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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Um Chaperon-Chaperon- und Chaperon-Substrat-Interaktionen zu untersuchen, führen wir synthetische Interaktionsscreens bei Caenorhabditis elegans mit RNA-Interferenz in Kombination mit leichten Mutationen oder Überexpression von Chaperonen durch und überwachen gewebespezifische Proteindysfunktion auf organismischer Ebene.

Zusammenfassung

Die korrekte Faltung und Montage von Proteinen und Proteinkomplexen ist für die Zellfunktion unerlässlich. Zellen verwenden Qualitätskontrollwege, die beschädigte Proteine korrigieren, sequestrieren oder eliminieren, um ein gesundes Proteom zu erhalten, wodurch die zelluläre Proteostase sichergestellt und weitere Proteinschäden verhindert werden. Aufgrund redundanter Funktionen innerhalb des Proteostase-Netzwerks führt das Screening auf nachweisbare Phänotypen mittels Knockdown oder Mutationen in Chaperon-kodierenden Genen im Vielzellorganismus Caenorhabditis elegans in den meisten Fällen zum Nachweis von geringfügigen oder keinen Phänotypen. Wir haben eine gezielte Screening-Strategie entwickelt, um Chaperone zu identifizieren, die für eine bestimmte Funktion benötigt werden, und so die Lücke zwischen Phänotyp und Funktion zu schließen. Insbesondere überwachen wir neuartige Chaperon-Interaktionen mit RNAi-synthetischen Interaktionsbildschirmen, die die Chaperonexpression nacheinander bei Tieren niederschlagen, die eine Mutation in einem Chaperon-kodierenden Gen tragen oder ein Chaperon von Interesse überexpressieren. Indem wir zwei Chaperone stören, die einzeln keinen groben Phänotyp aufweisen, können wir Chaperone identifizieren, die einen bestimmten Phänotyp verschlimmern oder freilegen, wenn beide gestört sind. Wir zeigen, dass dieser Ansatz bestimmte Gruppen von Chaperonen identifizieren kann, die zusammen funktionieren, um die Faltung eines Proteins oder von Proteinkomplexen zu modulieren, die mit einem bestimmten Phänotyp assoziiert sind.

Einleitung

Zellen bewältigen Proteinschäden durch den Einsatz von Qualitätskontrollmaschinen, die beschädigte Proteine reparieren, sequestrieren oder entfernen1,2. Die Faltung und Montage von Proteinkomplexen wird durch molekulare Chaperone unterstützt, eine vielfältige Gruppe hochkonservierter Proteine, die beschädigte Proteine reparieren oder sequestrieren können3,4,5,6,7. Die Entfernung geschädigter Proteine wird durch das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS)8 oder durch die Autophagie-Maschinerie9 in Zusammenarbeit mit den Chaperonen10,11,12vermittelt. Die Protein-Homöostase (Proteostase) wird daher durch Qualitätskontrollnetzwerke aufrechterhalten, die aus Falt- und Abbaumaschinen bestehen3,13. Die Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Komponenten des Proteostase-Netzwerks in vivo zu verstehen, ist jedoch eine große Herausforderung. Während Protein-Protein-Interaktionsscreens wichtige Informationen über physikalische Interaktionen und Chaperonkomplexe14,15beisteuern, fehlt es an einem Verständnis der Organisation und der kompensatorischen Mechanismen innerhalb gewebespezifischer Chaperonnetzwerke in vivo.

Genetische Interaktionen werden oft als leistungsfähiges Werkzeug verwendet, um die Beziehung zwischen Genpaaren zu untersuchen, die an gemeinsamen oder kompensatorischen biologischen Signalwegen beteiligt sind16,17,18. Solche Beziehungen können gemessen werden, indem Mutationspaare kombiniert und der Einfluss einer Mutation in einem Gen auf den phänotypischen Schweregrad, der durch eine Mutation im zweiten Gen verursacht wird, quantifiziertwird 16. Während die meisten dieser Kombinationen keine Wirkung in Bezug auf den Phänotyp zeigen, können einige genetische Interaktionen die Schwere des gemessenen Phänotyps entweder verschlimmern oder lindern. Erschwerende Mutationen werden beobachtet, wenn der Phänotyp der Doppelslektionsmutante schwerwiegender ist als der erwartete Phänotyp, der bei der Kombination der einzelnen Deletionsmutanten beobachtet wird, was bedeutet, dass die beiden Gene in parallelen Signalwegen funktionieren und zusammen eine bestimmte Funktion beeinflussen. Im Gegensatz dazu werden lindernde Mutationen beobachtet, wenn der Phänotyp der Doppelsleerationsmutante weniger schwerwiegend ist als der Phänotyp, der bei den Einzelnen Deletionsmutanten beobachtet wurde, was bedeutet, dass die beiden Gene zusammen als Komplex wirken oder am gleichen Weg teilnehmen16,18. Dementsprechend wurden verschiedene Phänotypen, die quantifiziert werden können, einschließlich breiter Phänotypen wie Letalität, Wachstumsraten und Brutgröße, sowie spezifischer Phänotypen wie Transkriptionsreporter verwendet, um genetische Interaktionen zu identifizieren. Zum Beispiel stützten sich Jonikas et al. auf einen ER-Stressreporter, um die Interaktionen des Saccharomyces cerevisiae ER entfalteten Proteinantwort-Proteostase-Netzwerks mit paarweisen Gen-Deletionsanalysen zu untersuchen19.

Genetische Interaktionsscreens beinhalten die systematische Kreuzung paarweiser Deletionsmutationen, um einen umfassenden Satz von Doppelmutanten zu erzeugen20. In Tiermodellen und speziell bei C. elegansist dieser groß angelegte Ansatz jedoch nicht durchführbar. Stattdessen können mutierte Stämme auf ihre genetischen Interaktionsmuster getestet werden, indem die Genexpression mithilfe von RNA-Interferenz (RNAi) herunterreguliert wird21. C. elegans ist ein leistungsfähiges System für Bildschirme auf Basis von RNAi22,23. Bei C. eleganswird die doppelsträngige RNA-Abgabe (dsRNA) durch bakterielle Fütterung erreicht, was zur Ausbreitung von dsRNA-Molekülen auf zahlreiche Gewebe führt. Auf diese Weise wirken die eingebrachten dsRNA-Moleküle über ein schnelles und einfaches Verfahren auf das Tier21. Ein genetisches Interaktionsscreening mit RNAi kann daher die Auswirkungen der Downregulierung einer Reihe von Genen oder der meisten C. elegans-kodierenden Gene unter Verwendung von RNAi-Bibliothekenaufdecken 24. In einem solchen Bildschirm sind Treffer, die das Verhalten der mutanten von Interesse beeinflussen, aber nicht des Wildtypstamms, potenzielle Modifikatoren des zu überwachenden Phänotyps25. Hier wenden wir eine Kombination aus Mutationen und RNAi-Screening an, um gewebespezifische Chaperon-Interaktionen bei C. elegans systematisch abzubilden.

Protokoll

1. Herstellung von Nematoden-Wachstumsmedienplatten für RNAi

  1. Zu einer 1 L Flasche 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-Pepton, 17 g Agar und destilliertes Wasser bis 1 L und Autoklav geben.
  2. Flasche auf 55 °C abkühlen.
  3. Fügen Sie 25 ml 1 MKH2PO4, pH 6,0, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4und 1 ml Cholesterinlösung (Tabelle 1) hinzu, um Nematodenwachstumsmedien (NGM) herzustellen.
  4. Fügen Sie 1 ml Ampicillin (100 mg/ml) und 0,5 ml 1 M IPTG(Tabelle 1)hinzu, um NGM-RNAi-Lösung herzustellen.
    HINWEIS: Häufig verwendete HT115(DE3) E. coli-Bakterien enthalten eine IPTG-induzierbare T7-DNA-Polymerase, die zur Exprimierung der dsRNA-kodierenden Plasmide verwendet wird. Diese Plasmide kodieren auch für die Ampicillinresistenz.
  5. Mischen Sie die warme Lösung, indem Sie die Flasche schwenken.
  6. In der Haube oder mit sterilen Verfahren die NGM-Lösung in Platten gießen oder mit einer Peristaltikpumpe die Lösung in Platten dosieren. Verwenden Sie für diesen Bildschirm 6-Well-, 12-Well-, 40-mm- oder 60-mm-Platten. Agar sollte etwa 2/3 der Plattentiefe füllen.
  7. Lassen Sie die Platten über Nacht auf der Bank bei Raumtemperatur trocknen und halten Sie die Platten bedeckt. NGM-Platten für RNAi können bis zu einem Monat bei 4 °C gelagert werden.

2. RNAi-Bakterien züchten und Platten aussäen

  1. In der Haube oder mit sterilen Verfahren 1 ml Ampicillin (100 mg/ml) und 2,5 ml Tetracyclin (5 mg/ml)(Tabelle 1)zu einer vor autoklavierten 1 L LB-Lösung geben und mischen.
    HINWEIS: Häufig verwendete HT115(DE3) E. coli Bakterien sind tetracyclinresistent.
  2. In der Haube oder mit sterilen Verfahren 600 μL LB-Lösung in jeder Vertiefung in 2 ml tiefen 96-Well-sterilen Platten hinzufügen. Für die Dosierung der Medien verwenden Sie am besten eine Mehrkanalpipet.
  3. Mit sterilen Verfahren werden Vertiefungen mit HT115(DE3) E. coli-Bakterien geimpft, die mit einem dsRNA-kodierenden Plasmid transformiert wurden, das auf ein interessantes Gen oder ein leeres Plasmid abzielt, um ein Gen oder ein leeres Plasmid als Kontrolle zu kontrollieren. Decken Sie die Platten ab und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C. Bibliotheken, die aus bakteriellen Klonen bestehen, die dsRNA exprimieren, was ~ 94% der vorhergesagten C. elegans-Gene entspricht,wurden zuvor22,23 konstruiert und sind kommerziell erhältlich. Die hier verwendete Chaperon-Bibliothek wurde vom Dr. Richard Morimoto Labor26gebaut.
  4. Mit sterilen Verfahren 75, 150 oder 250 μL Bakterien auf die 12-Well-, 40-mm- und 6-Well- bzw. 60-mm-NGM-RNAi-Platten aussäen. Markieren Sie deutlich den Namen des Zielgens auf der Platte. Bakterien sollten 30-50% der Agaroberfläche bedecken und die Ränder der Platte nicht berühren.
  5. Lassen Sie die Platten mindestens 2 Tage auf der Bank bei Raumtemperatur trocknen und halten Sie die Platten bedeckt.
    HINWEIS: Platten können über Nacht bei 37 °C inkubiert werden. Stellen Sie sicher, dass die inneren Vertiefungen trocken sind, bevor Sie die Platten verwenden oder lagern. Für alle langfristigen Zwecke (z. B. Trocknen oder Lagern) halten Sie die Platten im Dunkeln. Getrocknete, ausgesäte Platten können bis zu einem Monat bei 4 °C gelagert werden.

3. Stressfreie Synchronisation von Embryonen

  1. Verwenden Sie einen Wurmpickel, um etwa 100 Eier von einer unsynchronisierten Wurmplatte auf eine neu ausgesäte NGM-Platte zu bewegen.
  2. Tiere 5 Tage bei 15 °C, 3,5 Tage bei 20 °C oder 2,5 Tage bei 25 °C kultivieren. Tiere sollten den ersten Tag der Eiablage erreichen.
    HINWEIS: Würmer werden üblicherweise bei 20 °C kultiviert. Verschiedene Chaperon-Mutantenstämme können jedoch spezifische Kultivierungstemperaturen erfordern. Zum Beispiel werden viele temperaturempfindliche Stämme bei 15 °C kultiviert, aber auf 25 °C verschoben, um ihren Phänotyp freizulegen.
  3. Fügen Sie 1 ml M9-Puffer (Tabelle 1) langsam und weg vom Bakterien rasen hinzu. Drehen Sie die Platte so, dass der Puffer die Platte vollständig bedeckt. Dann kippen Sie es zur Seite und entfernen Sie die Flüssigkeit vom Teller und waschen Sie die Tiere vom Teller.
    HINWEIS: Bei der Verwendung von temperaturempfindlichen Tieren oder Chaperonmutanten ist es am besten, die im Protokoll verwendeten Puffer auf der Kultivierungstemperatur der Tiere zu halten.
  4. Wiederholen Sie Schritt 3.3 dreimal oder bis alle Tiere vom Teller gewaschen sind.
  5. Schneiden Sie mit einer Standard-Kunststoffspitze ein Quadrat Agar aus dem gewaschenen Teller, auf dem die Eier konzentriert sind, und legen Sie das Stück Agar auf eine neu ausgesäte NGM-Platte.
    HINWEIS: ~ 200 Eier sind erforderlich, um genügend eierlegende Tiere zu produzieren; zu viele Tiere verbrauchen die Bakterien zu schnell. Niedrige Nahrungswerte können die Proteostase beeinflussen27.
  6. Kultivieren Sie die Tiere für 5 Tage bei 15 °C, 3,5 Tage bei 20 °C oder 2,5 Tage bei 25 °C. An dieser Stelle sollten die Platten mit synchronisierten Eiern bedeckt werden.
    HINWEIS: Tiere können für kurze Zeit auf eine neue Platte verschoben werden, um eine strengere Synchronisation zu erreichen. Es ist jedoch wichtig, erwachsene Erwachsene nur in den frühen Stadien der Eiablage zu verwenden, da Tiere Eier in ihrer Gebärmutter behalten können, was die Synchronisation beeinflusst.
  7. Fügen Sie 1 ml M9-Puffer langsam und weg vom Bakterien rasen hinzu.
  8. Drehen Sie die Platte so, dass der Puffer die Platte vollständig bedeckt. Dann kippen Sie es zur Seite und entfernen Sie die Flüssigkeit vom Teller und waschen Sie die Tiere vom Teller.
  9. Wiederholen Sie Schritt 3.7 dreimal oder bis alle Tiere vom Teller gewaschen sind.
  10. Fügen Sie 1 ml M9-Puffer hinzu und verwenden Sie einen Zellschaber, um die Eier von der Platte zu lösen.
  11. Sammeln Sie den M9-Puffer mit den Eiern von den Platten.
  12. Zentrifugieren Sie den M9-Puffer mit den Eiern bei 3.000 x g für 2 min.
  13. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie den M9-Puffer hinzu, um ein Volumen von 1 ml zu erreichen.
  14. Resuspendieren Sie die Eier, um alle Brocken von Eiern und Bakterien zu stören.
  15. Wiederholen Sie den in den Schritten 3.11-3.13 beschriebenen Waschvorgang fünfmal. Das Eierpellet sollte weiß erscheinen. Wenn es immer noch gelb / braun ist, wiederholen Sie die Wäsche, bis ein weißes Pellet erreicht ist.
    HINWEIS: Bakterien, die auf den Eiern verbleiben, können die dsRNA-exprimierenden Bakterien kontaminieren.
  16. Entfernen Sie den größten Teil des Überstands, so dass etwa 200 μL übrig bleiben. Synchronisierte Eier können für RNAi-Bildschirme verwendet werden.

4. Gängige phänotypische Assays

  1. Kultivierung von Tieren im Rahmen von Experimenten
    1. Legen Sie einen Tropfen von ~ 30 Eiern in die Nähe des Bakterien rasens in jede RNAi-samenete Platte. Als Referenz legen Sie auch ~ 30 Eier auf Teller, die mit leeren vektorhaltigen (L4440) Bakterien gesät sind.
    2. Kultivieren Sie alterssynchronisierte Tiere auf NGM RNAi-gesäten Platten. Die Dauer des Experiments hängt von der Phase ab, in der die Tiere überwacht werden sollen, und von der Temperatur des Anbaus. Passen Sie die Kultivierungstemperatur an, wenn Temperaturempfindliche mutierte Tiere verwendet werden. Passen Sie die Kultivierungsdauer an, wenn entwicklungsverzögerte mutierte Tiere verwendet werden.
      HINWEIS: Während das Timing variieren kann, könnten die Eiablage (und der daraus resultierende schnelle Nahrungskonsum) sowie der altersabhängige Proteostsiskollaps28die Ergebnisse beeinflussen, sobald die Tiere das Erwachsenenalter erreicht haben. Es wird daher empfohlen, Tiere vor Beginn der Eiablage (Tag 1 des Erwachsenenalters) zu bewerten. Wildtyptiere erreichen dieses Stadium nach 4,5 Tagen bei 15 °C, 3 Tagen bei 20 °C oder 2 Tagen bei 25 °C.
    3. Die Anzahl der verwendeten Wiederholungen hängt von der Größe des untersuchten Gensatzes ab. Für die Chaperon-Bibliothek (97 Gene) wiederholen Sie Experimente mindestens viermal. Die Größe der Population hängt vom verwendeten Assay ab. In den hier diskutierten Verhaltenstests werden bei jeder Wiederholung >15 Tiere pro Versuchsbedingung bewertet. Daten und statistische Analysen hängen auch stark von der Art des verwendeten Assays ab. Die Daten in den hier besprochenen Assays können als Mittel ± SEM dargestellt werden.
    4. Vergleichen Sie die RNAi- und Empty Vector Control-behandelten Tiere als unabhängige Populationen. P-Werte können mit Einweg- oder Zwei-Wege-ANOVA berechnet werden, abhängig von den untersuchten Veränderungen, nämlich verschlimmernd oder lindernd allein oder beides. Bei der Untersuchung einer einzelnen RNAi-Behandlung im Vergleich zur Kontrolle können P-Werte mit einem einseitigen oder zweiseitigen Mann-Whitney-Rangsummentest berechnet werden. Abgesehen von der statistischen Signifikanz sollten Sie einen Schwellenwert für Treffer in Betracht ziehen, der auf dem Grad der Auswirkungen auf den Phänotyp basiert.
  2. Entwicklungsarrest/-verzögerung
    1. Kultivieren Sie alterssynchronisierte Tiere wie in Schritt 4.1, bis Tiere, die auf leeren vektorhaltigen Kontrollbakterien gezüchtet wurden, das Erwachsenenalter erreichen, aber bevor die Eiablage beginnt.
    2. Überwachen Sie Tiere mit einem Stereomikroskop und zählen Sie die Anzahl der Larven und Erwachsenen, um den Prozentsatz der entwicklungsverzögerten Tiere zu bewerten. Vergleichen Sie als Referenz mit mutierten Tieren, die auf leeren vektorhaltigen Kontrollbakterien gezüchtet wurden. Die Behandlung mit hsp-1 oder hsp-90 RNAi führt zu einem Entwicklungsstillstand von Wildtyptieren und kann als Positivkontrolle eingesetzt werden.
    3. Um den Prozentsatz der entwicklungsverzögerten Tiere im Laufe der Zeit zu bewerten, wiederholen Sie Schritt 4.2.2.
      HINWEIS: Wenn sich eilegende Erwachsene auf dem Teller befinden, übertragen Sie die entwicklungsverzögerten Tiere auf eine neue NGM-RNAi-Platte, die für dasselbe Zielgen markiert ist, um Verwechslungen mit Nachkommen zu vermeiden.
  3. Sterilität oder Mängel bei der Eiablage
    1. Kultivieren Sie alterssynchronisierte Tiere wie in Schritt 4.1, bis Tiere, die auf leeren Vektorkontrollbakterien gezüchtet wurden, eierlegen.
    2. Überwachen Sie Tiere mit einem Stereomikroskop und bewerten Sie den Prozentsatz der Tiere ohne sichtbare Eier in ihrer Gebärmutter. Vergleichen Sie als Referenz mit mutierten Tieren, die auf leeren Vektorkontrollbakterien gezüchtet wurden.
    3. Alternativ können Sie Tiere mit einem Stereomikroskop überwachen und den Prozentsatz der Tiere mit einer Gebärmutter voller Eier bewerten, definiert als EGg Laying defekter (Egl-d) Phänotyp29.
  4. Embryonale Letalität
    1. Kultivieren Sie alterssynchronisierte Tiere wie in Schritt 4.1, bis die Tiere mit dem Eierlegen beginnen.
    2. ~100 Eier auf einen leeren Teller geben. Verteilen Sie die Eier in Reihen, um das Zählen zu vereinfachen.
    3. Bewerten Sie den Prozentsatz der ungeschlüpften Eier auf dem Teller nach 24-48 Stunden. Vergleichen Sie als Referenz mit Eiern von Tieren, die mit leeren Vektorkontrollbakterien behandelt wurden.
  5. Lähmungstest
    1. Kultivieren Sie für Erwachsene am Tag 1 alterssynchronisierte Tiere wie in Schritt 4.1, bis Tiere, die mit leeren Vektorkontrollbakterien gezüchtet wurden, das Erwachsenenalter erreichen, aber bevor die Eiablage beginnt.
    2. Zeichnen Sie eine Linie auf der Rückseite einer normalen NGM-Agarplatte mit einem feinen Marker.
    3. Legen Sie 5-10 Tiere auf die markierte Linie.
    4. Stellen Sie einen Timer ein und warten Sie 10 Minuten.
    5. Bewerten Sie den Prozentsatz der Tiere, die als gelähmte Würmer auf der Linie verbleiben. Vergleichen Sie als Referenz mit mutierten Tieren, die auf leeren Vektorkontrollbakterien gezüchtet wurden. Wildtyptiere, die mit unc-45 RNAi behandelt wurden, zeigen einen schweren Lähmungsphänotyp und können als Positivkontrolle verwendet werden.
      HINWEIS: Dieser Assay hebt Tiere hervor, die eine mittlere bis schwere Lähmung zeigen. Solche Tiere liegen normalerweise gerade auf dem Teller, anstatt die übliche gekrümmte Form zu präsentieren. Darüber hinaus ist ein von Bakterien befreites Pflaster um die Köpfe gelähmter Würmer sichtbar.
  6. Thrashing-Assay
    1. Kultivieren Sie alterssynchronisierte Tiere wie in Schritt 4.1, bis Tiere, die auf leeren Vektorkontrollbakterien gezüchtet wurden, das Erwachsenenalter erreichen, aber bevor die Eiablage beginnt.
    2. Pipettieren Sie 100 μL M9-Puffer bei der Kultivierungstemperatur der Tiere in eine 96-Well-Platte.
    3. Legen Sie ~ 15 Würmer, einen pro Bohrung, in die M9-Pufferbrunnen.
    4. Lassen Sie die Tiere für 5 min einstellen.
    5. Untersuchen Sie jedes Tier unter dem Stereomikroskop, starten Sie einen Timer, der 15 s herunterzählt, und zählen Sie die Anzahl der Körperbiegungen, die jedes Tier in dieser Zeitspanne ausführt. Die gezählten Werte können auf Körperbiegungen pro Minute normalisiert werden. Vergleichen Sie als Referenz mit mutierten Tieren, die auf leeren Vektorkontrollbakterien gezüchtet wurden.
      HINWEIS: Dieser Motilitätstest ist sehr empfindlich und kann sehr leichte Unterschiede zwischen den Behandlungen erkennen. Die Motilität in der Flüssigkeit und die Motilität auf Agar können sich jedoch unterscheiden.

5. Validierung des Protein-Knockdowns

  1. 250-300 synchronisierte Eier werden auf eine 60 mm NGM-RNAi-Platte gesetzt, die mit den relevanten dsRNA-exprimierenden oder leeren vektorhaltigen (L4440) Bakterien gesät ist.
    HINWEIS: RNAi-Knockdown könnte zu einer aberranten Ansammlung von Embryonen, zu einem Mangel an Embryonen oder zu einem Entwicklungsstillstand führen, der die Genexpression beeinträchtigen könnte. Dies sollte bei der Bestimmung des Alters der zu untersuchenden Tiere berücksichtigt werden.
  2. Für Erwachsene am 1. Tag 4,5 Tage bei 15 °C, 3 Tage bei 20 °C oder 2 Tage bei 25 °C kultivieren.
  3. Insgesamt 200 junge erwachsene Tiere pflücken und in die Kappe einer 1,5 mL Röhrchenfüllung mit 200 μL PBS-T geben.
    HINWEIS: Bei der Verwendung von temperaturempfindlichen Tieren oder Chaperonmutanten ist es am besten, die im Protokoll verwendeten Puffer auf der Kultivierungstemperatur der Tiere zu halten.
  4. Schließen Sie die Kappe vorsichtig und zentrifugieren Sie bei 1.000 x g für 1 min.
  5. 800 μL PBS-T (Tabelle 1) hinzufügen und bei 1.000 x g zentrifugieren für 1 min.
  6. Entfernen Sie vorsichtig die oberen 900 μL.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 5.4-5.6 dreimal.
  8. 900 μL entfernen, wobei 100 μL Lösung mit den 200 Würmern übrig bleiben.
  9. Fügen Sie 25 μL 5x Probenpuffer hinzu (Tabelle 1).
  10. Erhitzen Sie die Proben für 10 min bei 92°C beim Schütteln bei 1000 U/min. Die Proben können dann eingefroren und bei -20 °C aufbewahrt werden.
  11. Laden Sie 20 μL jeder Probe und führen Sie sie mit einem SDS-PAGE-Gel aus.
  12. Führen Sie eine Western-Blot-Analyse mit geeigneten Antikörpern durch, um die relative Stabilität des Proteins zu bestimmen.
  13. Bestimmen Sie die Intensität der Bänder mit einer densitometrischen Software, wie z.B. dem frei verfügbaren ImageJ Gelmodul. Normalisieren Sie alle Werte auf die in der/den Kontrollprobe(n) gemessenen Werte.
    HINWEIS: Das Ziel des RNAi-Knockdowns in unseren Bildschirmen ist es, den Proteinspiegel eines bestimmten Chaperons / Co-Chaperons zu senken. Daher ist der beste Weg, die Effizienz des RNAi-Knockdowns zu bewerten, die Western-Blot-Analyse. Dies erfordert spezifische Antikörper. Alternativ kann qPCR verwendet werden, um mRNA-Spiegel zu quantifizieren.

Ergebnisse

Verwendung temperaturempfindlicher Mutationen in UNC-45 zum Screening auf verschlimmernde oder lindernde Wechselwirkungen unter freizügigen bzw. restriktiven Bedingungen
Muskelaufbau und -erhaltung bieten ein effektives System zur Untersuchung gewebespezifischer Chaperon-Interaktionen. Die Funktionelle Einheit der kontraktilen Muskeln, das Sarkomer, stellt eine kristalline Anordnung von strukturellen und regulatorischen Proteinen dar. Die Stabilität des Motorproteins Myosin und sein Einbau in die di...

Diskussion

Ein integriertes Bild des Proteostase-Netzwerks, das widerspiegelt, wie es in verschiedenen Metazoenzellen und -geweben organisiert ist und funktioniert, fehlt weiterhin. Um dieses Manko zu beheben, sind spezifische Informationen über die Wechselwirkungen verschiedener Komponenten dieses Netzwerks, wie z.B. molekulare Chaperone, in bestimmten Geweben im Laufe der Entwicklung und Alterung erforderlich. Hier zeigten wir, wie die Verwendung von gewebespezifischen Störungen es uns ermöglichte, das Chaperonnetzwerk in eine...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

Wir danken dem Caenorhabditis Genetics Center, das vom NIH National Center for Research Resources (NCRR) finanziert wird, für einige der Nematodenstämme. Monoklonale Antikörper, die von H.F. Epstein entwickelt wurden, wurden aus der Developmental Studies Hybridoma Bank gewonnen, die unter der Schirmherrschaft des NICHD entwickelt und vom Department of Biology der University of Iowa gepflegt wurde. Diese Forschung wurde durch ein Stipendium der Israel Science Foundation (Stipendium Nr. 278/18) und durch ein Stipendium des israelischen Ministeriums für Wissenschaft und Technologie und des Ministeriums für auswärtige Angelegenheiten und internationale Zusammenarbeit, Generaldirektion für Länderförderung, Italienische Republik (Zuschuss Nr. 3-14337) unterstützt. Wir danken den Mitgliedern des Ben-Zvi-Labors für die Hilfe bei der Vorbereitung dieses Manuskripts.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
12-well-platesSPLBA3D16B
40 mm platesGreiner Bio-one627160
60 mm platesGreiner Bio-one628102
6-well platesThermo Scientific140675
96 well 2 mL 128.0/85mmGreiner Bio-one780278
AgarFormediumAGA03
AmpicillinFormedium69-52-3
bromophenol blueSigmaBO126-25G
CaCl2Merck1.02382.0500
CameraQimagingq30548
CholesterolAmresco0433-250G
ConfocalLeicaDM5500
Filter (0.22 µm)SigmaSCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscopeLeicaMZ165FC
GlycerolFrutarom2355519000024
IPTGFormedium367-93-1
KClMerck104936
KH2PO4Merck1.04873.1000
KOHBio-Lab001649029100
MgSO4Fisher22189-08-8Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibodyHybridoma Bank5-6
Na2HPO4·7H2OSigmas-0751
NaClBio-Lab001903029100
PeptoneMerck61930705001730
Plate pouring pumpIntegradoes it p920
RNAi Chaperone libraryNANA
SDSVWR Life Science0837-500
ß-mercaptoethanolBio world41300000-1
stereomicroscopeLeicaMZ6
TetracyclineDuchefa Biochemie64-75-5
TrisBio-Lab002009239100
Tween-20FisherBP337-500

Referenzen

  1. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
  2. Dubnikov, T., Ben-Gedalya, T., Cohen, E. Protein quality control in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (3), (2017).
  3. Bar-Lavan, Y., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Chaperone families and interactions in metazoa. Essays in Biochemistry. 60 (2), 237-253 (2016).
  4. Schopf, F. H., Biebl, M. M., Buchner, J. The HSP90 chaperone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 345-360 (2017).
  5. Carra, S., et al. The growing world of small heat shock proteins: from structure to functions. Cell Stress Chaperones. 22 (4), 601-611 (2017).
  6. Rosenzweig, R., Nillegoda, N. B., Mayer, M. P., Bukau, B. The Hsp70 chaperone network. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
  7. Gestaut, D., Limatola, A., Joachimiak, L., Frydman, J. The ATP-powered gymnastics of TRiC/CCT: an asymmetric protein folding machine with a symmetric origin story. Current Opinion in Structural Biology. 55, 50-58 (2019).
  8. Bett, J. S. Proteostasis regulation by the ubiquitin system. Essays in Biochemistry. 60 (2), 143-151 (2016).
  9. Jackson, M. P., Hewitt, E. W. Cellular proteostasis: degradation of misfolded proteins by lysosomes. Essays in Biochemistry. 60 (2), 173-180 (2016).
  10. Kettern, N., Dreiseidler, M., Tawo, R., Hohfeld, J. Chaperone-assisted degradation: multiple paths to destruction. Biological Chemistry. 391 (5), 481-489 (2010).
  11. Cuervo, A. M., Wong, E. Chaperone-mediated autophagy: roles in disease and aging. Cell Research. 24 (1), 92-104 (2014).
  12. Kevei, E., Pokrzywa, W., Hoppe, T. Repair or destruction-an intimate liaison between ubiquitin ligases and molecular chaperones in proteostasis. FEBS Letters. 591 (17), 2616-2635 (2017).
  13. O'Brien, D., van Oosten-Hawle, P. Regulation of cell-non-autonomous proteostasis in metazoans. Essays in Biochemistry. 60 (2), 133-142 (2016).
  14. Taipale, M., et al. Quantitative analysis of HSP90-client interactions reveals principles of substrate recognition. Cell. 150 (5), 987-1001 (2012).
  15. Taipale, M., et al. A quantitative chaperone interaction network reveals the architecture of cellular protein homeostasis pathways. Cell. 158 (2), 434-448 (2014).
  16. Baryshnikova, A., Costanzo, M., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Genetic interaction networks: toward an understanding of heritability. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 14, 111-133 (2013).
  17. Costanzo, M., et al. Global Genetic Networks and the Genotype-to-Phenotype Relationship. Cell. 177 (1), 85-100 (2019).
  18. Domingo, J., Baeza-Centurion, P., Lehner, B. The Causes and Consequences of Genetic Interactions (Epistasis). Annual Review of Genomics and Human Genetics. 20, 433-460 (2019).
  19. Jonikas, M. C., et al. Comprehensive characterization of genes required for protein folding in the endoplasmic reticulum. Science. 323 (5922), 1693-1697 (2009).
  20. Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123 (3), 507-519 (2005).
  21. Billi, A. C., Fischer, S. E., Kim, J. K. Endogenous RNAi pathways in C. elegans. WormBook. , 1-49 (2014).
  22. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  23. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  24. Lehner, B., Crombie, C., Tischler, J., Fortunato, A., Fraser, A. G. Systematic mapping of genetic interactions in Caenorhabditis elegans identifies common modifiers of diverse signaling pathways. Nature Genetics. 38 (8), 896-903 (2006).
  25. Frumkin, A., et al. Challenging muscle homeostasis uncovers novel chaperone interactions in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 21 (2014).
  26. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  27. Shpigel, N., Shemesh, N., Kishner, M., Ben-Zvi, A. Dietary restriction and gonadal signaling differentially regulate post-development quality control functions in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 18 (2), 12891 (2019).
  28. Shai, N., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Remodeling of proteostasis upon transition to adulthood is linked to reproduction onset. Current Genomics. 15 (2), 122-129 (2014).
  29. Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 104 (4), 619-647 (1983).
  30. Pokrzywa, W., Hoppe, T. Chaperoning myosin assembly in muscle formation and aging. Worm. 2 (3), 25644 (2013).
  31. Barral, J. M., Bauer, C. C., Ortiz, I., Epstein, H. F. Unc-45 mutations in Caenorhabditis elegans implicate a CRO1/She4p-like domain in myosin assembly. Journal of Cell Biology. 143 (5), 1215-1225 (1998).
  32. Venolia, L., Ao, W., Kim, S., Kim, C., Pilgrim, D. unc-45 gene of Caenorhabditis elegans encodes a muscle-specific tetratricopeptide repeat-containing protein. Cell Motility and the Cytoskeleton. 42 (3), 163-177 (1999).
  33. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  34. Etard, C., et al. The UCS factor Steif/Unc-45b interacts with the heat shock protein Hsp90a during myofibrillogenesis. Developmental Biology. 308 (1), 133-143 (2007).
  35. Wohlgemuth, S. L., Crawford, B. D., Pilgrim, D. B. The myosin co-chaperone UNC-45 is required for skeletal and cardiac muscle function in zebrafish. Developmental Biology. 303 (2), 483-492 (2007).
  36. Barral, J. M., Hutagalung, A. H., Brinker, A., Hartl, F. U., Epstein, H. F. Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science. 295 (5555), 669-671 (2002).
  37. Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
  38. Gaiser, A. M., Kaiser, C. J., Haslbeck, V., Richter, K. Downregulation of the Hsp90 system causes defects in muscle cells of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6 (9), 25485 (2011).
  39. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
  40. Bar-Lavan, Y., et al. A Differentiation Transcription Factor Establishes Muscle-Specific Proteostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 12 (12), 1006531 (2016).
  41. Qadota, H., et al. Establishment of a tissue-specific RNAi system in C. elegans. Gene. 400 (1-2), 166-173 (2007).
  42. Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS Genet. 9 (11), 1003921 (2013).
  43. Fisher, A. L. Of worms and women: sarcopenia and its role in disability and mortality. Journal of the American Geriatrics Society. 52 (7), 1185-1190 (2004).
  44. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  45. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  46. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  47. Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
  48. Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489 (7415), 263-268 (2012).
  49. Liu, G., Rogers, J., Murphy, C. T., Rongo, C. EGF signalling activates the ubiquitin proteasome system to modulate C. elegans lifespan. EMBO Journal. 30 (15), 2990-3003 (2011).
  50. Asikainen, S., Vartiainen, S., Lakso, M., Nass, R., Wong, G. Selective sensitivity of Caenorhabditis elegans neurons to RNA interference. Neuroreport. 16 (18), 1995-1999 (2005).
  51. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  52. Eremenko, E., Ben-Zvi, A., Morozova-Roche, L. A., Raveh, D. Aggregation of human S100A8 and S100A9 amyloidogenic proteins perturbs proteostasis in a yeast model. PLoS One. 8 (3), 58218 (2013).
  53. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  54. Yu, A., et al. Tau protein aggregates inhibit the protein-folding and vesicular trafficking arms of the cellular proteostasis network. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  55. Yu, A., et al. Protein aggregation can inhibit clathrin-mediated endocytosis by chaperone competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1481-1490 (2014).
  56. Parker-Thornburg, J., Bonner, J. J. Mutations that induce the heat shock response of Drosophila. Cell. 51 (5), 763-772 (1987).
  57. Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nature Reviews Genetics. 9 (7), 554-566 (2008).
  58. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
  59. Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
  60. Rohl, A., Rohrberg, J., Buchner, J. The chaperone Hsp90: changing partners for demanding clients. Trends in Biochemical Sciences. 38 (5), 253-262 (2013).

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