلك الأنماط الظاهرية الواسعة، مثل الفتك ومعدلات النمو وحجم الحضنة، فضلا عن أنماط ظاهرة محددة، مثل المراسلين النسخيين، لتحديد التفاعلات الجينية. على سبيل المثال، اعتمد Jonikas وآخرون على مراسل الإجهاد ER لدراسة التفاعلات من Cerevisiae Cerevisiae ER ER تكشفت شبكة الاستجابة البروتينية proteostasis باستخدام تحليلات حذف الجينات pairwise19.

شاشات التفاعل الجيني تنطوي على عبور منهجي الطفرات حذف pairwise لتوليد مجموعة شاملة من المسوخ مزدوجة20. ومع ذلك ، في النماذج الحيوانية ، وتحديدا في C. elegans، هذا النهج على نطاق واسع غير ممكن. بدلا من ذلك، يمكن اختبار السلالات المتحولة لأنماط تفاعلها الجيني عن طريق خفض تنظيم التعبير الجيني باستخدام تدخل الحمض النووي الريبي (RNAAi)21. C. elegans هو نظام قوي للشاشات على أساس RNAi22،23. في C. elegans، يتم تحقيق تسليم الحمض النووي الريبي المزدوج (dsRNA) عن طريق التغذية البكتيرية ، مما يؤدي إلى انتشار جزيئات dsRNA إلى العديد من الأنسجة. وبهذه الطريقة ، فإن جزيئات dsRNA المقدمة تؤثر على الحيوان عن طريق إجراء سريع وبسيط21. ولذلك، يمكن لشاشة التفاعل الجيني باستخدام RNAi أن تكشف عن تأثير خفض تنظيم مجموعة من الجينات أو معظم جينات ترميز C. elegans باستخدام مكتبات RNAi24. في مثل هذه الشاشة ، يضرب التي تؤثر على سلوك متحولة من الفائدة ولكن ليس سلالة نوع البرية هي المعدلات المحتملة للنمط الظاهري يجري رصدها25. هنا، ونحن نطبق مزيجا من الطفرات وفحص RNAi لرسم خريطة منهجية التفاعلات المرافق الأنسجة محددة في C. elegans.

Protocol

1. إعداد لوحات وسائل الإعلام نمو النيماتودا لRNAi

  1. إلى زجاجة 1 لتر، أضف 3 غرام من NaCl، 2.5 غرام من Bacto-Peptone، 17 غرام من أجار والماء المقطر تصل إلى 1 لتر وautclave.
  2. زجاجة باردة إلى 55 درجة مئوية.
  3. إضافة 25 مل من 1 M KH2PO4, pH 6.0, 1 مل من 1 M CaCl2, 1 مل من 1 M MgSO4, و 1 مل من محلول الكوليسترول (الجدول 1) لجعل وسائل نمو النيماتودا (NGM).
  4. إضافة 1 مل من أمبيسلين (100 ملغم/مل) و 0.5 مل من 1 M IPTG(الجدول 1)لجعل حل NGM-RNAi.
    ملاحظة: تحتوي بكتيريا الإشريكية القولونية HT115(DE3) شائعة الاستخدام على بوليمرات الحمض النووي T7 غير القابلة للانزداع المستخدمة للتعبير عن البلازميدات المشفرة من DsRNA. هذه البلازميدات أيضا ترميز لمقاومة أمبيسلين.
  5. مزيج الحل الدافئ عن طريق تدوير الزجاجة.
  6. في غطاء محرك السيارة أو باستخدام إجراءات معقمة، صب محلول NGM في لوحات أو باستخدام مضخة معج، والاستغناء عن الحل في لوحات. استخدم لوحات 6-well أو 12-well أو 40 مم أو 60 مم لهذه الشاشة. يجب أن تملأ أغار حوالي 2/3 من عمق اللوحة.
  7. دع الأطباق تجف بين عشية وضحاها على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة ، مع الحفاظ على تغطية الأطباق. يمكن تخزين لوحات NGM لRNAi عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر.

2. زراعة البكتيريا RNAi وبذر لوحات

  1. في غطاء محرك السيارة أو باستخدام إجراءات معقمة، إضافة 1 مل من أمبيسلين (100 ملغم / مل) و 2.5 مل من التتراسيكلين (5 ملغم / مل) (الجدول 1) إلى محلول ومزيج ما قبل الاوتوسلاف 1 لتر من LB.
    ملاحظة: HT115 (DE3) شائعة الاستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية مقاومة للتتراسيكلين.
  2. في غطاء محرك السيارة أو باستخدام إجراءات معقمة، أضف 600 ميكرولتر من محلول LB لكل بئر في لوحات معقمة بعمق 2 مل 96 بئرا. فمن الأفضل لاستخدام pipet متعدد القنوات للاستغناء عن وسائل الإعلام.
  3. باستخدام إجراءات معقمة، تلقيح الآبار مع HT115 (DE3) E. البكتيريا القولونية تحولت مع البلازميد dsRNA ترميز تستهدف جين من الفائدة أو البلازميد فارغة، كعنصر تحكم. تغطية لوحات واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. المكتبات التي تتكون من استنساخ البكتيرية التي تعبر عن dsRNA، المقابلة ل~ 94٪ من الجينات المتوقعة C. elegans شيدت سابقا22،23 ومتاحة تجاريا. تم بناء مكتبة المرافق المستخدمة هنا من قبل مختبر الدكتور ريتشارد موريموتو26.
  4. باستخدام إجراءات معقمة، البذور 75، 150 أو 250 ميكرولتر من البكتيريا على 12 جيدا، 40 ملم و 6-جيدا أو 60 ملم NGM RNAi لوحات، على التوالي. وضع علامة واضحة على اسم الجين المستهدف على لوحة. يجب أن تغطي البكتيريا 30-50٪ من سطح أجار ويجب ألا تلمس حواف اللوحة.
  5. السماح لوحات لتجف لمدة يومين على الأقل على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة، والحفاظ على لوحات مغطاة.
    ملاحظة: يمكن احتضان الأطباق عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تأكد من جفاف الآبار الداخلية قبل استخدام أو تخزين الصفائح. لجميع الأغراض طويلة الأجل (أي التجفيف أو التخزين) إبقاء لوحات في الظلام. يمكن تخزين الأطباق المجففة والمصنفة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر.

3. مزامنة غير مرهقة للأجنة

  1. استخدم انتقاء دودة لنقل حوالي 100 بيضة من لوحة دودة غير متزامنة إلى لوحة NGM مصنفة حديثا.
  2. زراعة الحيوانات لمدة 5 أيام عند 15 درجة مئوية، 3.5 أيام في 20 درجة مئوية أو 2.5 يوم عند 25 درجة مئوية. يجب أن تصل الحيوانات إلى اليوم الأول من وضع البيض.
    ملاحظة: تزرع الديدان عادة عند 20 درجة مئوية. ومع ذلك، قد تتطلب سلالات متحولة مرافق مختلفة درجات حرارة زراعة محددة. على سبيل المثال، تزرع العديد من السلالات الحساسة لدرجة الحرارة عند 15 درجة مئوية ولكنها تتحول إلى 25 درجة مئوية لكشف النمط الظاهري لها.
  3. إضافة 1 مل من المخزن المؤقت M9 (الجدول 1) ببطء وبعيدا عن العشب البكتيري. تدوير لوحة بحيث العازلة يغطي تماما لوحة. ثم إمالة إلى جانب واحد وإزالة السائل من لوحة وغسل الحيوانات قبالة لوحة.
    ملاحظة: عند استخدام الحيوانات الحساسة لدرجة الحرارة أو المسوخ المرافقة، فمن الأفضل للحفاظ على المخازن المؤقتة المستخدمة في البروتوكول في درجة حرارة زراعة الحيوانات.
  4. كرر الخطوة 3.3 ثلاث مرات أو حتى يتم غسل جميع الحيوانات من الطبق.
  5. باستخدام طرف بلاستيكي قياسي، اقطع مربعا من أجار من الطبق المغسول حيث يتركز البيض وضع قطعة أغار على طبق NGM المصنف حديثا.
    ملاحظة: يلزم حوالي 200 بيضة لإنتاج ما يكفي من الحيوانات التي تضع البيض؛ الكثير من الحيوانات تستهلك البكتيريا بسرعة كبيرة جدا. انخفاض مستويات الغذاء يمكن أن تؤثر على البروتيوستاسي27.
  6. زراعة الحيوانات لمدة 5 أيام في 15 درجة مئوية، 3.5 أيام في 20 درجة مئوية أو 2.5 أيام في 25 درجة مئوية. عند هذه النقطة، ينبغي أن تكون مغطاة لوحات مع البيض متزامنة.
    ملاحظة: يمكن نقل الحيوانات إلى لوحة جديدة لمدة قصيرة لمزامنة أكثر صرامة. ومع ذلك، من المهم استخدام البالغين فقط في المراحل المبكرة من وضع البيض حيث يمكن للحيوانات الاحتفاظ بالبويضات في رحمها مما يؤثر على المزامنة.
  7. إضافة 1 مل من العازلة M9 ببطء وبعيدا عن العشب البكتيري.
  8. تدوير لوحة بحيث العازلة يغطي تماما لوحة. ثم إمالة إلى جانب واحد وإزالة السائل من لوحة وغسل الحيوانات قبالة لوحة.
  9. كرر الخطوة 3.7 ثلاث مرات أو حتى يتم غسل جميع الحيوانات من الطبق.
  10. إضافة 1 مل من المخزن المؤقت M9 واستخدام مكشطة الخلية للافراج عن البيض من لوحة.
  11. جمع المخزن المؤقت M9 التي تحتوي على البيض من لوحات.
  12. الطرد المركزي العازلة M9 التي تحتوي على البيض في 3000 × غرام لمدة 2 دقيقة.
  13. إزالة supernatant وإضافة المخزن المؤقت M9 للوصول إلى وحدة تخزين 1 مل.
  14. إعادة إنفاق البيض لتعطيل أي قطع من البيض والبكتيريا.
  15. كرر إجراء الغسيل الموضح في الخطوات 3.11-3.13 خمس مرات. يجب أن تظهر بيليه البيض الأبيض. إذا كان لا يزال أصفر / بني، كرر الغسيل حتى يتم تحقيق بيليه أبيض.
    ملاحظة: البكتيريا التي تبقى على البيض يمكن أن تلوث البكتيريا المعبرة عن الحمض النووي الريبي.
  16. إزالة معظم supernatant، وترك حوالي 200 ميكرولتر. يمكن استخدام البيض المتزامن لشاشات RNAi.

4. المقايسات الظاهرية الشائعة

  1. زراعة الحيوانات أثناء التجارب
    1. ضع قطرة من ~ 30 بيضة بالقرب من العشب البكتيري في كل لوحة بذر RNAi. للرجوع إليها، ضع أيضا ~ 30 بيضة على لوحات بذر مع البكتيريا الفارغة التي تحتوي على ناقلات (L4440).
    2. زراعة الحيوانات المتزامنة مع العمر على لوحات NGM RNAi البذور. وستتوقف مدة التجربة على المرحلة التي سيتم فيها رصد الحيوانات ودرجة حرارة زراعتها. ضبط درجة حرارة الزراعة عند استخدام الحيوانات المتحولة الحساسة لدرجة الحرارة. ضبط مدة الزراعة عند استخدام الحيوانات المتحولة تأخر تطوريا.
      ملاحظة: في حين أن التوقيت يمكن أن يختلف، بمجرد أن تصل الحيوانات إلى مرحلة البلوغ، فإن وضع البيض (والاستهلاك السريع للطعام الناتج عن ذلك)، وكذلك انهيار البروتيوستسيس المعتمد على العمر28،يمكن أن يؤثر على النتائج. ومن ثم يوصى بتسجيل الحيوانات قبل بداية وضع البيض (اليوم الأول من البلوغ). الحيوانات البرية نوع تصل إلى هذه المرحلة بعد 4.5 أيام في 15 درجة مئوية، 3 أيام في 20 درجة مئوية أو 2 أيام في 25 درجة مئوية.
    3. وسيتوقف عدد التكرارات المستخدمة على حجم مجموعة الجينات التي تم فحصها. بالنسبة لمكتبة المرافق (97 جينا)، كرر التجارب أربع مرات على الأقل. يعتمد حجم السكان على المقايسة المستخدمة. في المقايسات السلوكية التي نوقشت هنا، يسجل 15 >الحيوانات لكل حالة تجريبية في كل تكرار. كما تعتمد البيانات والتحليلات الإحصائية بشدة على نوع المقايسة المستخدمة. يمكن تقديم البيانات في المقايسات التي تمت مناقشتها هنا كوسيلة ± SEM.
    4. قارن بين الحيوانات المعالجة بالنواقل الفارغة والحيوانات المعالجة بالنواقل كتجمعات سكانية مستقلة. يمكن حساب قيم P باستخدام ANOVA أحادية الاتجاه أو ثنائية الاتجاه، اعتمادا على التغييرات التي تم فحصها، وهي تفاقم أو التخفيف بمفردها أو كليهما. عند فحص علاج RNAi واحد مقابل التحكم ، يمكن حساب قيم P باستخدام اختبار مجموع رتبة Mann-Whitney في اتجاه واحد أو اتجاهين. بخلاف الأهمية الإحصائية، فكر في عتبة للزيارات استنادا إلى درجة التأثير على النمط الظاهري.
  2. توقيف/تأخير في التطوير
    1. زراعة الحيوانات المتزامنة مع العمر كما هو الحال في الخطوة 4.1 حتى الحيوانات التي تزرع على البكتيريا المكافحة الفارغة التي تحتوي على ناقلات تصل إلى مرحلة البلوغ ولكن قبل أن يبدأ وضع البيض.
    2. مراقبة الحيوانات باستخدام المنظار المجستير وإحصاء عدد اليرقات والبالغين لتسجيل نسبة الحيوانات المتأخرة تنمويا. للرجوع إليها، قارن بالحيوانات المتحولة التي تزرع على بكتيريا التحكم الفارغة المحتوية على ناقلات. hsp-1 أو hsp-90 نتائج العلاج RNAi في اعتقال النمو من الحيوانات البرية نوع ويمكن استخدامها كسيطرة إيجابية.
    3. لتسجيل نسبة الحيوانات المتأخرة تنمويا بمرور الوقت، كرر الخطوة 4.2.2.
      ملاحظة: إذا كان هناك بالغين يضعون البيض على اللوحة، قم بنقل الحيوانات المتأخرة تنمويا إلى لوحة NGM-RNAi جديدة تحمل نفس الجين المستهدف لتجنب الارتباك مع ذرية.
  3. عيوب العقم أو وضع البيض
    1. زراعة الحيوانات المتزامنة مع العمر كما هو الحال في الخطوة 4.1 حتى تبدأ الحيوانات التي تزرع على البكتيريا الفارغة لمكافحة ناقلات الأمراض في وضع البيض.
    2. مراقبة الحيوانات باستخدام المنظار المجسم وتسجيل نسبة الحيوانات التي لا يوجد بيض مرئي في رحمها. للرجوع إليها، قارن بالحيوانات المتحولة التي تزرع على البكتيريا الفارغة لمكافحة ناقلات الأمراض.
    3. بالتناوب، رصد الحيوانات باستخدام مجسم وتسجيل النسبة المئوية للحيوانات مع رحم كامل من البيض، ويعرف باسم EGg زرع معيبة (Egl-d) النمط الظاهري29.
  4. الفتك الجنيني
    1. زراعة الحيوانات المتزامنة مع العمر كما هو الحال في الخطوة 4.1 حتى تبدأ الحيوانات في وضع البيض.
    2. نقل ~ 100 بيضة إلى لوحة فارغة. نشر البيض في صفوف لتبسيط العد.
    3. يسجل النسبة المئوية من البيض غير المهتح على الطبق بعد 24-48 ساعة. كمرجع، قارن بيض الحيوانات المعالجة ببكتيريا مكافحة ناقلات فارغة.
  5. فحص الشلل
    1. للبالغين اليوم 1، زراعة الحيوانات المتزامنة مع العمر كما هو الحال في الخطوة 4.1 حتى الحيوانات التي تزرع على البكتيريا الفارغة لمكافحة ناقلات تصل إلى مرحلة البلوغ ولكن قبل بدء وضع البيض.
    2. رسم خط على الجزء الخلفي من لوحة أجار NGM العادية باستخدام علامة غرامة.
    3. ضع 5-10 على الخط المميز.
    4. تعيين جهاز توقيت وانتظر لمدة 10 دقيقة.
    5. تسجيل النسبة المئوية للحيوانات المتبقية على الخط والديدان مشلولة. للرجوع إليها، قارن بالحيوانات المتحولة التي تزرع على البكتيريا الفارغة لمكافحة ناقلات الأمراض. تظهر الحيوانات البرية المعالجة ب unc-45 RNAi النمط الظاهري للشلل الشديد ويمكن استخدامها كتحكم إيجابي.
      ملاحظة: يسلط هذا المقايسة الضوء على الحيوانات التي تظهر شللا متوسطا إلى شديدا. هذه الحيوانات عادة ما تكمن مباشرة على لوحة، بدلا من تقديم الشكل المنحني المشترك. وعلاوة على ذلك ، فإن التصحيح تطهيرها من البكتيريا مرئية حول رؤوس الديدان المشلولة.
  6. فحص الضرب
    1. زراعة الحيوانات المتزامنة مع العمر كما هو الحال في الخطوة 4.1 حتى الحيوانات التي تزرع على البكتيريا الفارغة لمكافحة ناقلات تصل إلى مرحلة البلوغ ولكن قبل أن يبدأ وضع البيض.
    2. Pipet 100 ميكرولتر من العازلة M9 في درجة حرارة زراعة الحيوانات في لوحة 96 جيدا.
    3. ضع ~15 دودة، واحدة لكل بئر، في الآبار المحتوية على المخزن المؤقت M9.
    4. دع الحيوانات تتكيف لمدة 5 دقائق.
    5. فحص كل تحت مجسم، بدء جهاز توقيت العد التنازلي 15 ثانية، وعدد الانحناءات الجسم كل ينفذ في تلك المهلة. القيم التي تم عدها يمكن تطبيعها إلى الانحناءات الجسم في الدقيقة الواحدة. للرجوع إليها، قارن بالحيوانات المتحولة التي تزرع على البكتيريا الفارغة لمكافحة ناقلات الأمراض.
      ملاحظة: هذا المقايسة حركية حساسة جدا ويمكن الكشف عن اختلافات خفيفة جدا بين العلاجات. ومع ذلك، يمكن أن تختلف الحركة في السائل والحركة على أجار.

5. التحقق من صحة ضربة قاضية البروتين

  1. ضع 250-300 بيضة متزامنة على لوحة NGM-RNAi مقاس 60 مم بذرت مع البكتيريا ذات الصلة المعبرة عن الحمض النووي الريبي أو الفارغة التي تحتوي على ناقلات (L4440).
    ملاحظة: يمكن أن تؤدي الضربة القاضية ل RNAi إلى تراكم أجنة منحرفة، أو نقص الأجنة أو في الاعتقال التنموي الذي يمكن أن يؤثر على التعبير الجيني. وينبغي النظر في ذلك عند تحديد عمر الحيوانات التي يتعين فحصها.
  2. للبالغين اليوم 1، زراعة الحيوانات لمدة 4.5 يوما في 15 درجة مئوية، 3 أيام في 20 درجة مئوية أو 2 أيام في 25 درجة مئوية.
  3. اختيار ونقل ما مجموعه 200 من الحيوانات البالغة الشباب في سقف أنبوب 1.5 مل ملء مع 200 ميكروغرام من برنامج تلفزيوني تي.
    ملاحظة: عند استخدام الحيوانات الحساسة لدرجة الحرارة أو المسوخ المرافقة، فمن الأفضل للحفاظ على المخازن المؤقتة المستخدمة في البروتوكول في درجة حرارة زراعة الحيوانات.
  4. أغلق الغطاء بعناية واغلق جهاز الطرد المركزي عند 1000 × غرام لمدة دقيقة واحدة.
  5. إضافة 800 ميكرولتر من PBS-T (الجدول 1) والطرد المركزي في 1000 x ز لمدة دقيقة واحدة.
  6. إزالة بعناية أعلى 900 ميكرولتر.
  7. كرر الخطوات 5.4-5.6 ثلاث مرات.
  8. إزالة 900 ميكرولتر، وترك 100 ميكرولتر من محلول يحتوي على 200 الديدان.
  9. إضافة 25 ميكرولتر من 5x عينة المخزن المؤقت (الجدول 1).
  10. سخني العينات لمدة 10 دقائق عند 92 درجة مئوية أثناء الاهتزاز عند 1000 دورة في الدقيقة. ويمكن بعد ذلك تجميد العينات والاحتفاظ بها عند -20 درجة مئوية.
  11. تحميل 20 ميكرولتر من كل عينة وتشغيلها على هلام SDS-PAGE.
  12. إجراء تحليل لطخة الغربية باستخدام الأجسام المضادة المناسبة لتحديد الاستقرار النسبي للبروتين.
  13. تحديد كثافة النطاقات باستخدام برامج الكثافة، مثل وحدة جل ImageJ المتوفرة بحرية. تطبيع كافة القيم إلى تلك التي تم قياسها في نموذج (عينات) عنصر التحكم.
    ملاحظة: الهدف من الضربة القاضية RNAi في شاشاتنا هو خفض مستويات البروتين من مرافق معين / مرافق مشارك. وبالتالي ، فإن أفضل طريقة لتقييم كفاءة ضربة قاضية RNAi هي عن طريق تحليل البقع الغربية. وهذا يتطلب أجسام مضادة محددة. بالتناوب، يمكن استخدام qPCR لتحديد مستويات الحمض النووي الريبي.

النتائج

استخدام الطفرات الحساسة لدرجة الحرارة في UNC-45 للكشف عن تفاقم أو تخفيف التفاعلات في ظل ظروف متساهلة أو تقييدية، على التوالي
تجميع العضلات وصيانتها توفر نظاما فعالا لدراسة التفاعلات المرافق الأنسجة محددة. الوحدة الوظيفية للعضلات المتقلصة، الساركومير، تقدم ترتيبا يشبه البلورية ...

Discussion

لا تزال هناك صورة متكاملة لشبكة البروتيوستازي تعكس كيفية تنظيمها ووظائفها في خلايا وأنسجة ميتازوان مختلفة. ولمعالجة هذا القصور، يلزم الحصول على معلومات محددة عن تفاعلات مختلف مكونات هذه الشبكة، مثل المرافقين الجزيئيين، في أنسجة محددة أثناء التطور والشيخوخة. هنا، أظهرنا كيف أن استخدام ا...

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

نشكر مركز علم الوراثة في Caenorhabditis ، الممول من المركز الوطني لموارد البحوث في المعاهد القومية للصحة (NCRR) ، على بعض سلالات النيماتودا. تم الحصول على الأجسام المضادة أحادية النسيلة التي طورها H.F. Epstein من بنك الدراسات التنموية الهجين الذي تم تطويره تحت رعاية NICHD وصيانته من قبل قسم البيولوجيا في جامعة أيوا. وقد تم دعم هذا البحث بمنحة من مؤسسة العلوم الإسرائيلية (المنحة رقم 278/18) ومنحة من وزارة العلوم والتكنولوجيا الإسرائيلية ووزارة الخارجية والتعاون الدولي، المديرية العامة لتعزيز الدولة، الجمهورية الإيطالية (المنحة رقم 3-14337). نشكر أعضاء مختبر بن زفي على مساعدتهم في إعداد هذه المخطوطة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
12-well-platesSPLBA3D16B
40 mm platesGreiner Bio-one627160
60 mm platesGreiner Bio-one628102
6-well platesThermo Scientific140675
96 well 2 mL 128.0/85mmGreiner Bio-one780278
AgarFormediumAGA03
AmpicillinFormedium69-52-3
bromophenol blueSigmaBO126-25G
CaCl2Merck1.02382.0500
CameraQimagingq30548
CholesterolAmresco0433-250G
ConfocalLeicaDM5500
Filter (0.22 µm)SigmaSCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscopeLeicaMZ165FC
GlycerolFrutarom2355519000024
IPTGFormedium367-93-1
KClMerck104936
KH2PO4Merck1.04873.1000
KOHBio-Lab001649029100
MgSO4Fisher22189-08-8Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibodyHybridoma Bank5-6
Na2HPO4·7H2OSigmas-0751
NaClBio-Lab001903029100
PeptoneMerck61930705001730
Plate pouring pumpIntegradoes it p920
RNAi Chaperone libraryNANA
SDSVWR Life Science0837-500
ß-mercaptoethanolBio world41300000-1
stereomicroscopeLeicaMZ6
TetracyclineDuchefa Biochemie64-75-5
TrisBio-Lab002009239100
Tween-20FisherBP337-500

References

  1. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
  2. Dubnikov, T., Ben-Gedalya, T., Cohen, E. Protein quality control in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (3), (2017).
  3. Bar-Lavan, Y., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Chaperone families and interactions in metazoa. Essays in Biochemistry. 60 (2), 237-253 (2016).
  4. Schopf, F. H., Biebl, M. M., Buchner, J. The HSP90 chaperone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 345-360 (2017).
  5. Carra, S., et al. The growing world of small heat shock proteins: from structure to functions. Cell Stress Chaperones. 22 (4), 601-611 (2017).
  6. Rosenzweig, R., Nillegoda, N. B., Mayer, M. P., Bukau, B. The Hsp70 chaperone network. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
  7. Gestaut, D., Limatola, A., Joachimiak, L., Frydman, J. The ATP-powered gymnastics of TRiC/CCT: an asymmetric protein folding machine with a symmetric origin story. Current Opinion in Structural Biology. 55, 50-58 (2019).
  8. Bett, J. S. Proteostasis regulation by the ubiquitin system. Essays in Biochemistry. 60 (2), 143-151 (2016).
  9. Jackson, M. P., Hewitt, E. W. Cellular proteostasis: degradation of misfolded proteins by lysosomes. Essays in Biochemistry. 60 (2), 173-180 (2016).
  10. Kettern, N., Dreiseidler, M., Tawo, R., Hohfeld, J. Chaperone-assisted degradation: multiple paths to destruction. Biological Chemistry. 391 (5), 481-489 (2010).
  11. Cuervo, A. M., Wong, E. Chaperone-mediated autophagy: roles in disease and aging. Cell Research. 24 (1), 92-104 (2014).
  12. Kevei, E., Pokrzywa, W., Hoppe, T. Repair or destruction-an intimate liaison between ubiquitin ligases and molecular chaperones in proteostasis. FEBS Letters. 591 (17), 2616-2635 (2017).
  13. O'Brien, D., van Oosten-Hawle, P. Regulation of cell-non-autonomous proteostasis in metazoans. Essays in Biochemistry. 60 (2), 133-142 (2016).
  14. Taipale, M., et al. Quantitative analysis of HSP90-client interactions reveals principles of substrate recognition. Cell. 150 (5), 987-1001 (2012).
  15. Taipale, M., et al. A quantitative chaperone interaction network reveals the architecture of cellular protein homeostasis pathways. Cell. 158 (2), 434-448 (2014).
  16. Baryshnikova, A., Costanzo, M., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Genetic interaction networks: toward an understanding of heritability. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 14, 111-133 (2013).
  17. Costanzo, M., et al. Global Genetic Networks and the Genotype-to-Phenotype Relationship. Cell. 177 (1), 85-100 (2019).
  18. Domingo, J., Baeza-Centurion, P., Lehner, B. The Causes and Consequences of Genetic Interactions (Epistasis). Annual Review of Genomics and Human Genetics. 20, 433-460 (2019).
  19. Jonikas, M. C., et al. Comprehensive characterization of genes required for protein folding in the endoplasmic reticulum. Science. 323 (5922), 1693-1697 (2009).
  20. Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123 (3), 507-519 (2005).
  21. Billi, A. C., Fischer, S. E., Kim, J. K. Endogenous RNAi pathways in C. elegans. WormBook. , 1-49 (2014).
  22. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  23. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  24. Lehner, B., Crombie, C., Tischler, J., Fortunato, A., Fraser, A. G. Systematic mapping of genetic interactions in Caenorhabditis elegans identifies common modifiers of diverse signaling pathways. Nature Genetics. 38 (8), 896-903 (2006).
  25. Frumkin, A., et al. Challenging muscle homeostasis uncovers novel chaperone interactions in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 21 (2014).
  26. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  27. Shpigel, N., Shemesh, N., Kishner, M., Ben-Zvi, A. Dietary restriction and gonadal signaling differentially regulate post-development quality control functions in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 18 (2), 12891 (2019).
  28. Shai, N., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Remodeling of proteostasis upon transition to adulthood is linked to reproduction onset. Current Genomics. 15 (2), 122-129 (2014).
  29. Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 104 (4), 619-647 (1983).
  30. Pokrzywa, W., Hoppe, T. Chaperoning myosin assembly in muscle formation and aging. Worm. 2 (3), 25644 (2013).
  31. Barral, J. M., Bauer, C. C., Ortiz, I., Epstein, H. F. Unc-45 mutations in Caenorhabditis elegans implicate a CRO1/She4p-like domain in myosin assembly. Journal of Cell Biology. 143 (5), 1215-1225 (1998).
  32. Venolia, L., Ao, W., Kim, S., Kim, C., Pilgrim, D. unc-45 gene of Caenorhabditis elegans encodes a muscle-specific tetratricopeptide repeat-containing protein. Cell Motility and the Cytoskeleton. 42 (3), 163-177 (1999).
  33. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  34. Etard, C., et al. The UCS factor Steif/Unc-45b interacts with the heat shock protein Hsp90a during myofibrillogenesis. Developmental Biology. 308 (1), 133-143 (2007).
  35. Wohlgemuth, S. L., Crawford, B. D., Pilgrim, D. B. The myosin co-chaperone UNC-45 is required for skeletal and cardiac muscle function in zebrafish. Developmental Biology. 303 (2), 483-492 (2007).
  36. Barral, J. M., Hutagalung, A. H., Brinker, A., Hartl, F. U., Epstein, H. F. Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science. 295 (5555), 669-671 (2002).
  37. Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
  38. Gaiser, A. M., Kaiser, C. J., Haslbeck, V., Richter, K. Downregulation of the Hsp90 system causes defects in muscle cells of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6 (9), 25485 (2011).
  39. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
  40. Bar-Lavan, Y., et al. A Differentiation Transcription Factor Establishes Muscle-Specific Proteostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 12 (12), 1006531 (2016).
  41. Qadota, H., et al. Establishment of a tissue-specific RNAi system in C. elegans. Gene. 400 (1-2), 166-173 (2007).
  42. Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS Genet. 9 (11), 1003921 (2013).
  43. Fisher, A. L. Of worms and women: sarcopenia and its role in disability and mortality. Journal of the American Geriatrics Society. 52 (7), 1185-1190 (2004).
  44. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  45. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  46. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  47. Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
  48. Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489 (7415), 263-268 (2012).
  49. Liu, G., Rogers, J., Murphy, C. T., Rongo, C. EGF signalling activates the ubiquitin proteasome system to modulate C. elegans lifespan. EMBO Journal. 30 (15), 2990-3003 (2011).
  50. Asikainen, S., Vartiainen, S., Lakso, M., Nass, R., Wong, G. Selective sensitivity of Caenorhabditis elegans neurons to RNA interference. Neuroreport. 16 (18), 1995-1999 (2005).
  51. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  52. Eremenko, E., Ben-Zvi, A., Morozova-Roche, L. A., Raveh, D. Aggregation of human S100A8 and S100A9 amyloidogenic proteins perturbs proteostasis in a yeast model. PLoS One. 8 (3), 58218 (2013).
  53. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  54. Yu, A., et al. Tau protein aggregates inhibit the protein-folding and vesicular trafficking arms of the cellular proteostasis network. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  55. Yu, A., et al. Protein aggregation can inhibit clathrin-mediated endocytosis by chaperone competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1481-1490 (2014).
  56. Parker-Thornburg, J., Bonner, J. J. Mutations that induce the heat shock response of Drosophila. Cell. 51 (5), 763-772 (1987).
  57. Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nature Reviews Genetics. 9 (7), 554-566 (2008).
  58. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
  59. Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
  60. Rohl, A., Rohrberg, J., Buchner, J. The chaperone Hsp90: changing partners for demanding clients. Trends in Biochemical Sciences. 38 (5), 253-262 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160 Caenorhabditis elegans RNAi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved