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Resumo

Para estudar as interações acompanhante-acompanhante e acompanhante-substrato, realizamos telas de interação sintética em elegans caenorhabditis usando interferência de RNA em combinação com mutações leves ou sobre-expressão de acompanhantes e monitorar disfunção proteica específica do tecido no nível do organismo.

Resumo

A dobra correta e a montagem de proteínas e complexos proteicos são essenciais para a função celular. As células empregam vias de controle de qualidade que corrijam, sequestram ou eliminam proteínas danificadas para manter um proteome saudável, garantindo assim proteostase celular e prevenindo danos adicionais à proteína. Devido a funções redundantes dentro da rede de proteostase, a triagem de fenótipos detectáveis usando knockdown ou mutações em genes codificadores de acompanhantes no organismo multicelular Caenorhabditis elegans resulta na detecção de fenótipos menores ou não na maioria dos casos. Desenvolvemos uma estratégia de triagem direcionada para identificar acompanhantes necessários para uma função específica e, assim, preencher a lacuna entre fenótipo e função. Especificamente, monitoramos interações de acompanhantes novos usando telas de interação sintética RNAi, expressão de acompanhante, um acompanhante de cada vez, em animais carregando uma mutação em um gene codificante de acompanhantes ou expressando demais um acompanhante de interesse. Ao interromper dois acompanhantes que individualmente não apresentam fenótipo bruto, podemos identificar acompanhantes que agravam ou expõem um fenótipo específico quando ambos perturbados. Demonstramos que essa abordagem pode identificar conjuntos específicos de acompanhantes que funcionam juntos para modular a dobra de um complexo de proteínas ou proteínas associados a um determinado fenótipo.

Introdução

As células lidam com danos proteicos empregando máquinas de controle de qualidade que reparam, sequeram ou removem quaisquer proteínas danificadas1,2. O dobrável e a montagem de complexos proteicos são suportados por acompanhantes moleculares, um grupo diversificado de proteínas altamente conservadas que podem reparar ou sequestrar proteínas danificadas3,4,5,6,7. A remoção de proteínas danificadas é mediada pelo sistema ubiquitina-proteasome (UPS)8 ou pelo maquinário de autofagia9 em colaboração com acompanhantes10,11,12. A homeostase proteica (proteostase) é, portanto, mantida por redes de controle de qualidade compostas por máquinas dobráveis e degradantes3,13. No entanto, entender as interações entre os diversos componentes da rede de proteostasis in vivo é um grande desafio. Enquanto as telas de interação proteína-proteína contribuem com informações importantes sobre interações físicas e complexos de acompanhantes14,15, falta compreender a organização e mecanismos compensatórios dentro de redes de acompanhantes específicas do tecido in vivo.

As interações genéticas são frequentemente usadas como uma ferramenta poderosa para examinar a relação entre pares de genes que estão envolvidos em vias biológicas comuns ou compensatórias16,17,18. Tais relações podem ser medidas combinando pares de mutações e quantificando o impacto de uma mutação em um gene sobre a gravidade fenotípica causada por uma mutação no segundo gene16. Embora a maioria dessas combinações não demonstre efeito em termos de fenótipo, algumas interações genéticas podem agravar ou aliviar a gravidade do fenótipo medido. Mutações agravantes são observadas quando o fenótipo do mutante de dupla exclusão é mais grave do que o fenótipo esperado visto ao combinar os mutantes de exclusão única, implicando que os dois genes funcionam em caminhos paralelos, afetando juntos uma determinada função. Em contraste, mutações aliviadas são observadas quando o fenótipo do mutante de dupla exclusão é menos grave do que o fenótipo visto com os mutantes de exclusão única, implicando que os dois genes agem juntos como um complexo ou participam da mesma via16,18. Assim, diversos fenótipos que podem ser quantificados, incluindo fenótipos amplos, como letalidade, taxas de crescimento e tamanho de ninhadas, bem como fenótipos específicos, como repórteres transcricionais, têm sido usados para identificar interações genéticas. Por exemplo, Jonikas et al. contaram com um repórter de estresse do PS para examinar as interações do Saccharomyces cerevisiae ER desdobrado rede de proteostase de resposta à proteína usando análises de exclusão genética de pairwise19.

As telas de interação genética envolvem cruzar sistematicamente mutações de exclusão pares para gerar um conjunto abrangente de mutantes duplos20. No entanto, em modelos animais, e especificamente em C. elegans,essa abordagem em larga escala não é viável. Em vez disso, cepas mutantes podem ser testadas para seus padrões de interação genética através da expressão genética de baixa regulação usando a interferência de RNA (RNAi)21. C. elegans é um poderoso sistema para telas baseados em RNAi22,23. Em C. elegans,a entrega de RNA (dsRNA) de duplar encalha é alcançada pela alimentação bacteriana, levando à disseminação de moléculas de dsRNA para numerosos tecidos. Dessa forma, as moléculas de dsRNA introduzidas impactam o animal através de um procedimento rápido e simples21. Uma tela de interação genética usando RNAi pode, portanto, revelar o impacto da regulação de um conjunto de genes ou da maioria dos genes codificadores C. elegans usando bibliotecas RNAi24. Em tal tela, hits que impactam o comportamento do mutante de interesse, mas não a cepa do tipo selvagem são modificadores potenciais do fenótipo sendomonitorados 25. Aqui, aplicamos uma combinação de mutações e triagem RNAi para mapear sistematicamente interações de acompanhantes específicas de tecidos em C. elegans.

Protocolo

1. Preparação de placas de mídia de crescimento de nematoide para RNAi

  1. A uma garrafa de 1 L, adicione 3 g de NaCl, 2,5 g de Bacto-Peptone, 17 g de ágar e água destilada até 1 L e autoclave.
  2. Frie a 55 °C.
  3. Adicione 25 mL de 1 M KH2PO4, pH 6.0, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4e 1 mL de solução decolesterol (Tabela 1) para fazer mídia de crescimento nematode (NGM).
  4. Adicione 1 mL de ampicilina (100 mg/mL) e 0,5 mL de 1 M IPTG(Tabela 1) para fazer a solução NGM-RNAi.
    NOTA: As bactérias HT115(DE3) E. coli comumente utilizadas contêm uma polimerase de DNA T7 indutível pelo IPTG usada para expressar os plasmídeos codificadores de dsRNA. Estes plasmídeos também codificam para resistência à ampicilina.
  5. Misture a solução quente girando a garrafa.
  6. No capô ou usando procedimentos estéreis, despeje a solução NGM em placas ou usando uma bomba peristáltica, dispense a solução em placas. Use placas de 6 poços, 12, 40 mm ou 60 mm para esta tela. O ágar deve encher cerca de 2/3 da profundidade da placa.
  7. Deixe as placas secarem durante a noite no banco em temperatura ambiente, mantendo as placas cobertas. As placas de NGM para RNAi podem ser armazenadas a 4 °C por até um mês.

2. Cultivar bactérias RNAi e semear as placas

  1. No capô ou utilizando procedimentos estéreis, adicione 1 mL de ampicillina (100 mg/mL) e 2,5 mL de tetraciclina (5 mg/mL)(Tabela 1) a uma solução e mistura pré-autoclaved 1 L de LB.
    NOTA: As bactérias HT115(DE3) E. coli são resistentes à tetraciclina.
  2. No capô ou usando procedimentos estéreis, adicione 600 μL de solução LB a cada poço em placas estéreis de 2 mL de profundidade. É melhor usar um pipet multicanal para dispensar a mídia.
  3. Usando procedimentos estéreis, inoculam poços com bactérias HT115(DE3) E. coli transformadas com um plasmídeo codificador de dsRNA visando um gene de interesse ou um plasmídeo vazio, como controle. Cubra as placas e incubar a 37 °C durante a noite. Bibliotecas que consistem em clones bacterianos expressando dsRNA, correspondendo a ~94% dos genes C. elegans previstos foram previamente construídos22,23 e estão comercialmente disponíveis. A biblioteca de acompanhantes utilizada aqui foi construída pelo Laboratório Dr. Richard Morimoto26.
  4. Utilizando procedimentos estéreis, sementes 75, 150 ou 250 μL de bactérias nas placas de 12 poços, 40 mm e 6-well ou 60 mm NGM RNAi, respectivamente. Marque claramente o nome do gene alvo na placa. As bactérias devem cobrir 30-50% da superfície do ágar e não devem tocar nas bordas da placa.
  5. Deixe as placas secarem por pelo menos 2 dias no banco à temperatura ambiente, mantendo as placas cobertas.
    NOTA: As placas podem ser incubadas a 37 °C durante a noite. Certifique-se de que os poços internos estão secos antes de usar ou armazenar as placas. Para todos os fins de longo prazo (ou seja, secagem ou armazenamento) mantenha as placas no escuro. As placas secas e semeadas podem ser armazenadas a 4 °C por até um mês.

3. Sincronização não estressante de embriões

  1. Use uma picareta de vermes para mover cerca de 100 ovos de uma placa de vermes não sincronizada para uma placa de NGM recém-semeada.
  2. Cultivar animais por 5 dias a 15 °C, 3,5 dias a 20 °C ou 2,5 dias a 25 °C. Os animais devem chegar ao primeiro dia de colocação de ovos.
    NOTA: Os vermes são comumente cultivados a 20 °C. No entanto, diferentes cepas mutantes de acompanhantes podem exigir temperaturas específicas de cultivo. Por exemplo, muitas cepas sensíveis à temperatura são cultivadas a 15 °C, mas deslocadas para 25 °C para expor seu fenótipo.
  3. Adicione 1 mL de tampão M9(Tabela 1)lentamente e longe do gramado bacteriano. Gire a placa para que o tampão cubra completamente a placa. Em seguida, incline-o para um lado e remova o líquido da placa e lave os animais da placa.
    NOTA: Ao usar animais sensíveis à temperatura ou a acompanhante de mutantes, é melhor manter os tampões usados no protocolo na temperatura de cultivo dos animais.
  4. Repita o passo 3.3 três vezes ou até que todos os animais sejam lavados fora da placa.
  5. Usando uma ponta de plástico padrão, corte um quadrado de ágar da placa lavada onde os ovos estão concentrados e coloque o pedaço de ágar em uma placa de NGM recém-semeada.
    NOTA: ~200 ovos são necessários para produzir animais suficientes que pomentem ovos; muitos animais consomem as bactérias muito rapidamente. Baixos níveis de alimentos podem impactar a proteostase27.
  6. Cultive os animais por 5 dias a 15 °C, 3,5 dias a 20 °C ou 2,5 dias a 25 °C. Neste ponto, as placas devem ser cobertas com ovos sincronizados.
    NOTA: Os animais podem ser deslocados para uma nova placa por uma curta duração para uma sincronização mais rigorosa. No entanto, é importante usar apenas adultos nos estágios iniciais da colocação de ovos, pois os animais podem reter ovos em seu útero impactando a sincronização.
  7. Adicione 1 mL de tampão M9 lentamente e longe do gramado bacteriano.
  8. Gire a placa para que o tampão cubra completamente a placa. Em seguida, incline-o para um lado e remova o líquido da placa e lave os animais da placa.
  9. Repita o passo 3,7 três vezes ou até que todos os animais sejam lavados fora da placa.
  10. Adicione 1 mL de tampão M9 e use um raspador de células para liberar os ovos da placa.
  11. Colete o tampão M9 contendo os ovos das placas.
  12. Centrifugar o tampão M9 contendo os ovos a 3.000 x g por 2 min.
  13. Remova o supernatante e adicione o tampão M9 para atingir um volume de 1 mL.
  14. Resuspenda os ovos para interromper quaisquer pedaços de ovos e bactérias.
  15. Repita o procedimento de lavagem descrito nas etapas 3.11-3.13 cinco vezes. A pelota de ovo deve parecer branca. Se ainda estiver amarelo/marrom, repita a lavagem até que uma pelota branca seja atingida.
    NOTA: Bactérias que permanecem nos ovos podem contaminar as bactérias que expressam dsRNA.
  16. Remova a maior parte do supernatante, deixando cerca de 200 μL. Ovos sincronizados podem ser usados para telas RNAi.

4. Ensaios fenotípicos comuns

  1. Cultivo de animais durante experimentos
    1. Coloque uma gota de ~30 ovos perto do gramado bacteriano em cada prato semeado rnai. Para referência, coloque também ~30 ovos em placas semeadas com bactérias contendo vetores vazios (L4440).
    2. Cultivar animais sincronizados com a idade em placas semeadas por NGM RNAi. A duração do experimento dependerá do estágio em que os animais devem ser monitorados e da temperatura do cultivo. Ajuste a temperatura do cultivo ao usar animais mutantes sensíveis à temperatura. Ajuste a duração do cultivo ao usar animais mutantes atrasados em desenvolvimento.
      NOTA: Embora o tempo possa variar, uma vez que os animais atingem a idade adulta, a colocação de ovos (e o consequente consumo rápido de alimentos), bem como o colapso da proteose dependente da idade28,podem impactar os resultados. Recomenda-se, portanto, pontuar animais antes do início da colocação de ovos (dia 1 da idade adulta). Animais do tipo selvagem chegam a esta fase após 4,5 dias a 15 °C, 3 dias a 20 °C ou 2 dias a 25 °C.
    3. O número de repetições utilizadas dependerá do tamanho do conjunto genético examinado. Para a biblioteca de acompanhantes (97 genes), repita experimentos pelo menos quatro vezes. O tamanho da população depende do ensaio utilizado. Nos ensaios comportamentais aqui discutidos, escore >15 animais por condição experimental em cada repetição. Os dados e análises estatísticas também dependem fortemente do tipo de ensaio utilizado. Os dados nos ensaios aqui discutidos podem ser apresentados como meios ± SEM.
    4. Compare os animais tratados com controle de vetores RNAi e vazios como populações independentes. Os valores P podem ser calculados utilizando-se ANOVA unidirecional ou bidirecional, dependendo das alterações examinadas, ou seja, agravando ou aliviando sozinho ou ambos. Ao examinar um único tratamento RNAi versus controle, os valores P podem ser calculados usando um teste de soma de classificação mann-whitney de uma forma ou de duas vias. Além da significância estatística, considere um limiar para acertos com base no grau de impacto no fenótipo.
  2. Prisão/atraso do desenvolvimento
    1. Cultivar animais sincronizados pela idade como na etapa 4.1 até que os animais cultivados em bactérias de controle contendo vetores vazios cheguem à idade adulta, mas antes do início da colocação dos ovos.
    2. Monitore animais usando um estereótipo e conte o número de larvas e adultos para pontuar a porcentagem de animais atrasados no desenvolvimento. Para referência, compare-se aos animais mutantes cultivados em bactérias de controle contendo vetores vazios. hsp-1 ou hsp-90 RNAi tratamento resulta em detenção de desenvolvimento de animais do tipo selvagem e pode ser usado como um controle positivo.
    3. Para pontuar o percentual de animais atrasados ao longo do tempo, repita a etapa 4.2.2.
      NOTA: Se houver adultos que poem ovos na placa, transfira os animais atrasados em desenvolvimento para uma nova placa NGM-RNAi rotulada para o mesmo gene alvo para evitar confusão com prole.
  3. Defeitos de esterilidade ou de colocação de ovos
    1. Cultivar animais sincronizados com a idade como na etapa 4.1 até que animais cultivados em bactérias vazias de controle de vetores comecem a colocar ovos.
    2. Monitore os animais usando um estereómico e marque a porcentagem de animais sem ovos visíveis em seu útero. Para referência, compare-se aos animais mutantes cultivados em bactérias vazias de controle de vetores.
    3. Alternativamente, monitore os animais usando um estereómico e marque a porcentagem de animais com útero cheio de ovos, definido como fenótipo defeituoso de EGg (Egl-d)29.
  4. Letalidade embrionária
    1. Cultivar animais sincronizados com a idade como na etapa 4.1 até que os animais comecem a colocar ovos.
    2. Transfira ~100 ovos para um prato vazio. Espalhe os ovos em fileiras para simplificar a contagem.
    3. Marque a porcentagem de ovos não esquecidos na placa após 24-48 horas. Para referência, compare-se aos ovos de animais tratados com bactérias vazias de controle de vetores.
  5. Ensaio de paralisia
    1. Para adultos do primeiro dia, cultivar animais sincronizados com a idade como na etapa 4.1 até que os animais cultivados em bactérias vazias de controle de vetores cheguem à idade adulta, mas antes do início da colocação dos ovos.
    2. Desenhe uma linha na parte de trás de uma placa de ágar NGM regular usando um marcador fino.
    3. Coloque 5-10 animais na linha marcada.
    4. Estabeleça um temporizador e espere por 10 minutos.
    5. Marque a porcentagem de animais que permanecem na linha como vermes paralisados. Para referência, compare-se aos animais mutantes cultivados em bactérias vazias de controle de vetores. Animais do tipo selvagem tratados com unc-45 RNAi apresentam fenótipo de paralisia grave e podem ser usados como controle positivo.
      NOTA: Este ensaio destaca animais com paralisia média a grave. Esses animais geralmente ficam retos na placa, em vez de apresentar a forma curva comum. Além disso, um remendo limpo de bactérias é visível ao redor das cabeças de vermes paralisados.
  6. Ensaio de espancamento
    1. Cultivar animais sincronizados pela idade como na etapa 4.1 até que os animais cultivados em bactérias vazias de controle de vetores cheguem à idade adulta, mas antes do início da colocação de ovos.
    2. Pipet 100 μL de tampão M9 na temperatura de cultivo dos animais em uma placa de 96 poços.
    3. Coloque ~15 worms, um por poço, nos poços contendo tampão M9.
    4. Deixe os animais se ajustarem por 5 minutos.
    5. Examine cada animal sob o estereótipo, inicie um temporizador contando 15 s, e conte o número de curvas corporais que cada animal realiza nesse período de tempo. Os valores contados podem ser normalizados para dobras corporais por minuto. Para referência, compare-se aos animais mutantes cultivados em bactérias vazias de controle de vetores.
      NOTA: Este ensaio de motilidade é muito sensível e pode detectar diferenças muito leves entre os tratamentos. No entanto, a motilidade em líquido e motilidade no ágar pode diferir.

5. Validação do knockdown de proteínas

  1. Coloque 250-300 ovos sincronizados em uma placa NGM-RNAi de 60 mm semeada com as bactérias relevantes que expressam dsRNA ou esvaziam as bactérias contendo vetores (L4440).
    NOTA: O knockdown rnai pode resultar em acúmulo aberrante de embriões, na falta de embriões ou em prisão de desenvolvimento que poderia impactar a expressão genética. Isso deve ser considerado ao determinar a idade dos animais a serem examinados.
  2. Para o dia 1 adultos, cultivar animais por 4,5 dias a 15 °C, 3 dias a 20 °C ou 2 dias a 25 °C.
  3. Escolha e transfira um total de 200 animais adultos jovens para a tampa de um tubo de 1,5 mL com 200 μL de PBS-T.
    NOTA: Ao usar animais sensíveis à temperatura ou a acompanhante de mutantes, é melhor manter os tampões usados no protocolo na temperatura de cultivo dos animais.
  4. Feche a tampa cuidadosamente e centrífuga a 1.000 x g por 1 min.
  5. Adicione 800 μL de PBS-T (Tabela 1) e centrífuga a 1.000 x g por 1 min.
  6. Remova cuidadosamente a parte superior de 900 μL.
  7. Repita as etapas 5.4-5.6 três vezes.
  8. Remova 900 μL, deixando 100 μL de solução contendo os 200 worms.
  9. Adicione 25 μL de tampão de amostra de 5x(Tabela 1).
  10. Aqueça as amostras por 10 min a 92°C enquanto treme a 1000 rpm. As amostras podem então ser congeladas e mantidas a -20 °C.
  11. Carregue 20 μL de cada amostra e execute em um gel SDS-PAGE.
  12. Realize a análise de manchas ocidentais usando anticorpos apropriados para determinar a estabilidade relativa da proteína.
  13. Determine a intensidade das bandas usando software densitométrico, como o módulo de gel ImageJ livremente disponível. Normalize todos os valores para aqueles medidos na amostra de controle(s).
    NOTA: O objetivo do knockdown RNAi em nossas telas é diminuir os níveis proteicos de um acompanhante/co-acompanhante específico. Assim, a melhor maneira de avaliar a eficiência do knockdown rnai é pela análise de manchas ocidentais. Isso requer anticorpos específicos. Alternativamente, o qPCR pode ser usado para quantificar os níveis de mRNA.

Resultados

Usando mutações sensíveis à temperatura no UNC-45 para testar para agravar ou aliviar interações em condições permissivas ou restritivas, respectivamente
A montagem e manutenção muscular oferecem um sistema eficaz para estudar interações de acompanhantes específicas do tecido. A unidade funcional de músculos contratuais, o sarcomere, apresenta um arranjo cristalino de proteínas estruturais e regulatórias. A estabilidade da miose da proteína motora e sua incorporação nos filamentos e...

Discussão

Uma imagem integrada da rede de proteostase refletindo como ela é organizada e funciona em diferentes células metazoanas e tecidos permanece em falta. Para supridamente essa deficiência, são necessárias informações específicas sobre as interações de diversos componentes dessa rede, como acompanhantes moleculares, em tecidos específicos durante o desenvolvimento e envelhecimento. Aqui, mostramos como o uso de perturbações específicas do tecido nos permitiu examinar a rede de acompanhantes em um determinado t...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Centro de Genética de Caenorhabditis, financiado pelo Nih National Center for Research Resources (NCRR), por algumas das cepas de nematoides. Anticorpos monoclonais desenvolvidos por H.F. Epstein foram obtidos do Banco hybridoma de estudos de desenvolvimento desenvolvido sob os auspícios do NICHD e mantido pelo Departamento de Biologia da Universidade de Iowa. Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa da Fundação de Ciência de Israel (bolsa nº 278/18) e por uma bolsa do Ministério da Ciência & Tecnologia de Israel, e do Ministério das Relações Exteriores e Cooperação Internacional, Direção Geral de Promoção de Países, República Italiana (bolsa nº 3-14337). Agradecemos aos membros do laboratório Ben-Zvi pela ajuda na preparação deste manuscrito.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
12-well-platesSPLBA3D16B
40 mm platesGreiner Bio-one627160
60 mm platesGreiner Bio-one628102
6-well platesThermo Scientific140675
96 well 2 mL 128.0/85mmGreiner Bio-one780278
AgarFormediumAGA03
AmpicillinFormedium69-52-3
bromophenol blueSigmaBO126-25G
CaCl2Merck1.02382.0500
CameraQimagingq30548
CholesterolAmresco0433-250G
ConfocalLeicaDM5500
Filter (0.22 µm)SigmaSCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscopeLeicaMZ165FC
GlycerolFrutarom2355519000024
IPTGFormedium367-93-1
KClMerck104936
KH2PO4Merck1.04873.1000
KOHBio-Lab001649029100
MgSO4Fisher22189-08-8Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibodyHybridoma Bank5-6
Na2HPO4·7H2OSigmas-0751
NaClBio-Lab001903029100
PeptoneMerck61930705001730
Plate pouring pumpIntegradoes it p920
RNAi Chaperone libraryNANA
SDSVWR Life Science0837-500
ß-mercaptoethanolBio world41300000-1
stereomicroscopeLeicaMZ6
TetracyclineDuchefa Biochemie64-75-5
TrisBio-Lab002009239100
Tween-20FisherBP337-500

Referências

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