JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כדי לחקור אינטראקציות מלווה מלווה מלווה-מצע, אנו מבצעים מסכי אינטראקציה סינתטית ב elegans Caenorhabditis באמצעות הפרעות RNA בשילוב עם מוטציות קלות או ביטוי יתר של מלווים ולנטר תפקוד לקוי של חלבון ספציפי לרקמות ברמה האורגנית.

Abstract

קיפול והרכבה נכונים של חלבונים ומתחמי חלבון חיוניים לתפקוד התא. תאים משתמשים במסלולי בקרת איכות המתקנים, מבודדים או מבטלים חלבונים פגומים כדי לשמור על פרוטאום בריא, ובכך מבטיחים פרוטאוסטזיס תאי ומונעים נזק נוסף לחלבון. בגלל פונקציות יתירות בתוך רשת proteostasis, הקרנה עבור פנוטיפים לגילוי באמצעות נוקאאוט או מוטציות בגנים קידוד מלווה באורגניזם הרב תאי Caenorhabditis elegans תוצאות גילוי של פנוטיפים קלים או ללא ברוב המקרים. פיתחנו אסטרטגיית סינון ממוקדת לזיהוי מלווים הנדרשים לפונקציה מסוימת ובכך לגשר על הפער בין פנוטיפ לתפקוד. באופן ספציפי, אנו עוקבים אחר אינטראקציות מלווה חדשניות באמצעות מסכי אינטראקציה סינתטית RNAi, הבעת ביטוי מלווה, מלווה אחד בכל פעם, בבעלי חיים הנושאים מוטציה בגן קידוד מלווה או הבעת יתר של מלווה של עניין. על ידי שיבוש שני מלווים כי בנפרד להציג פנוטיפ ברוטו, אנו יכולים לזהות מלווים להחמיר או לחשוף פנוטיפ מסוים כאשר שניהם מוטרדים. אנו מדגימים כי גישה זו יכולה לזהות קבוצות ספציפיות של מלווים הפועלים יחד כדי לווסת את הקיפול של קומפלקס חלבון או חלבון הקשורים פנוטיפ נתון.

Introduction

תאים להתמודד עם נזק חלבון על ידי שימוש במכונות בקרת איכות לתקן, לבודד או להסיר חלבונים פגומים1,2. קיפול והרכבה של מתחמי חלבון נתמכים על ידי מלווים מולקולריים, קבוצה מגוונת של חלבונים שמורים מאוד שיכולים לתקן או לבודד חלבונים פגומים3,4,5,6,7. הסרת חלבונים פגומים בתיווך מערכת ubiquitin-proteasome (UPS)8 או על ידי מכונות autophagy9 בשיתוף עםמלווים 10,11,12. הומיוסטזיס חלבון (פרוטאוסטזיס) הוא, אם כן, מתוחזק על ידי רשתות בקרת איכות המורכבות ממכונות קיפול והשפלה3,13. עם זאת, הבנת האינטראקציות בין המרכיבים השונים של רשת הפרוטאוסטזיס ב- vivo היא אתגר גדול. בעוד שמסכי אינטראקציה בין חלבון חלבון תורמים מידע חשוב על אינטראקציות פיזיות ומתחמי ליווי14,15, הבנת הארגון ומנגנוני פיצוי בתוך רשתות ליווי ספציפיות לרקמות ב- vivo חסרה.

אינטראקציות גנטיות משמשות לעתים קרובות ככלי רב עוצמה לבחינת קשר בין זוגות גנים המעורבים במסלולים ביולוגיים נפוצים או מפצים16,17,18. יחסים כאלה יכולים להימדד על ידי שילוב זוגות של מוטציות וכימות ההשפעה של מוטציה בגן אחד על החומרה הפנוטיפית הנגרמת על ידי מוטציה בגן השני16. בעוד שרוב השילובים כאלה אינם מראים כל השפעה במונחים של פנוטיפ, כמה אינטראקציות גנטיות יכול גם להחמיר או להקל על חומרת הפנוטיפ הנמדד. מוטציות מחמירות נצפות כאשר הפנוטיפ של מוטציית המחיקה הכפולה חמור יותר מהפנוטיפ הצפוי שנראה בשילוב מוטציות המחיקה הבודדות, מה שמרמז על כך ששני הגנים מתפקדים במסלולים מקבילים, יחד המשפיעים על תפקוד נתון. לעומת זאת, מוטציות מקלות נצפות כאשר הפנוטיפ של מוטציית המחיקה הכפולה הוא פחות חמור מהפנוטיפ שנראה עם מוטציות המחיקה הבודדות, מה שמרמז על כך ששני הגנים פועלים יחד כמורכב או משתתפים באותו מסלול16,18. בהתאם לכך, פנוטיפים מגוונים שניתן לכמת, כולל פנוטיפים רחבים, כגון קטלניות, שיעורי צמיחה וגודל הגוזל, כמו גם פנוטיפים ספציפיים, כגון כתבים תמלול, שימשו לזיהוי אינטראקציות גנטיות. לדוגמה, Jonikas ואח ' הסתמכו על כתב מתח ER לבחון אינטראקציות של Saccharomyces cerevisiae ER פתחה רשת פרוטאוסטזיס תגובת חלבון באמצעות ניתוחי מחיקת גנים זוגגנים 19.

מסכי אינטראקציה גנטית כרוכים בחצייה שיטתית של מוטציות מחיקה זוגיות כדי ליצור קבוצה מקיפה של מוטציות כפולות20. עם זאת, במודלים של בעלי חיים, ובמיוחד ב- C. elegans, גישה רחבת היקף זו אינה ריאלית. במקום זאת, זנים מוטנטיים יכולים להיבדק לדפוסי האינטראקציה הגנטית שלהם על ידי זיהוי גנים מווסת באמצעות הפרעות RNA (RNAi)21. ג. אלגנס היא מערכת רבת עוצמה למסכים המבוססת על RNAi22,23. ב C. elegans, משלוח RNA כפול גדילים (dsRNA) מושגת על ידי האכלה חיידקית, מה שמוביל להתפשטות של מולקולות dsRNA לרקמות רבות. באופן זה, מולקולות dsRNA הציג להשפיע על החיה באמצעות הליך מהיר ופשוט21. מסך אינטראקציה גנטית באמצעות RNAi יכול, אם כן, לחשוף את ההשפעה של ויסות מטה קבוצה של גנים או רוב C. elegans קידוד גנים באמצעות ספריות RNAi24. במסך כזה, להיטים המשפיעים על ההתנהגות של מוטציה של עניין אבל לא זן סוג פראי הם מכפילים פוטנציאליים של פנוטיפ להיות במעקב25. כאן, אנו מיישמים שילוב של מוטציות והקרנת RNAi כדי למפות באופן שיטתי אינטראקציות מלווה ספציפיות לרקמות ב- C. elegans.

Protocol

1. הכנת לוחות מדיה צמיחה נמטודה עבור RNAi

  1. לבקבוק 1 L, הוסיפו 3 גרם של NaCl, 2.5 גרם של Bacto-Peptone, 17 גרם אגר ומים מזוקקים עד 1 L ו autoclave.
  2. בקבוק מגניב ל 55 °C (55 °F).
  3. הוסף 25 מ"ל של 1 M KH2PO4, pH 6.0, 1 מ"ל של 1 M CaCl2, 1 מ"ל של 1 M MgSO4, ו 1 מ"ל של פתרוןכולסטרול (טבלה 1) כדי להפוך את מדיה צמיחה נמטודה (NGM).
  4. הוסף 1 מ"ל של אמפצילין (100 מ"ג / מ"ל) ו 0.5 מ"ל של 1 M IPTG(טבלה 1) כדי להפוך פתרון NGM-RNAi.
    הערה: חיידקי HT115(DE3) E. coli הנפוצים מכילים פולימראז DNA T7 שאינו ניתן לתמיכת IPTG המשמש להבעת פלסמידים קידוד dsRNA. פלסמידים אלה מקודדים גם עמידות באמפיצ'ילין.
  5. מערבבים את התמיסה החמה על ידי מערבולת הבקבוק.
  6. בשכונה או באמצעות הליכים סטריליים, יוצקים את תמיסת ה- NGM לצלחות או באמצעות משאבה פריסלטית, מחלקים את הפתרון לצלחות. השתמש 6-טוב, 12-טוב, 40 מ"מ או 60 מ"מ לוחות עבור מסך זה. אגר צריך למלא בערך 2/3 מעומק הצלחת.
  7. תן את הצלחות להתייבש לילה על הספסל בטמפרטורת החדר, שמירה על הצלחות מכוסות. לוחות NGM עבור RNAi ניתן לאחסן ב 4 °C (5 °F) עד חודש.

2. גידול חיידקי RNAi וזריעת הצלחות

  1. בשכונה או באמצעות הליכים סטריליים, להוסיף 1 מ"ל של אמפצילין (100 מ"ג / מ"ל) ו 2.5 מ"ל של טטרציקלין (5 מ"ג / מ"ל) (טבלה 1) לפתרון 1 ליטר אוטומטי מראש של פתרון LB ומערבב.
    הערה: חיידקי HT115(DE3) E. coli נפוצים עמידים לטטרציקלין.
  2. בשכונה או באמצעות הליכים סטריליים, להוסיף 600 μL של פתרון LB לכל באר 2 מ"ל עמוק 96-צלחות סטריליות. עדיף להשתמש בצנרת רב ערוצית לחלוקת המדיה.
  3. באמצעות הליכים סטריליים, לחסן בארות עם חיידקי HT115(DE3) E. coli השתנה עם פלסמיד קידוד dsRNA מיקוד גן של עניין או plasmid ריק, כמו שליטה. מכסים את הצלחות ודגר ב 37 °C (50 °F) לילה. ספריות המורכבות משיבוטים חיידקיים המבטאים dsRNA, המקביל לכ -94% מהגנים החזויים C. elegans נבנו בעבר22,23 והם זמינים מסחרית. ספריית המלווה ששימשה כאן נבנתה על ידי מעבדת ד"ר ריצ'רד מורימוטו26.
  4. באמצעות הליכים סטריליים, זרע 75, 150 או 250 μL של חיידקים על 12-well, 40 מ"מ ו 6-טוב או 60 מ"מ NGM RNAi לוחות, בהתאמה. סמן בבירור את שם גן המטרה על הלוח. חיידקים צריכים לכסות 30-50% משטח אגר ולא צריך לגעת בשולי הצלחת.
  5. אפשר צלחות להתייבש לפחות 2 ימים על הספסל בטמפרטורת החדר, שמירה על הצלחות מכוסות.
    הערה: ניתן לדגור צלחות ב 37 °C (50 °F) לילה. ודאו שהבארות הפנימיות יבשות לפני השימוש או אחסון הצלחות. לכל המטרות לטווח ארוך (כלומר, ייבוש או אחסון) שמור את הצלחות בחושך. צלחות מיובשות, זרעים ניתן לאחסן ב 4 °C (5 °F) עד חודש.

3. סנכרון לא מלחיץ של עוברים

  1. השתמש בבחירת תולעים כדי להעביר כ-100 ביצים מצלחת תולעת לא מסונכרנת ללוח גז טבעי נוזלי שזה עתה נזרע.
  2. לטפח בעלי חיים במשך 5 ימים ב 15 °C (5 °F), 3.5 ימים ב 20 °C (5 °F) או 2.5 ימים ב 25 °C (5 °F). בעלי חיים צריכים להגיע ליום הראשון של הטלת ביצים.
    הערה: תולעים מעובדות בדרך כלל ב 20 °C (50 °F). עם זאת, זנים מוטנטיים מלווים שונים עשויים לדרוש טמפרטורות טיפוח ספציפיות. לדוגמה, זנים רגישים לטמפרטורה רבים מעובדים ב 15 °C (5 °F) אבל עבר 25 °C (5 °F) כדי לחשוף פנוטיפ שלהם.
  3. הוסף 1 מ"ל של חוצץ M9(טבלה 1)לאט והרחק מהמדשאה החיידקית. סובב את הצלחת כך שהמאגר יכסה לחלוטין את הצלחת. לאחר מכן להטות אותו לצד אחד ולהסיר את הנוזל מהצלחת לשטוף את החיות מהצלחת.
    הערה: בעת שימוש בבעלי חיים רגישים לטמפרטורה או מוטציות ליווי, עדיף לשמור על המאגרים המשמשים בפרוטוקול בטמפרטורת הטיפוח של בעלי החיים.
  4. חזור על שלב 3.3 שלוש פעמים או עד שכל החיות נשטפות מהצלחת.
  5. בעזרת קצה פלסטיק סטנדרטי, חותכים ריבוע אגר מהצלחת השטופה שבה מרוכזות הביצים ומניחים את חתיכת אגר על צלחת NGM חדשה.
    הערה: ~ 200 ביצים נדרשים לייצר מספיק בעלי חיים מטילי ביצים; יותר מדי בעלי חיים צורכים את החיידקים מהר מדי. רמות מזון נמוכות יכולות להשפיע על פרוטאוסטזיס27.
  6. לטפח את בעלי החיים במשך 5 ימים ב 15 °C (5 °F), 3.5 ימים ב 20 °C (5 °F) או 2.5 ימים ב 25 °C (5 °F). בשלב זה, הצלחות צריכות להיות מכוסות בביצים מסונכרנות.
    הערה: ניתן להעביר בעלי חיים לצלחת חדשה למשך זמן קצר לסנכרון מחמיר יותר. עם זאת, חשוב להשתמש רק במבוגרים בשלבים המוקדמים של הטלת ביצים כמו בעלי חיים יכולים לשמור ביצים ברחם שלהם המשפיעים על סנכרון.
  7. הוסף 1 מ"ל של חוצץ M9 לאט הרחק הדשא החיידקי.
  8. סובב את הצלחת כך שהמאגר יכסה לחלוטין את הצלחת. לאחר מכן להטות אותו לצד אחד ולהסיר את הנוזל מהצלחת לשטוף את החיות מהצלחת.
  9. חזור על שלב 3.7 שלוש פעמים או עד שכל בעלי החיים נשטפים מהצלחת.
  10. הוסף 1 מ"ל של חוצץ M9 והשתמש מגרד תא כדי לשחרר את הביצים מהצלחת.
  11. לאסוף את מאגר M9 המכיל את הביצים מהצלחות.
  12. צנטריפוגה חוצץ M9 המכיל את הביצים ב 3,000 x גרם במשך 2 דקות.
  13. הסר את supernatant ולהוסיף מאגר M9 כדי להגיע לאמצעי אחסון של 1 מ"ל.
  14. resuspend הביצים כדי לשבש כל גושים של ביצים וחיידקים.
  15. חזור על הליך הכביסה המתואר בשלבים 3.11-3.13 חמש פעמים. גלולה ביצה צריך להיראות לבן. אם הוא עדיין צהוב/חום, חזור על הכביסה עד להשגת גלולה לבנה.
    הערה: חיידקים שנותרו על הביצים יכולים לזהם את החיידקים המביעים dsRNA.
  16. הסר את רוב supernatant, משאיר על 200 μL. ביצים מסונכרנות ניתן להשתמש עבור מסכי RNAi.

4. מבדים פנוטיפיים נפוצים

  1. טיפוח בעלי חיים במהלך ניסויים
    1. מניחים טיפה של ~ 30 ביצים קרוב למדשאה החיידקית בכל צלחת זרעים RNAi. לעיון, יש גם להניח ~30 ביצים על צלחות זרעים עם חיידקים ריקים המכילים וקטור (L4440).
    2. לטפח בעלי חיים מסונכרנים לגיל על לוחות זרעי RNAi NGM. משך הניסוי יהיה תלוי בשלב שבו יש לעקוב אחר בעלי החיים וטמפרטורת הטיפוח. התאם את טמפרטורת הטיפוח בעת שימוש בחיות מוטנטיות רגישות לטמפרטורה. התאם את משך הטיפוח בעת שימוש בבעלי חיים מוטנטיים המתעכבים התפתחותית.
      הערה: בעוד התזמון יכול להשתנות, ברגע שבעלי חיים מגיעים לבגרות, הטלת ביצים (וצריכת המזון המהירה הנובעת מכך), כמו גם קריסת פרוטאוסטזיס תלוית גיל28, עלולה להשפיע על התוצאות. לכן מומלץ להבקיע בעלי חיים לפני תחילת הטלת הביצים (יום 1 לבגרות). חיות מסוג בר להגיע לשלב זה לאחר 4.5 ימים ב 15 °C (5 °F), 3 ימים ב 20 °C (5 °F) או 2 ימים ב 25 °C (5 °F).
    3. מספר החזרות בהן נעשה שימוש יהיה תלוי בגודל ערכת הגנים שנבדקה. בספריית המלווה (97 גנים), ניסויים חוזרים לפחות ארבע פעמים. גודל האוכלוסייה תלוי באיזו נעשה שימוש. בהתקפות ההתנהגותיות שנדונו כאן, ציון >15 בעלי חיים לכל מצב ניסיוני בכל חזרה. נתונים ניתוחים סטטיסטיים גם תלויים מאוד בסוג של מבדק בשימוש. נתונים בבדקים שנדונו כאן יכולים להיות מוצגים כאמצעי ± SEM.
    4. השווה את בעלי החיים RNAi- וריק בקרה וקטורית התייחסו לאוכלוסיות עצמאיות. ניתן לחשב ערכי P באמצעות ANOVA חד-כיווני או דו-כיווני, בהתאם לשינויים שנבדקו, כלומר מחמירים או מקלים לבד או שניהם. בעת בחינת טיפול RNAi יחיד לעומת בקרה, ערכי P ניתן לחשב באמצעות חד כיווני או דו כיווני מאן-ויטני דירוג סכום הבדיקה. מלבד מובהקות סטטיסטית, שקול סף להיטים בהתבסס על מידת ההשפעה על הפנוטיפ.
  2. מעצר/עיכוב התפתחותי
    1. לטפח בעלי חיים מסונכרנים גיל כמו בשלב 4.1 עד שבעלי חיים גדלים על חיידקי בקרה ריקים המכילים וקטור להגיע לבגרות אבל לפני הטלת ביצים מתחיל.
    2. נטר בעלי חיים באמצעות סטריאומיקרוסקופ וספור את מספר הזחלים והמבוגרים כדי לקבל את אחוז בעלי החיים המתעכבים בהתפתחות. לעיון, השווה לבעלי חיים מוטנטיים הגדלים על חיידקי בקרה ריקים המכילים וקטורים. hsp-1 או hsp-90 RNAi טיפול תוצאות מעצר התפתחותי של חיות סוג בר והוא יכול לשמש שליטה חיובית.
    3. כדי לקבל את אחוז בעלי החיים המתעכבים התפתחותית לאורך זמן, חזור על שלב 4.2.2.
      הערה: אם יש מבוגרים מטילי ביצים על הצלחת, להעביר את בעלי החיים המתעכבים התפתחותית לצלחת חדשה NGM-RNAi שכותרתו לאותו גן יעד כדי למנוע בלבול עם צאצאים.
  3. סטריליות או הטלת ביצים פגמים
    1. לטפח בעלי חיים מסונכרנים גיל כמו בשלב 4.1 עד בעלי חיים גדל על חיידקים ריקים וקטור שליטה להתחיל להטיל ביצים.
    2. לעקוב אחר בעלי חיים באמצעות סטריאומיקוסקופ ולהשיג את אחוז בעלי החיים ללא ביצים גלויות ברחם שלהם. לעיון, השווה לבעלי חיים מוטנטיים הגדלים על חיידקים ריקים לשליטה וקטורית.
    3. לחלופין, לפקח על בעלי חיים באמצעות סטריאוטיקרוסקופ ולהבקיע את אחוז בעלי החיים עם רחם מלא ביצים, המוגדר EGg מטיל פגום (Egl-d) פנוטיפ29.
  4. קטלניות עוברית
    1. לטפח בעלי חיים מסונכרנים גיל כמו בשלב 4.1 עד שבעלי החיים מתחילים להטיל ביצים.
    2. מעבירים ~ 100 ביצים לצלחת ריקה. מורחים את הביצים בשורות כדי לפשט את הספירה.
    3. ציון האחוז של ביצים unhatched על הצלחת לאחר 24-48 שעות. לעיון, השווה לביצים של בעלי חיים שטופלו בחיידקים ריקים לשליטה וקטורית.
  5. שיתוק אסאי
    1. עבור יום 1 מבוגרים, לטפח בעלי חיים מסונכרנים גיל כמו בשלב 4.1 עד בעלי חיים גדל על חיידקים ריקים שליטה וקטורית להגיע לבגרות אבל לפני הטלת ביצים מתחיל.
    2. צייר קו על הגב של צלחת אגר NGM רגילה באמצעות סמן דק.
    3. מניחים 5-10 בעלי חיים על הקו המסומן.
    4. הגדר שעון זמן והמתן 10 דקות.
    5. ציון אחוז החיות שנותרו על הקו כמו תולעים משותקות. לעיון, השווה לבעלי חיים מוטנטיים הגדלים על חיידקים ריקים לשליטה וקטורית. חיות מסוג בר שטופלו עם unc-45 RNAi להראות פנוטיפ שיתוק חמור והוא יכול לשמש שליטה חיובית.
      הערה: מעש זה מדגיש בעלי חיים המציגים שיתוק בינוני עד חמור. בעלי חיים כאלה בדרך כלל שוכבים ישר על הצלחת, במקום להציג את הצורה המעוקלת הנפוצה. יתר על כן, תיקון נקי מחיידקים נראה סביב ראשיהם של תולעים משותקות.
  6. חבטות אסאי
    1. לטפח בעלי חיים מסונכרנים גיל כמו בשלב 4.1 עד בעלי חיים גדל על חיידקים ריקים וקטור שליטה להגיע לבגרות אבל לפני הטלת ביצים מתחיל.
    2. צינור 100 μL של חוצץ M9 בטמפרטורת הטיפוח של בעלי החיים לתוך צלחת 96 באר.
    3. מניחים ~ 15 תולעים, אחת לבאר, לתוך בארות המכילות מאגר M9.
    4. תן לבעלי החיים להסתגל במשך 5 דקות.
    5. בדקו כל חיה מתחת לסטריאוטיקרוסקופ, התחל שעון זמן בספירה לאחור של 15 s וספור את מספר כיפופי הגוף שכל חיה מבצעת באותה תוחלת זמן. ניתן לנרמל את הערכים שנספרו לכיפופי גוף לדקה. לעיון, השווה לבעלי חיים מוטנטיים הגדלים על חיידקים ריקים לשליטה וקטורית.
      הערה: זה תנועתיות assay הוא רגיש מאוד והוא יכול לזהות הבדלים קלים מאוד בין טיפולים. עם זאת, תנועתיות בנוזל ותנועתיות על אגר יכול להיות שונה.

5. אימות של נוקאאוט חלבון

  1. הניחו 250-300 ביצים מסונכרנות על צלחת NGM-RNAi 60 מ"מ עם החיידקים הרלוונטיים המביעים dsRNA או ריקים המכילים וקטור (L4440).
    הערה: RNAi נוקאאוט עלול לגרום הצטברות חריגה של עוברים, בהיעדר עוברים או במעצר התפתחותי שעלול להשפיע על ביטוי הגנים. יש לקחת זאת בחשבון בעת קביעת גיל בעלי החיים שיש לבחון.
  2. עבור יום 1 מבוגרים, לטפח בעלי חיים במשך 4.5 ימים ב 15 °C (5 °F), 3 ימים ב 20 °C (55 °F) או 2 ימים ב 25 °C (5 °F).
  3. בחר והעבר בסך הכל 200 בעלי חיים צעירים למבוגרים לתוך מכסה של צינור 1.5 מ"ל מלא עם 200 μL של PBS-T.
    הערה: בעת שימוש בבעלי חיים רגישים לטמפרטורה או מוטציות ליווי, עדיף לשמור על המאגרים המשמשים בפרוטוקול בטמפרטורת הטיפוח של בעלי החיים.
  4. סגרו את המכסה בזהירות וצנטריפוגה ב 1,000 x g במשך 1 דקות.
  5. הוסף 800 μL של PBS-T(טבלה 1)וצנטריפוגה ב 1,000 x g במשך 1 דקות.
  6. הסר בזהירות את 900 μL העליון.
  7. חזור על שלבים 5.4-5.6 שלוש פעמים.
  8. הסר 900 μL, משאיר 100 μL של פתרון המכיל את 200 תולעים.
  9. הוסף 25 μL של 5x מאגר מדגם(טבלה 1).
  10. מחממים את הדגימות במשך 10 דקות ב 92°C תוך רועד ב 1000 סל"ד. לאחר מכן ניתן להקפיא את הדגימות ושמר על -20 מעלות צלזיוס.
  11. טען 20 μL של כל דגימה ולהפעיל על ג'ל SDS-PAGE.
  12. בצע ניתוח כתם מערבי באמצעות נוגדנים מתאימים כדי לקבוע את היציבות היחסית של החלבון.
  13. קבע את עוצמת הרצועות באמצעות תוכנה צפיפות, כגון מודול ג'ל ImageJ זמין באופן חופשי. נרמל את כל הערכים לאלה שנמדדו בדגימות הבקרה.
    הערה: המטרה של RNAi נוקאאוט במסכים שלנו היא להוריד את רמות החלבון של מלווה מסוים / מלווה שותף. לכן, הדרך הטובה ביותר להעריך את היעילות של RNAi נוקאאוט היא על ידי ניתוח כתם מערבי. זה דורש נוגדנים ספציפיים. לחלופין, ניתן להשתמש ב- qPCR כדי לכמת את רמות ה- mRNA.

תוצאות

שימוש במוטציות רגישות לטמפרטורה ב-UNC-45 כדי לסנן להחמיר או להקל על אינטראקציות בתנאים מתירניים או מגבילים, בהתאמה
הרכבה ותחזוקת שרירים מציעים מערכת יעילה לחקר אינטראקציות מלווה ספציפיות לרקמות. היחידה התפקודית של שרירים מתכווצים, הסרקומר, מציגה סידור דמוי גבישי של חלבונים מבני?...

Discussion

תמונה משולבת של רשת הפרוטאוסטזיס המשקפת כיצד היא מאורגנת ומתפקדת בתאים ורקמות מטזואניים שונים נותרה חסרה. כדי להתמודד עם חסרונות אלה, נדרש מידע ספציפי על האינטראקציות של רכיבים שונים של רשת זו, כגון מלווים מולקולריים, ברקמות ספציפיות במהלך ההתפתחות וההזדקנות. כאן, הראינו כיצד השימוש בהתע...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים למרכז לגנטיקה של Caenorhabditis, במימון המרכז הלאומי למשאבי מחקר של NIH (NCRR), על חלק מזני הנמטודה. נוגדנים חד שבטיים שפותחו על ידי ה.פ. אפשטיין התקבלו מבנק ההיברידיומה למחקרים התפתחותיים שפותח בחסות ה- NICHD ומתוחזק על ידי המחלקה לביולוגיה, אוניברסיטת איווה. מחקר זה נתמך על ידי מענק של הקרן הישראלית למדע (מענק מס' 278/18) ובמענק ממשרד המדע והטכנולוגיה ומשרד החוץ ושיתוף הפעולה הבינלאומי, המנהל הכללי לקידום המדינה, הרפובליקה האיטלקית (מענק מס' 14337). אנו מודים לחברי מעבדת בן צבי על העזרה בהכנת כתב יד זה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
12-well-platesSPLBA3D16B
40 mm platesGreiner Bio-one627160
60 mm platesGreiner Bio-one628102
6-well platesThermo Scientific140675
96 well 2 mL 128.0/85mmGreiner Bio-one780278
AgarFormediumAGA03
AmpicillinFormedium69-52-3
bromophenol blueSigmaBO126-25G
CaCl2Merck1.02382.0500
CameraQimagingq30548
CholesterolAmresco0433-250G
ConfocalLeicaDM5500
Filter (0.22 µm)SigmaSCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscopeLeicaMZ165FC
GlycerolFrutarom2355519000024
IPTGFormedium367-93-1
KClMerck104936
KH2PO4Merck1.04873.1000
KOHBio-Lab001649029100
MgSO4Fisher22189-08-8Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibodyHybridoma Bank5-6
Na2HPO4·7H2OSigmas-0751
NaClBio-Lab001903029100
PeptoneMerck61930705001730
Plate pouring pumpIntegradoes it p920
RNAi Chaperone libraryNANA
SDSVWR Life Science0837-500
ß-mercaptoethanolBio world41300000-1
stereomicroscopeLeicaMZ6
TetracyclineDuchefa Biochemie64-75-5
TrisBio-Lab002009239100
Tween-20FisherBP337-500

References

  1. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
  2. Dubnikov, T., Ben-Gedalya, T., Cohen, E. Protein quality control in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (3), (2017).
  3. Bar-Lavan, Y., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Chaperone families and interactions in metazoa. Essays in Biochemistry. 60 (2), 237-253 (2016).
  4. Schopf, F. H., Biebl, M. M., Buchner, J. The HSP90 chaperone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 345-360 (2017).
  5. Carra, S., et al. The growing world of small heat shock proteins: from structure to functions. Cell Stress Chaperones. 22 (4), 601-611 (2017).
  6. Rosenzweig, R., Nillegoda, N. B., Mayer, M. P., Bukau, B. The Hsp70 chaperone network. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
  7. Gestaut, D., Limatola, A., Joachimiak, L., Frydman, J. The ATP-powered gymnastics of TRiC/CCT: an asymmetric protein folding machine with a symmetric origin story. Current Opinion in Structural Biology. 55, 50-58 (2019).
  8. Bett, J. S. Proteostasis regulation by the ubiquitin system. Essays in Biochemistry. 60 (2), 143-151 (2016).
  9. Jackson, M. P., Hewitt, E. W. Cellular proteostasis: degradation of misfolded proteins by lysosomes. Essays in Biochemistry. 60 (2), 173-180 (2016).
  10. Kettern, N., Dreiseidler, M., Tawo, R., Hohfeld, J. Chaperone-assisted degradation: multiple paths to destruction. Biological Chemistry. 391 (5), 481-489 (2010).
  11. Cuervo, A. M., Wong, E. Chaperone-mediated autophagy: roles in disease and aging. Cell Research. 24 (1), 92-104 (2014).
  12. Kevei, E., Pokrzywa, W., Hoppe, T. Repair or destruction-an intimate liaison between ubiquitin ligases and molecular chaperones in proteostasis. FEBS Letters. 591 (17), 2616-2635 (2017).
  13. O'Brien, D., van Oosten-Hawle, P. Regulation of cell-non-autonomous proteostasis in metazoans. Essays in Biochemistry. 60 (2), 133-142 (2016).
  14. Taipale, M., et al. Quantitative analysis of HSP90-client interactions reveals principles of substrate recognition. Cell. 150 (5), 987-1001 (2012).
  15. Taipale, M., et al. A quantitative chaperone interaction network reveals the architecture of cellular protein homeostasis pathways. Cell. 158 (2), 434-448 (2014).
  16. Baryshnikova, A., Costanzo, M., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Genetic interaction networks: toward an understanding of heritability. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 14, 111-133 (2013).
  17. Costanzo, M., et al. Global Genetic Networks and the Genotype-to-Phenotype Relationship. Cell. 177 (1), 85-100 (2019).
  18. Domingo, J., Baeza-Centurion, P., Lehner, B. The Causes and Consequences of Genetic Interactions (Epistasis). Annual Review of Genomics and Human Genetics. 20, 433-460 (2019).
  19. Jonikas, M. C., et al. Comprehensive characterization of genes required for protein folding in the endoplasmic reticulum. Science. 323 (5922), 1693-1697 (2009).
  20. Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123 (3), 507-519 (2005).
  21. Billi, A. C., Fischer, S. E., Kim, J. K. Endogenous RNAi pathways in C. elegans. WormBook. , 1-49 (2014).
  22. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  23. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  24. Lehner, B., Crombie, C., Tischler, J., Fortunato, A., Fraser, A. G. Systematic mapping of genetic interactions in Caenorhabditis elegans identifies common modifiers of diverse signaling pathways. Nature Genetics. 38 (8), 896-903 (2006).
  25. Frumkin, A., et al. Challenging muscle homeostasis uncovers novel chaperone interactions in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 21 (2014).
  26. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  27. Shpigel, N., Shemesh, N., Kishner, M., Ben-Zvi, A. Dietary restriction and gonadal signaling differentially regulate post-development quality control functions in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 18 (2), 12891 (2019).
  28. Shai, N., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Remodeling of proteostasis upon transition to adulthood is linked to reproduction onset. Current Genomics. 15 (2), 122-129 (2014).
  29. Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 104 (4), 619-647 (1983).
  30. Pokrzywa, W., Hoppe, T. Chaperoning myosin assembly in muscle formation and aging. Worm. 2 (3), 25644 (2013).
  31. Barral, J. M., Bauer, C. C., Ortiz, I., Epstein, H. F. Unc-45 mutations in Caenorhabditis elegans implicate a CRO1/She4p-like domain in myosin assembly. Journal of Cell Biology. 143 (5), 1215-1225 (1998).
  32. Venolia, L., Ao, W., Kim, S., Kim, C., Pilgrim, D. unc-45 gene of Caenorhabditis elegans encodes a muscle-specific tetratricopeptide repeat-containing protein. Cell Motility and the Cytoskeleton. 42 (3), 163-177 (1999).
  33. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  34. Etard, C., et al. The UCS factor Steif/Unc-45b interacts with the heat shock protein Hsp90a during myofibrillogenesis. Developmental Biology. 308 (1), 133-143 (2007).
  35. Wohlgemuth, S. L., Crawford, B. D., Pilgrim, D. B. The myosin co-chaperone UNC-45 is required for skeletal and cardiac muscle function in zebrafish. Developmental Biology. 303 (2), 483-492 (2007).
  36. Barral, J. M., Hutagalung, A. H., Brinker, A., Hartl, F. U., Epstein, H. F. Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science. 295 (5555), 669-671 (2002).
  37. Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
  38. Gaiser, A. M., Kaiser, C. J., Haslbeck, V., Richter, K. Downregulation of the Hsp90 system causes defects in muscle cells of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6 (9), 25485 (2011).
  39. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
  40. Bar-Lavan, Y., et al. A Differentiation Transcription Factor Establishes Muscle-Specific Proteostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 12 (12), 1006531 (2016).
  41. Qadota, H., et al. Establishment of a tissue-specific RNAi system in C. elegans. Gene. 400 (1-2), 166-173 (2007).
  42. Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS Genet. 9 (11), 1003921 (2013).
  43. Fisher, A. L. Of worms and women: sarcopenia and its role in disability and mortality. Journal of the American Geriatrics Society. 52 (7), 1185-1190 (2004).
  44. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  45. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  46. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  47. Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
  48. Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489 (7415), 263-268 (2012).
  49. Liu, G., Rogers, J., Murphy, C. T., Rongo, C. EGF signalling activates the ubiquitin proteasome system to modulate C. elegans lifespan. EMBO Journal. 30 (15), 2990-3003 (2011).
  50. Asikainen, S., Vartiainen, S., Lakso, M., Nass, R., Wong, G. Selective sensitivity of Caenorhabditis elegans neurons to RNA interference. Neuroreport. 16 (18), 1995-1999 (2005).
  51. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  52. Eremenko, E., Ben-Zvi, A., Morozova-Roche, L. A., Raveh, D. Aggregation of human S100A8 and S100A9 amyloidogenic proteins perturbs proteostasis in a yeast model. PLoS One. 8 (3), 58218 (2013).
  53. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  54. Yu, A., et al. Tau protein aggregates inhibit the protein-folding and vesicular trafficking arms of the cellular proteostasis network. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  55. Yu, A., et al. Protein aggregation can inhibit clathrin-mediated endocytosis by chaperone competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1481-1490 (2014).
  56. Parker-Thornburg, J., Bonner, J. J. Mutations that induce the heat shock response of Drosophila. Cell. 51 (5), 763-772 (1987).
  57. Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nature Reviews Genetics. 9 (7), 554-566 (2008).
  58. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
  59. Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
  60. Rohl, A., Rohrberg, J., Buchner, J. The chaperone Hsp90: changing partners for demanding clients. Trends in Biochemical Sciences. 38 (5), 253-262 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160CaenorhabditisRNAi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved