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Method Article
Para estudar as interações acompanhante-acompanhante e acompanhante-substrato, realizamos telas de interação sintética em elegans caenorhabditis usando interferência de RNA em combinação com mutações leves ou sobre-expressão de acompanhantes e monitorar disfunção proteica específica do tecido no nível do organismo.
A dobra correta e a montagem de proteínas e complexos proteicos são essenciais para a função celular. As células empregam vias de controle de qualidade que corrijam, sequestram ou eliminam proteínas danificadas para manter um proteome saudável, garantindo assim proteostase celular e prevenindo danos adicionais à proteína. Devido a funções redundantes dentro da rede de proteostase, a triagem de fenótipos detectáveis usando knockdown ou mutações em genes codificadores de acompanhantes no organismo multicelular Caenorhabditis elegans resulta na detecção de fenótipos menores ou não na maioria dos casos. Desenvolvemos uma estratégia de triagem direcionada para identificar acompanhantes necessários para uma função específica e, assim, preencher a lacuna entre fenótipo e função. Especificamente, monitoramos interações de acompanhantes novos usando telas de interação sintética RNAi, expressão de acompanhante, um acompanhante de cada vez, em animais carregando uma mutação em um gene codificante de acompanhantes ou expressando demais um acompanhante de interesse. Ao interromper dois acompanhantes que individualmente não apresentam fenótipo bruto, podemos identificar acompanhantes que agravam ou expõem um fenótipo específico quando ambos perturbados. Demonstramos que essa abordagem pode identificar conjuntos específicos de acompanhantes que funcionam juntos para modular a dobra de um complexo de proteínas ou proteínas associados a um determinado fenótipo.
As células lidam com danos proteicos empregando máquinas de controle de qualidade que reparam, sequeram ou removem quaisquer proteínas danificadas1,2. O dobrável e a montagem de complexos proteicos são suportados por acompanhantes moleculares, um grupo diversificado de proteínas altamente conservadas que podem reparar ou sequestrar proteínas danificadas3,4,5,6,7. A remoção de proteínas danificadas é mediada pelo sistema ubiquitina-proteasome (UPS)8 ou pelo maquinário de autofagia9 em colaboração com acompanhantes10,11,12. A homeostase proteica (proteostase) é, portanto, mantida por redes de controle de qualidade compostas por máquinas dobráveis e degradantes3,13. No entanto, entender as interações entre os diversos componentes da rede de proteostasis in vivo é um grande desafio. Enquanto as telas de interação proteína-proteína contribuem com informações importantes sobre interações físicas e complexos de acompanhantes14,15, falta compreender a organização e mecanismos compensatórios dentro de redes de acompanhantes específicas do tecido in vivo.
As interações genéticas são frequentemente usadas como uma ferramenta poderosa para examinar a relação entre pares de genes que estão envolvidos em vias biológicas comuns ou compensatórias16,17,18. Tais relações podem ser medidas combinando pares de mutações e quantificando o impacto de uma mutação em um gene sobre a gravidade fenotípica causada por uma mutação no segundo gene16. Embora a maioria dessas combinações não demonstre efeito em termos de fenótipo, algumas interações genéticas podem agravar ou aliviar a gravidade do fenótipo medido. Mutações agravantes são observadas quando o fenótipo do mutante de dupla exclusão é mais grave do que o fenótipo esperado visto ao combinar os mutantes de exclusão única, implicando que os dois genes funcionam em caminhos paralelos, afetando juntos uma determinada função. Em contraste, mutações aliviadas são observadas quando o fenótipo do mutante de dupla exclusão é menos grave do que o fenótipo visto com os mutantes de exclusão única, implicando que os dois genes agem juntos como um complexo ou participam da mesma via16,18. Assim, diversos fenótipos que podem ser quantificados, incluindo fenótipos amplos, como letalidade, taxas de crescimento e tamanho de ninhadas, bem como fenótipos específicos, como repórteres transcricionais, têm sido usados para identificar interações genéticas. Por exemplo, Jonikas et al. contaram com um repórter de estresse do PS para examinar as interações do Saccharomyces cerevisiae ER desdobrado rede de proteostase de resposta à proteína usando análises de exclusão genética de pairwise19.
As telas de interação genética envolvem cruzar sistematicamente mutações de exclusão pares para gerar um conjunto abrangente de mutantes duplos20. No entanto, em modelos animais, e especificamente em C. elegans,essa abordagem em larga escala não é viável. Em vez disso, cepas mutantes podem ser testadas para seus padrões de interação genética através da expressão genética de baixa regulação usando a interferência de RNA (RNAi)21. C. elegans é um poderoso sistema para telas baseados em RNAi22,23. Em C. elegans,a entrega de RNA (dsRNA) de duplar encalha é alcançada pela alimentação bacteriana, levando à disseminação de moléculas de dsRNA para numerosos tecidos. Dessa forma, as moléculas de dsRNA introduzidas impactam o animal através de um procedimento rápido e simples21. Uma tela de interação genética usando RNAi pode, portanto, revelar o impacto da regulação de um conjunto de genes ou da maioria dos genes codificadores C. elegans usando bibliotecas RNAi24. Em tal tela, hits que impactam o comportamento do mutante de interesse, mas não a cepa do tipo selvagem são modificadores potenciais do fenótipo sendomonitorados 25. Aqui, aplicamos uma combinação de mutações e triagem RNAi para mapear sistematicamente interações de acompanhantes específicas de tecidos em C. elegans.
1. Preparação de placas de mídia de crescimento de nematoide para RNAi
2. Cultivar bactérias RNAi e semear as placas
3. Sincronização não estressante de embriões
4. Ensaios fenotípicos comuns
5. Validação do knockdown de proteínas
Usando mutações sensíveis à temperatura no UNC-45 para testar para agravar ou aliviar interações em condições permissivas ou restritivas, respectivamente
A montagem e manutenção muscular oferecem um sistema eficaz para estudar interações de acompanhantes específicas do tecido. A unidade funcional de músculos contratuais, o sarcomere, apresenta um arranjo cristalino de proteínas estruturais e regulatórias. A estabilidade da miose da proteína motora e sua incorporação nos filamentos e...
Uma imagem integrada da rede de proteostase refletindo como ela é organizada e funciona em diferentes células metazoanas e tecidos permanece em falta. Para supridamente essa deficiência, são necessárias informações específicas sobre as interações de diversos componentes dessa rede, como acompanhantes moleculares, em tecidos específicos durante o desenvolvimento e envelhecimento. Aqui, mostramos como o uso de perturbações específicas do tecido nos permitiu examinar a rede de acompanhantes em um determinado t...
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecemos ao Centro de Genética de Caenorhabditis, financiado pelo Nih National Center for Research Resources (NCRR), por algumas das cepas de nematoides. Anticorpos monoclonais desenvolvidos por H.F. Epstein foram obtidos do Banco hybridoma de estudos de desenvolvimento desenvolvido sob os auspícios do NICHD e mantido pelo Departamento de Biologia da Universidade de Iowa. Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa da Fundação de Ciência de Israel (bolsa nº 278/18) e por uma bolsa do Ministério da Ciência & Tecnologia de Israel, e do Ministério das Relações Exteriores e Cooperação Internacional, Direção Geral de Promoção de Países, República Italiana (bolsa nº 3-14337). Agradecemos aos membros do laboratório Ben-Zvi pela ajuda na preparação deste manuscrito.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
12-well-plates | SPL | BA3D16B | |
40 mm plates | Greiner Bio-one | 627160 | |
60 mm plates | Greiner Bio-one | 628102 | |
6-well plates | Thermo Scientific | 140675 | |
96 well 2 mL 128.0/85mm | Greiner Bio-one | 780278 | |
Agar | Formedium | AGA03 | |
Ampicillin | Formedium | 69-52-3 | |
bromophenol blue | Sigma | BO126-25G | |
CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | |
Camera | Qimaging | q30548 | |
Cholesterol | Amresco | 0433-250G | |
Confocal | Leica | DM5500 | |
Filter (0.22 µm) | Sigma | SCGPUO2RE | |
Fluorescent stereomicroscope | Leica | MZ165FC | |
Glycerol | Frutarom | 2355519000024 | |
IPTG | Formedium | 367-93-1 | |
KCl | Merck | 104936 | |
KH2PO4 | Merck | 1.04873.1000 | |
KOH | Bio-Lab | 001649029100 | |
MgSO4 | Fisher | 22189-08-8 | Gift from the Morimoto laboratory |
Myosin MHC A (MYO-3) antibody | Hybridoma Bank | 5-6 | |
Na2HPO4·7H2O | Sigma | s-0751 | |
NaCl | Bio-Lab | 001903029100 | |
Peptone | Merck | 61930705001730 | |
Plate pouring pump | Integra | does it p920 | |
RNAi Chaperone library | NA | NA | |
SDS | VWR Life Science | 0837-500 | |
ß-mercaptoethanol | Bio world | 41300000-1 | |
stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
Tetracycline | Duchefa Biochemie | 64-75-5 | |
Tris | Bio-Lab | 002009239100 | |
Tween-20 | Fisher | BP337-500 |
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