使用 卡诺哈布迪炎埃莱甘斯 筛选组织特异性查佩龙相互作用

摘要

为了研究伴奏和伴奏基底相互作用，我们使用RNA干扰与轻度突变或伴郎过度表达相结合，在有机体水平上监测组织特异性蛋白质功能障碍，在 卡诺哈布德炎中 执行合成相互作用屏幕。

摘要

蛋白质和蛋白质复合物的正确折叠和组装对细胞功能至关重要。细胞采用质量控制途径，纠正、封存或消除受损蛋白质，以维持健康的蛋白质组，从而确保细胞蛋白石和防止进一步的蛋白质损伤。由于蛋白酶网络中的多余功能，使用多细胞生物 体Caenorhabdd炎的 伴随编码基因的敲击或突变来筛选可检测表型，在大多数情况下，可检测到小或无表型。我们制定了有针对性的筛选策略，以确定特定功能所需的陪护人员，从而弥合表型和功能之间的差距。具体来说，我们使用RNAi合成交互屏幕监测新的伴郎互动，敲击伴郎表情，一次一个伴郎，在携带伴郎编码基因突变或过度表达兴趣伴郎的动物中。通过破坏两个单独呈现无严重表型的陪护，我们可以识别在两者都扰动时加重或暴露特定表型的陪护。我们证明，这种方法可以识别出特定的伴郎组合，这些伴郎可以协同工作，调节与给定表型相关的蛋白质或蛋白质复合物的折叠。

引言

细胞通过使用质量控制机器来修复、封存或去除任何受损的蛋白质^1，2来应对蛋白质的损害。蛋白质复合物的折叠和组装由分子伴奏支持，这是一组高度保存的蛋白质，可以修复或封存受损的蛋白质3，4，5，6，7。去除受损蛋白质由无处不在的蛋白系统（UPS）8或自噬机械⁹与伴奏^10，11，12合作进行调解。因此，蛋白质平衡（蛋白石）是由折叠和降解机^3，13组成的质量控制网络维持的。然而，了解体内蛋白石网络各组成部分之间的相互作用是一项重大挑战。虽然蛋白质-蛋白质相互作用屏幕有助于提供关于物理相互作用和伴郎复合物的重要信息14，15，了解组织特定的伴郎网络在体内的组织和补偿机制是缺乏的。

基因相互作用经常被用作一种强大的工具，用来研究参与共同或补偿性生物通路^16、17、18的基因对之间的关系。这种关系可以通过结合一对突变和量化一个基因突变对第二个基因¹⁶突变引起的表型严重性的影响来测量。虽然大多数此类组合在表型方面没有表现出任何效果，但某些遗传相互作用可能加剧或减轻所测量表型的严重程度。当双删除突变体的表型比组合单个删除突变体时看到的预期表型更严重时，观察到加重突变，这意味着两个基因在平行通路中工作，共同影响给定函数。相比之下，当双删除突变体的表型不如单个删除突变体中出现的表型严重时，则观察到缓解突变，这意味着两个基因作为一个复合体协同作用或参与同一通路^16、18。因此，可以量化的多种表型，包括广泛的表型，如致命性、生长率和育雏大小，以及特定表型（如转录记者）已用于识别遗传相互作用。例如，Jonikas等人依靠ER应激记者使用配对基因删除分析¹⁹来检查糖核酸细胞ER展开蛋白反应蛋白体网络的相互作用。

基因相互作用屏幕涉及系统地交叉配对删除突变，以产生一套全面的双突变^体20。然而，在动物模型中，特别是在C.elegans中，这种大规模的方法是不可行的。相反，突变菌株可以通过使用RNA干扰（RNAi）21对基因表达进行向下调节来测试其遗传相互作用模式。C. elegans是一个强大的系统，基于 RNAi^22，23屏幕。在C.elegans中，双链RNA（dsRNA）的传递是通过细菌喂养实现的，导致dsRNA分子扩散到许多组织。通过这种方式，引入的dsRNA分子通过快速和简单的程序²¹影响动物。因此，使用RNAi的基因相互作用屏幕可以揭示使用RNAi库²⁴对一组基因或大多数C.elegans编码基因进行下调节的影响。在这样的屏幕上，影响感兴趣的突变体的行为，但不是野生类型菌株的命中是被监测的表型的潜在修饰剂^25。在这里，我们应用突变和RNAi筛选的组合，系统地绘制C.elegans组织特异性伴郎相互作用的地图。

研究方案

1. 为 RNAi 准备线虫生长介质板

1. 在 1 L 瓶中，加入 3 克 NaCl、2.5 克巴克托-佩普顿、17 克醋和蒸馏水至 1 L 和高压灭菌液。
2. 冷瓶至 55 °C。
3. 加入 25 mL 的 1 M KH₂PO₄、 pH 6.0、 1 mL 的 1 M CaCl₂、 1 mL 的 1 M MgSO₄和 1 mL 的胆固醇溶液 （表 1）来制作线虫生长介质 （NGM）。
4. 加入1 mL的安培素（100毫克/毫升）和0.5兆升的1M IPTG（表1），使NGM-RNAi解决方案。
   注:常用的HT115（DE3） 大肠杆菌 含有一种IPTG诱导T7DNA聚合酶，用于表达dsRNA编码质粒。这些质粒还编码的安非他林抵抗。
5. 通过旋转瓶子混合温液。
6. 在发动机罩或使用无菌程序时，将 NGM 溶液倒入板中或使用渗透泵，将溶液分配到板中。使用 6 井、12 井、40 毫米或 60 mm 板来此屏幕。阿加应该填补约2/3的板深度。
7. 让盘子在室温下在长凳上干燥过夜，保持板材覆盖。RNAi 的 NGM 板可在 4 °C 下存储长达一个月。

2. 种植RNAi细菌和播种板

1. 在发动机罩或使用无菌程序时，将 1 mL 的氨基蛋白（100 毫克/毫升）和 2.5 mL 的四环素（5 毫克/毫升）（表 1）添加到自动封存前的 1 升 LB 溶液中并混合。
   注:常用的HT115（DE3） 大肠杆菌 具有四环素耐药性。
2. 在发动机罩或使用无菌程序时，在 2 mL 深的 96 井无菌板中向每口油井添加 600 μL 的 LB 溶液。最好使用多通道管道来分配媒体。
3. 使用无菌程序，用HT115（DE3）大肠杆菌为油井接种疫苗，用dsRNA编码质粒转化，以感兴趣的基因或空质粒为控制。盖上盘子，在37°C的夜间孵育。由表达dsRNA的细菌克隆组成的库，相当于预测的C.elegans基因的94%，以前是^22、23构建的^，并且具有商业性。这里使用的陪护图书馆是由理查德·森本博士实验室^26号建造的。
4. 使用无菌程序，种子75，150或250μL的细菌分别到12井，40毫米和6井或60毫米NGM RNAi板。清楚地标记盘子中目标基因的名称。细菌应覆盖30-50%的黄油表面，不应接触板的边缘。
5. 允许板在室温下在长凳上干燥至少 2 天，保持板材覆盖。
   注:板块可在37°C过夜孵育。使用或存储板之前，请确保内井干燥。出于所有长期目的（即干燥或储存），将板保持在黑暗中。干燥的种子板可在 4 °C 下储存长达一个月。

3. 胚胎无压力同步

1. 使用蠕虫采摘将大约 100 个鸡蛋从未同步的蠕虫板移到新播种的 NGM 板。
2. 在 15 °C 下培养动物 5 天，在 20 °C 时培养动物 3.5 天，在 25 °C 下培养动物 2.5 天。 动物应该到产卵的第一天。
   注:蠕虫通常在 20 °C 下培养。 然而，不同的伴郎突变菌株可能需要特定的栽培温度。例如，许多对温度敏感的菌株在 15 °C 下培养，但转移到 25 °C 以暴露其表型。
3. 缓慢地加入1兆L的M9缓冲器（表1），远离细菌草坪。旋转板，使缓冲器完全覆盖板。然后倾斜到一边，从盘子里取出液体，把动物从盘子里洗掉。
   注:使用对温度敏感的动物或伴郎突变体时，最好在动物的培养温度下保持协议中使用的缓冲。
4. 重复步骤 3.3 三次或直到所有的动物被冲下盘子。
5. 使用标准塑料尖端，从鸡蛋集中的洗净板中切出一平方的醋，并将一块醋放入新播种的 NGM 板上。
   注:需要200个鸡蛋才能生产出足够的产卵动物;太多的动物消耗细菌太快。低食物水平会影响蛋白石^27。
6. 在 15 °C 下培养动物 5 天，在 20 °C 时培养 3.5 天，在 25 °C 下培养 2.5 天。 此时，盘子上应该覆盖着同步的鸡蛋。
   注:动物可以转移到一个新的板短期更严格的同步。然而，重要的是，只有在产卵的早期阶段使用成人，因为动物可以保留卵子在他们的子宫影响同步。
7. 慢慢加入1mL的M9缓冲器，远离细菌草坪。
8. 旋转板，使缓冲器完全覆盖板。然后倾斜到一边，从盘子里取出液体，把动物从盘子里洗掉。
9. 重复步骤 3.7 三次或直到所有动物被冲出盘子。
10. 加入1兆L的M9缓冲器，并使用细胞刮刀从盘子中释放鸡蛋。
11. 从盘子中收集含有鸡蛋的 M9 缓冲器。
12. 将含有鸡蛋的 M9 缓冲器离心，在 3，000 x g 下 2 分钟。
13. 拆下超高音量并添加 M9 缓冲器，以达到 1 mL 的体积。
14. 重新悬念鸡蛋，以破坏任何块的鸡蛋和细菌。
15. 重复步骤 3.11-3.13 中描述的洗涤过程五次。蛋丸应该呈白色。如果它仍然是黄色/棕色，重复洗涤，直到达到白色颗粒。
    注意:留在鸡蛋上的细菌会污染dsRNA表达细菌。
16. 去除大部分超高超， 留下大约 200 微升。同步鸡蛋可用于 Rnai 屏幕。

4. 常见表型测定

1. 实验期间动物的培养
   1. 将一滴 +30 鸡蛋放在每个 RNAi 种子板的细菌草坪附近。供参考，也把+30鸡蛋放在盘子里，上面种着含有空载体（L4440）细菌的鸡蛋。
   2. 在 NGM RNAi 种子板上培养年龄同步的动物。实验的持续时间将取决于监测动物的阶段和栽培温度。使用对温度敏感的突变动物时调整培养温度。使用发育迟缓的突变动物时调整培养时间。
      注:虽然时间可能有所不同，但一旦动物成年，产卵（以及由此产生的快速食物消费），以及依赖年龄的蛋白体崩溃^28，可能会影响结果。因此，建议在产卵开始前给动物打分（成年第1天）。野生动物在 15 °C 下 4.5 天后到达此阶段，在 20 °C 时达到 3 天，在 25 °C 下达到 2 天后达到此阶段。
   3. 重复使用的数量将取决于所检查的基因集的大小。对于伴郎库（97个基因），重复实验至少四次。人口规模取决于所使用的检测。在此讨论的行为分析中，每次重复每次重复的实验情况得分>15。数据和统计分析也在很大程度上取决于使用的检测类型。此处讨论的测定中的数据可以作为 SEM ±表示。
   4. 将RNAi和空载体控制处理动物作为独立种群进行比较。P 值可以使用单向或双向 ANOVA 计算，具体取决于所检查的变化，即单独或两者加重或减轻。在检查单个 RNAi 治疗与控制时，P 值可以使用单向或双向曼-惠特尼排名总和测试进行计算。除统计意义外，根据表型的影响程度考虑命中阈值。
2. 发展逮捕/拖延
   1. 按照第4.1步培养年龄同步动物，直到在含有空载体的控制细菌上生长的动物成年，但在产卵开始前。
   2. 使用立体显微镜监测动物，并计算幼虫和成人的数量，以得分发育迟缓的动物的百分比。供参考，与在空载体控制细菌上生长的突变动物相比。 hsp-1 或 hsp-90 RNAi 治疗导致野生动物发育性逮捕，可用作正控。
   3. 要随着时间的推移，要对发育迟缓的动物进行评分，请重复步骤 4.2.2。
      注:如果盘子里有产卵成人，将发育迟缓的动物转移到标有同一靶基因的新NGM-RNAi板上，以避免与后代混淆。
3. 不育或产卵缺陷
   1. 培养年龄同步的动物，就像在第4.1步一样，直到在空病媒控制细菌上生长的动物开始产卵。
   2. 使用立体显微镜监测动物，并给子宫内没有可见卵子的动物打分。供参考，比较在空病媒控制细菌上生长的突变动物。
   3. 或者，使用立体显微镜监测动物，并给子宫内充满卵子的动物打分百分比，定义为EGG铺设缺陷（Egl-d）表型^29。
4. 胚胎杀伤力
   1. 培养年龄同步的动物，如第4.1步，直到动物开始产卵。
   2. 将 +100 鸡蛋转移到空盘子中。将鸡蛋排成一排，以简化计数。
   3. 24-48小时后，将盘子中未煮熟的鸡蛋的百分比评分。供参考，与用空病媒控制细菌治疗的动物的卵子进行比较。
5. 麻痹检测
   1. 对于第 1 天成人，按照第 4.1 步培养年龄同步的动物，直到在空病媒控制细菌上生长的动物成年，但在产卵开始前。
   2. 使用精细标记在普通 NGM 阿加板的背面画一条线。
   3. 将 5-10 只动物放在标记线上。
   4. 设置定时器并等待 10 分钟。
   5. 将留在线上的动物的百分比评分为瘫痪蠕虫。供参考，比较在空病媒控制细菌上生长的突变动物。使用 unc-45 RNAi 治疗的野生动物表现出严重的瘫痪表型，可用作正控。
      注:此检测突出显示中度至重度瘫痪的动物。这种动物通常直接躺在盘子上，而不是呈现常见的弯曲形状。此外，在瘫痪的蠕虫的头部周围可以看到清除细菌的斑块。
6. 鞭打分析
   1. 按照第4.1步培养年龄同步动物，直到在空病媒控制细菌上生长的动物成年，但在产卵开始前。
   2. 在动物的培养温度下将 100 μL 的 M9 缓冲液输送到 96 井板中。
   3. 将 +15 蠕虫（每口井一只）放入含 M9 缓冲器的井中。
   4. 让动物调整5分钟。
   5. 在立体显微镜下检查每只动物，启动倒计时 15 s 的计时器，并计算每只动物在该时间段内进行的身体弯曲次数。计数的值可以正常化为每分钟身体弯曲。供参考，比较在空病媒控制细菌上生长的突变动物。
      注:这种动感检测非常敏感，可以检测出治疗之间的非常轻微的差异。然而，液体中的动能和阿加的动能可能有所不同。

5. 蛋白质击倒的验证

1. 将 250-300 个同步鸡蛋放入 60 mm NGM-RNAi 板上，该板上播种了相关的 dsRNA 表达或空载体（L4440）细菌。
   注:RNAi的击倒可能导致胚胎的异常积累，缺乏胚胎或发育性逮捕，这可能会影响基因表达。在确定要检查的动物的年龄时，应考虑这一点。
2. 对于第 1 天成人，在 15 °C 下培养动物 4.5 天，在 20 °C 时培养动物 3 天，在 25 °C 下养殖 2 天。
3. 挑选并转移总共 200 只年轻的成年动物到 1.5 mL 管的盖子中，填充 200 μL 的 PBS-T。
   注:使用对温度敏感的动物或伴郎突变体时，最好在动物的培养温度下保持协议中使用的缓冲。
4. 小心地关闭盖子，离心机在 1，000 x g 下 1 分钟。
5. 加入 800 μL 的 PBS-T （表 1）和离心机在 1，000 x g 1 分钟。
6. 小心地删除顶部 900 μL。
7. 重复步骤 5.4-5.6 三次。
8. 取出 900 μL，留下 100 μL 的溶液，其中包含 200 蠕虫。
9. 添加 25 μL 的 5 倍样品缓冲器 （表 1）。
10. 在 92°C 下加热样品 10 分钟，同时在 1000 rpm 时摇晃。然后，样品可以冷冻并保存在 -20 °C 下。
11. 装载每个样品的 20 μL，并在 SDS-PAGE 凝胶上运行。
12. 使用适当的抗体进行西式斑点分析，以确定蛋白质的相对稳定性。
13. 使用密度测量软件（如免费提供的 ImageJ 凝胶模块）确定频段的强度。将所有值标准化到对照样本中测量值。
    注:RNAi 在我们的屏幕上被击倒的目的是降低特定伴郎/伴郎的蛋白质水平。因此，评估 RNAi 击倒效率的最佳方法是通过西方污点分析。这需要特定的抗体。或者，qPCR 可用于量化 mRNA 水平。

结果

分别使用 UNC-45 中的温度敏感突变来筛选在允许或限制条件下加重或减轻相互作用的情况
肌肉组装和维护提供了一个有效的系统来研究组织特定的伴郎相互作用。收缩肌肉的功能单元，肉瘤，呈现一个水晶般的结构和调节蛋白排列。运动蛋白肌素的稳定性及其融入收缩肌瘤的厚丝取决于伴郎和UPS组件³⁰的合作。一个例子，这样的陪护是保存和专门肌素伴奏UNC-45，主...

讨论

一个反映它是如何组织起来的，并在不同的元子细胞和组织中发挥作用的蛋白石网络的综合图片仍然缺乏。为了解决这一缺陷，需要提供关于该网络各组成部分（如分子伴郎）在发育和老化过程中特定组织中相互作用的具体信息。在这里，我们展示了组织特异性扰动的使用如何使我们能够检查给定组织中的伴郎网络。为了探索组织特异性伴郎遗传相互作用，考虑了三种不同的方法。在第一种方法?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well-plates	SPL	BA3D16B
40 mm plates	Greiner Bio-one	627160
60 mm plates	Greiner Bio-one	628102
6-well plates	Thermo Scientific	140675
96 well 2 mL 128.0/85mm	Greiner Bio-one	780278
Agar	Formedium	AGA03
Ampicillin	Formedium	69-52-3
bromophenol blue	Sigma	BO126-25G
CaCl2	Merck	1.02382.0500
Camera	Qimaging	q30548
Cholesterol	Amresco	0433-250G
Confocal	Leica	DM5500
Filter (0.22 µm)	Sigma	SCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscope	Leica	MZ165FC
Glycerol	Frutarom	2355519000024
IPTG	Formedium	367-93-1
KCl	Merck	104936
KH2PO4	Merck	1.04873.1000
KOH	Bio-Lab	001649029100
MgSO4	Fisher	22189-08-8	Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibody	Hybridoma Bank	5-6
Na2HPO4·7H2O	Sigma	s-0751
NaCl	Bio-Lab	001903029100
Peptone	Merck	61930705001730
Plate pouring pump	Integra	does it p920
RNAi Chaperone library	NA	NA
SDS	VWR Life Science	0837-500
ß-mercaptoethanol	Bio world	41300000-1
stereomicroscope	Leica	MZ6
Tetracycline	Duchefa Biochemie	64-75-5
Tris	Bio-Lab	002009239100
Tween-20	Fisher	BP337-500