Loop-بوساطة التضخيم متساوي الحرارة لفحص السالمونيلا في الغذاء الحيواني وتأكيد السالمونيلا من عزلة الثقافة

Summary

التضخيم الحراري الأيزوحرارية (LAMP) بوساطة حلقة هو اختبار تضخيم حمض النوى الحرارية (iNAAT) الذي اجتذب اهتمامًا واسعًا في مجال الكشف عن مسببات الأمراض. هنا، نقدم بروتوكول مصباح السالمونيلا متعدد المختبرات كوسيلة سريعة وموثوقة وقوية لفحص السالمونيلا في الغذاء الحيواني وتأكيد السالمونيلا المفترضة من عزلة الثقافة.

Abstract

وقد برز التضخيم متساوي الحراري (مصباح) بوساطة حلقة كاختبار قوي التضخيم حمض النووي للكشف السريع عن العديد من العوامل البكتيرية والفطرية والطفيلية والفيروسية. السالمونيلا هي مسببة أمراض بكتيرية للقلق سلامة الأغذية في جميع أنحاء العالم، بما في ذلك الغذاء للحيوانات. هنا هو متعدد المختبرات التحقق من صحة السالمونيلا لامب البروتوكول الذي يمكن استخدامه لفحص بسرعة الغذاء الحيواني لوجود التلوث السالمونيلا ويمكن أيضا أن تستخدم لتأكيد عزل السالمونيلا المفترضة تعافى من جميع فئات المواد الغذائية. ويستهدف فحص المصباح على وجه التحديد جين غزو السالمونيلا (invA)وسريعة وحساسة ومحددة للغاية. يتم إعداد DNAs قالب من مرق إثراء من الأغذية الحيوانية أو الثقافات النقية لعزل السالمونيلا المفترضة. يتم إعداد خليط مُكْشف المصباح من خلال الجمع بين مزيج رئيسي متساوي الحرارة، واعمدة، وقوالب حمض نووي، والمياه. يعمل مقايسة المصباح عند درجة حرارة ثابتة 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. يتم رصد النتائج الإيجابية عن طريق الفلوريس في الوقت الحقيقي ويمكن الكشف عنها في وقت مبكر من 5 دقائق. اختبار المصباح معارض التسامح عالية لمثبطات في الغذاء الحيواني أو الثقافة المتوسطة، بمثابة سريعة وموثوقة وقوية، فعالة من حيث التكلفة، وسهلة الاستعمال لفحص وتأكيد السالمونيلا. وقد تم مؤخرا إدراج طريقة مصباح في الولايات المتحدة للأغذية والدواء دليل التحليل البكتريولوجي (BAM) الفصل 5.

Introduction

Loop-بوساطة التضخيم متساوي الحرارة (مصباح) هو رواية اختبار تضخيم الحمض النووي متساوي المدى (iNAAT) اخترع في عام 2000 من قبل مجموعة من العلماء اليابانيين¹. من خلال تشكيل هيكل الحمض النووي الجذعية حلقة محددة الهدف خلال الخطوات الأولية، يستخدم مصباح سليمر الحمض النووي الذي يُشرّد حبلاً لتضخيم هذه المادة بدءاً بشكل شبه أسي، مما أدى إلى 10⁹ نسخ من الهدف في أقل من 1 ساعة^1. بالمقارنة مع تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، وهو NAAT مستخدم على نطاق واسع ، يمتلك مصباح العديد من المزايا. أولاً، يتم تنفيذ تفاعلات المصباح في ظل ظروف متساوية. هذا يغني الحاجة إلى آلة متطورة للدراجات الحرارية. ثانيا، مصباح متسامحة للغاية لوسائل الإعلام والثقافة والمواد البيولوجية² مع متانة أظهرت للتطبيقات السريرية والغذائية على حد سواء^3،4. هذا يبسط إعداد العينة ويقلل من النتائج السلبية الخاطئة⁵. ثالثاً، إن LAMP قابل لمنصات الكشف المتعددة، مثل العكر، وقياس الألوان، والإنارة الحيوية، والفلور، وميكروفيويديك^6. رابعاً، إن LAMP محدد للغاية لأنه يستخدم أربعة إلى ستة اُبُر مصممة خصيصاً لاستهداف ست إلى ثماني مناطق محددة^1و7. خامساً، إن LAMP شديد الحساسية والعديد من الدراسات التي أفادت عن حساسيتها الفائقة ل PCR أو PCR⁸في الوقت الحقيقي . وأخيرا، LAMP هو أسرع مع العديد من المقايسات اعتماد الآن 30 دقيقة وقت التشغيل القياسي في حين PCR من نوع المقايسات عادة ما تأخذ 1-2 ح⁸.

غذت هذه الميزات الجذابة تطبيق مصباح في مناطق الكشف عن مسببات الأمراض واسعة، بما في ذلك التشخيص في المختبر ⁹، تشخيص الأمراض الحيوانية¹⁰، والغذاء واختبارات البيئية¹¹. والجدير بالذكر أنّ منظمة الصحة العالمية أوصت بإجراء اختبار بديل صالح لفحص المجهر باستخدام اللطخة البلغمية لتشخيص السل الرئوي في البيئات الطرفية^12. تطبيق مصباح يمتد أيضا إلى ما بعد تحديد الميكروبات لتشمل الكشف عن المواد المسببة للحساسية، والأنواع الحيوانية، ومقاومة المخدرات، والكائنات المعدلة وراثيا، والمبيدات¹³.

السالمونيلا غير التيفويدي هو مسبب أمراض حيوانية لسلامة الأغذية كبيرة والصحة العامة القلق في جميع أنحاء العالم¹⁴. كما تم تحديدها كخطر مكروبي مهم في الغذاء للحيوانات (أي، الغذاء الحيواني)^15،16. لمنع أمراض السالمونيلا / تفشي من الأغذية البشرية الملوثة والغذاء الحيواني، لا بد من وجود أساليب سريعة وموثوقة وقوية لاختبار السالمونيلا في مجموعة متنوعة من المصفوفات. في العقد الماضي، بذلت جهود كبيرة على الصعيد الدولي على تطوير وتطبيق مقايسات السالمونيلا لامب في مجموعة واسعة من مصفوفات الغذاء، كما لخصت مؤخرا في استعراض مستفيض⁸. وقد أكملت عدة اختبارات مصباح السالمونيلا، بما في ذلك واحد المعروضة هنا، بنجاح التحقق من صحة المختبرات المتعددة بعد المبادئ التوجيهية الدولية الراسخة^{17،18،19،20}.

لدينا السالمونيلا مصباح فحص يستهدف على وجه التحديد في غزو السالمونيلا الجينات invA (GenBank الانضمام رقم M90846)²¹ وسريعة وموثوقة وقوية في مصفوفات الغذاء متعددة^{4,22,23,24,25,26}. وقد تم التحقق من صحة هذه الطريقة في ستة مصفوفات الأغذية الحيوانية في دراسة قبل²⁶ وفي الغذاء الكلب الجاف في دراسة تعاونية متعددة المختبرات¹⁹. ونتيجة لذلك، تم مؤخرا إدراج طريقة مصباح السالمونيلا المعروضة هنا في الولايات المتحدة للأغذية والعقاقير (FDA) في دليل التحليل البكتريولوجي (BAM) الفصل 5 السالمونيلا²⁷ لخدمة غرضين، واحد كوسيلة فحص سريع لوجود السالمونيلا في الغذاء الحيواني واثنين كوسيلة تأكيد موثوق بها لسالمونيلا المفترضة معزولة عن جميع الأطعمة.

Protocol

ملاحظة: يحتوي مزيج تفاعل المصباح على بوليميراز الحمض النووي، العازل، MgSO_4،dNTPs، القوالب التمهيدية، قالب الحمض النووي، والماء. يتم احتواء الكواشف الأربعة الأولى في مزيج رئيسي متساوي الحرارة (جدول المواد). التمهيديات هي premixed في المنزل لتصبح مزيج التمهيدي (10x). يمكن إعداد قوالب الحمض النووي من مرق الإثراء لعينات الأغذية الحيوانية لغرض الفحص أو من ثقافات عزل السالمونيلا المفترضة لغرض التأكيد. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تضمين السيطرة الإيجابية (الحمض النووي المستخرج من أي سلالات مرجعية السالمونيلا، على سبيل المثال، السالمونيلا enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 [LT2]) وأية سيطرة قالب (المجلس الوطني الانتقالي؛ معقم المياه الصف الجزيئي) في كل تشغيل مصباح.

1- إعداد نماذج الحمض النووي

1. لإعداد قوالب الحمض النووي من الإثراءات الغذائية الحيوانية، اتبع هذه الخطوات.
   1. Aseptically تزن 25 غرام من عينة الغذاء الحيواني (على سبيل المثال، والغذاء القط الجاف، والغذاء الجاف الكلب، تغذية الماشية، والأعلاف الحصان، وعلف الدواجن، ولحوم الخنازير) في كيس مرشح معقمة (جدول المواد)،أو ما يعادلها. ضع الحقيبة في حاوية كبيرة أو رف للحصول على الدعم أثناء الحضانة.
   2. إضافة 225 مل من الماء المعقم بالبتون المخزنة (BPW). تخلط جيدا عن طريق دوامة وموجزة تدليك اليد. اسمحوا الوقوف في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 ± 5 دقائق.
   3. تخلط جيدا عن طريق دوامة وتحديد رقم هيدروني مع ورقة اختبار. ضبط درجة ح H، إذا لزم الأمر، إلى 6.8 ± 0.2 مع 1 NAOH N عقيمة أو 1 N HCl. Incubate في 35 ± 2 درجة مئوية لمدة 24 ± 2 ساعة.
   4. تخلط جيدا عن طريق دوامة الحقيبة التي تحتوي على مرق إثراء الغذاء الحيواني. نقل 1 مل من الجانب الذي تمت تصفيته من الحقيبة إلى أنبوب microcentrifuge. دوامة لفترة وجيزة.
   5. استخراج الحمض النووي باستخدام كاشف إعداد العينة(جدول المواد)على النحو التالي.
      1. جهاز طرد مركزي في 900 × ز لمدة 1 دقيقة لإزالة الجسيمات الكبيرة ونقل فائقة إلى أنبوب جديد microcentrifuge.
      2. جهاز طرد مركزي في 16،000 × ز لمدة 2 دقيقة والتخلص من الفائق.
      3. تعليق بيليه في 100 ميكرولتر من مُكْشف إعداد العينة والحرارة عند 100 ± 1 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في كتلة الحرارة الجافة.
      4. بارد لدرجة حرارة الغرفة وتخزين عينات من مستخلصات الحمض النووي في -20 درجة مئوية.
2. لإعداد قوالب الحمض النووي من الثقافات السالمونيلا المفترضة، اتبع هذه الخطوات.
   1. الحصول على السالمونيلا المفترض يعزل من عزلة الثقافة في جميع الأطعمة التالية FDA في BAM الفصل 5 قسم السالمونيلا D: عزل السالمونيلا²⁷.
   2. تعول السالمونيلا المفترضة على لوحة أجار غير انتقائية (على سبيل المثال، أجار الدم، أجار المغذيات، و trypticase الصويا أجار) واحتضان في 35 ± 2 درجة مئوية لمدة 24 ± 2 ساعة.
   3. نقل عدة مستعمرات واحدة إلى 5 مل من مرق الصويا trypticase (TSB) أو مرق القلب الدماغ (BHI) واحتضان في 35 ± 2 درجة مئوية لمدة 16 ± 2 ساعة.
      ملاحظة: هذه الخطوة يمكن أن تكون اختيارية إذا الثقافة السالمونيلا المفترضة هو خالص. في هذه الحالة، يمكن إعداد قوالب الحمض النووي عن طريق تعليق عدة مستعمرات مفردة في 5 مل من TSB والحرارة 500 ميكرولتر من التعليق في 100 ± 1 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في كتلة الحرارة الجافة. متابعة الخطوة 5 أدناه.
   4. نقل 500 ميكرولتر من ثقافة بين عشية وضحاها إلى أنبوب microcentrifuge والحرارة في 100 ± 1 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في كتلة الحرارة الجافة.
   5. بارد لدرجة حرارة الغرفة وتخزين عزل مستخلصات الحمض النووي في -20 درجة مئوية.
3. لإعداد الحمض النووي التحكم الإيجابي، اتبع خطوات مماثلة كما سبق لإعداد قوالب الحمض النووي من الثقافات السالمونيلا المفترضة مع خطوة تخفيف إضافية واحدة.
   1. تلقيح S. Typhimurium ATCC 19585 (LT2) أو أي سلالات مرجعية السالمونيلا على لوحة أجار غير انتقائية (على سبيل المثال، أجار الدم، أجار المغذيات، و trypticase الصويا أجار) واحتضان في 35 ± 2 درجة مئوية لمدة 24 ± 2 ساعة.
   2. نقل عدة مستعمرات واحدة إلى 5 مل من TSB أو BHI مرق واحتضان في 35 ± 2 درجة مئوية لمدة 16 ± 2 ساعة لتصل إلى ~^{10 9} CFU / مل.
   3. بشكل متسلسل تخفيف ثقافة بين عشية وضحاها في 0.1٪ بيبتون المياه للحصول على ~ 10⁷ CFU / مل.
   4. نقل 500 ميكرولتر من هذا التخفيف إلى أنبوب microcentrifuge والحرارة في 100 ± 1 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في كتلة الحرارة الجافة.
   5. يبرد إلى درجة حرارة الغرفة ويخزن الحمض النووي التحكم إيجابية في -20 درجة مئوية.

2. إعداد مزيج التمهيدي (10x)

1. الحصول على ال التمهيديات مصباح توليفها تجاريا (Sal4-F3، Sal4-B3، SAL4-FIP، Sal4-BIP، Sal4-LF، و Sal4-LB) مع تنقية desalts القياسية(الجدول 1).

اسم التمهيدي	وصف	تسلسل (5'-3')	طول (bp)
سال4-F3	التمهيدي الخارجي للأمام	GAACGTGTCGCGGAAGTC	18
سال4-ب3	التمهيدي الخارجي للخلف	CGGCAATAGCGTCACCTT	18
Sal4-FIP	التمهيدي الداخلي إلى الأمام	GCGCGCATCCGCATCAATA-TCTGGATGGTATTATCCGG	38
Sal4-BIP	التمهيدي الداخلي الخلفي	GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC	38
Sal4-LF	التمهيدي حلقة إلى الأمام	TCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG	25
Sal4-LB	التمهيدي حلقة إلى الوراء	AAAGGGAAAGCCAGCTTTACG	21

الجدول 1: البهاء التمهيدية لفحص السالمونيلا في الأغذية الحيوانية وتأكيد السالمونيلا من عزلة الثقافة. تم تصميم التمهيديات على أساس تسلسل السالمونيلا إنفا (GenBank رقم الانضمام M90846).

2. إعداد حلول الأسهم من كل التمهيدي (100 μM) عن طريق إعادة الترطيب التمهيدي مع كمية مناسبة من المياه الصف الجزيئي العقيمة. اخلط جيداً عن طريق الدوامة لمدة 10 ثانية ثم قم بتخزينها عند -20 درجة مئوية (-80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل).
3. إعداد مزيج التمهيدي (10x) وفقا لورقة عمل (الجدول 2). إضافة وحدات التخزين المناسبة من حلول الأسهم التمهيدية والمياه الصف الجزيئي العقيمة في أنبوب microcentrifuge. اخلط جميع الكواشف جيدًا عن طريق الدوامة لمدة 10 s.

مكون	conc. (μM)	التمهيدي ميكس conc. (μM)	حجم (ميكرولتر)
سال 4-F3 التمهيدي	100	1	10
سال4-B3 التمهيدي	100	1	10
سال 4-FIP التمهيدي	100	18	180
سال 4-BIP التمهيدي	100	18	180
Sal4-LF التمهيدي	100	10	100
سال4-LB التمهيدي	100	10	100
مياه الصف الجزيئي	غير مُنَدِيًا	غير مُنَدِيًا	420
مجموع	غير مُنَدِيًا	غير مُنَدِيًا	1000

الجدول 2: ورقة عمل لإعداد مزيج التمهيدي مصباح (10x). يتم سرد التمهيديات في الجدول 1.

4. Aliquot مزيج التمهيدي 10x إلى 500 ميكرولتر لكل أنبوب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية.

3. جمعية رد فعل مصباح

ملاحظة: لمنع التلوث المتبادل، يوصى بشدة بفصل المناطق المستخدمة لإعداد المزيج الرئيسي للمصباح وإضافة قوالب الحمض النووي. الشكل 1 هو رسم بياني لمصباح.

الشكل 1: رسم تخطيطي لسير عمل SALMONELLA LAMP. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. إعداد وتشغيل الإعداد
   1. مقاعد البدلاء نظيفة مع ايزوبروبانول والحمض النووي- وDNase-مذلل حل (جدول المواد). الماصات النظيفة وحاملات الشريط أنبوب (جدول المواد) مع الحمض النووي وDNase- المهينة الحل.
   2. اذيب مزيج الماجستير متساوي الحرارة، مزيج التمهيدي (10x)، والمياه الصف الجزيئي، والحمض النووي التحكم الإيجابي، والقوالب الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة.
   3. قم بتشغيل أداة LAMP(جدول المواد)واضغط على شاشة الفتح للوصول إلى الشاشة الرئيسية. اتبع هذه الخطوات لإنشاء تشغيل.
      ملاحظة: نموذج واحد من أداة مصباح لديه 2 كتل (A و B) مع 8 عينات في كل كتلة ونموذج آخر لديه كتلة واحدة التي تستوعب 8 عينات (جدول المواد).
      1. انقر فوق LAMP+ الAnneal وحدد تحرير لإدخال معلومات العينة.
         ملاحظة: يتكون ملف تعريف تشغيل المصباح الافتراضي من التضخيم عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ومرحلة من 98 درجة مئوية إلى 80 درجة مئوية مع 0.05 درجة مئوية في الثانية.
      2. انقر فوق كل صف عينة لتنشيط المؤشر وإدخال معلومات العينة ذات الصلة، وذلك باستخدام رمز كتلة AB للتبديل بين كتلتين أداة LAMP.
      3. انقر فوق أيقونة التحقق عند إدخال كافة معلومات العينة.
         ملاحظة: اختيارياً، قد يتم حفظ الإعداد تشغيل (الذي يطلق عليه "ملف تعريف" الذي يحتوي على معلومات نموذج مع ملف تعريف تشغيل المصباح الافتراضي) للاستخدام لاحقاً. انقر فوق أيقونة حفظ واتّسم ملف التعريف باسم فريد. عند اختبار هذه المجموعة نفسها من العينات في المرة القادمة، يمكن بدء تشغيل جديد باستخدام ملف التعريف المحفوظة. انقر فوق أيقونة المجلد في الجزء السفلي الأيمن من الشاشة الرئيسية وحدد ملف التعريف لتحميل ملفات التعريف المحفوظة.
2. تجمع تفاعل المصباح
   ملاحظة: عند استخدام كل من كتل أداة مصباح (A و B، ما مجموعه 16 عينة)، إعداد مزيج مصباح الرئيسي ل18 عينات. إذا كان استخدام واحد فقط كتلة أداة مصباح (8 عينات المجموع)، وإعداد مزيج المصباح الرئيسي ل10 عينات. بالنسبة لأرقام العينات الأخرى، اضبط مستوى الصوت وفقًا لذلك لاستيعاب فقدان الأنابيب. دائماً تشمل سيطرة إيجابية و NTC في كل تشغيل مصباح. يوصى بإجراء اختبار تكراري لكل عينة في تشغيلات المصباح المستقلة.
   1. إعداد المزيج الرئيسي مصباح وفقا لورقة عمل(الجدول 3). إضافة وحدات التخزين المناسبة من مزيج سيد متساوي الحراري، مزيج التمهيدي، والمياه الصف الجزيئية في أنبوب microcentruge ودوامة بلطف لمدة 3 s. الطرد المركزي لفترة وجيزة.
   2. ضع شريط الأنبوب في حامل الشريط ووزع 23 ميكرولتر من المزيج الرئيسي LAMP إلى كل بئر.
   3. دوامة جميع القوالب الحمض النووي والطرد المركزي لفترة وجيزة. إضافة 2 μL من قالب الحمض النووي إلى البئر المناسبة وغطاء بإحكام.
   4. إزالة شريط أنبوب من حامل ونفض الغبار المعصم لضمان جميع الكواشف قد تجمعت في الجزء السفلي من الأنبوب.
   5. قم بتحميل شريط الأنبوب في كتلة أداة LAMP ( كتلات) ، مما يضمن أن تكون القبعات آمنة قبل إغلاق الغطاء.

مكون	عمل conc.	رد فعل نهائي conc.	حجم لكل عينة (μL)	حجم 18 عينة (μL)	حجم 10 عينات (μL)
ISO-001 مزيج سيد متساوي الحرارة	1.67x	1 x	15	270	150
مزيج التمهيدي	10x	1 x	2.5	45	25
مياه الصف الجزيئي	غير مُنَدِيًا	غير مُنَدِيًا	5.5	99	55
المجموع الفرعي للمزيج الرئيسي	غير مُنَدِيًا	غير مُنَدِيًا	23	414	230
نموذج الحمض النووي	غير مُنَدِيًا	غير مُنَدِيًا	2	غير مُنَدِيًا	غير مُنَدِيًا

الجدول 3: ورقة عمل لإعداد مزيج رد فعل مصباح. يتم إعداد مزيج التمهيدي (10x) وفقا للجدول 2 باستخدام حلول الأسهم التمهيدية المدرجة في الجدول 1.

4. تشغيل المصباح

1. انقر على أيقونة تشغيل في الجزء العلوي الأيسر من الشاشة وحدد كتلة (ق) التي تحتوي على شريط أنبوب (ق) لبدء تشغيل مصباح.
2. اختياريا، في حين أن رد فعل هو قيد التقدم، اضغط على درجة الحرارة، تضخيم، وعلامات الينال لرؤية التغيرات الديناميكية من مختلف المعلمات أثناء تشغيل مصباح.
3. بمجرد اكتمال التشغيل، اضغط على علامات التبويب التضخيم والAnneal لرؤية كاملة التضخيم ومنحنيات الهادل واضغط على علامة التبويب النتائج لعرض النتائج.
4. اختيارياً، لحفظ السجلات، سجل رقم التشغيل الموجود في أعلى يسار الشاشة، باستخدام تنسيق "رقم number_run التسلسلية" على سبيل المثال، "GEN2-2209_0030".

5. تفسير نتائج المصباح

ملاحظة: يمكن الاطلاع على نتائج المصباح على لوحة أداة مصباح مباشرة و / أو باستخدام برنامج مصباح(جدول المواد).

1. لتفسير نتائج المصباح على لوحة العدادات، اتبع الخطوات التالية.
   1. انقر فوق أيقونة المجلد في أسفل يسار الشاشة الرئيسية وحدد تسجيل للانتقال إلى موقع الملف لتحميل تشغيل المصباح الذي يهمك.
      ملاحظة: يتم تنظيم تشغيل المصباح حسب التاريخ، بدءاً من السنة.
   2. مراقبة علامات التبويب الخمس المرتبطة بكل تشغيل: الملف الشخصي، درجة الحرارة، التضخيم، الينال، والنتائج.
      ملاحظة: تُظهر علامات تبويب النبذ ودرجة الحرارة درجات الحرارة المبرمجة والفعلية، على التوالي، في آبار العينة مع استمرار تفاعل المصباح. تُظهر علامات التضخيم والAnneal قراءات الفلور والتغيرات في الفلور أثناء مراحل التضخيم والحنيل، على التوالي. تعرض علامة التبويب النتائج طريقة عرض جدولية لنتائج المصباح.
   3. اضغط على علامة التبويب النتائج لمراقبة نتائج المصباح لكل بئر.
      ملاحظة: هناك ثلاثة أعمدة (حسناً، التضخيم، و(آنال). يُظهر عمود "التضخيم" قيم وقت الذروة(T_max؛ min:sec) لكل عينة ("حسناً") ويظهر عمود "الهايل" درجات حرارة الذوبان/الذوبان(T_m؛ °C) لأي منتج مضخم في ذلك البئر.
   4. تفسير نتائج LAMP وتقرير نتائج المصباح النهائية على النحو التالي.
      1. فحص الآبار التحكم أولاً. وينبغي أن يكون المجلس الوطني الانتقالي جيدا _فارغة T ماكس في حين أن تي_م يمكن أن تكون إما فارغة (كلا من نماذج أداة مصباح) أو < 83 درجة مئوية (فقط لنموذج أداة مصباح مع كتلتين). السيطرة الإيجابية يجب أن يكون جيدا T_{الحد الأقصى} بين 5 و 10 دقيقة و T _m حول 90 درجة مئوية.
      2. فحص العينة الآبار. جميع العينات مع T_م الصحيح (حوالي 90 درجة مئوية) و T كحد_أقصى (بين 5−30 دقيقة) تعتبر إيجابية بالنسبة السالمونيلا.
      3. تقرير نتائج المصباح النهائية استنادًا إلى النتائج من عمليات التشغيل المكررة. إذا كان لـ "تشغيلات مكررة" نتائج متناسقة، يمكن الإعلام عن نتائج المصباح النهائية. إذا كانت عمليات التشغيل المكررة غير متناسقة، كرر تشغيل كلا بشكل مستقل. إذا كانت النتائج لا تزال غير متناسقة، ينبغي اعتبار العينة إيجابية افتراضية لسالمونيلا وسوف تحتاج إلى الذهاب من خلال تأكيد الثقافة.
2. لتفسير نتائج LAMP باستخدام البرنامج، اتبع الخطوات التالية.
   1. انقر على أيقونة الكمبيوتر على اللوحة اليمنى وانتقل إلى موقع الملف لتحميل مصباح تشغيل الفائدة.
      ملاحظة: لا يحتاج الكمبيوتر الذي به البرنامج المثبت إلى أن يكون متصلاً بجهاز LAMP لتحليل نتائج المصباح، أي أن الوصول عن بعد متاح. يتم تنظيم تشغيل المصباح حسب التاريخ.
   2. مراقبة علامات التبويب السبع المرتبطة بكل تشغيل: الملف الشخصي، درجة الحرارة، التضخيم، معدل التضخيم، ال Anneal، مشتقة الناجيل، والنتيجة.
      ملاحظة: على غرار عرض لوحة العدادات، تعرض علامات تبويب النبذ ودرجة الحرارة درجات الحرارة المبرمجة والفعلية، على التوالي، في آبار العينة مع استمرار تفاعل المصباح. التضخيم /التضخيم معدل والآنيل/ علاماتالتبويب المشتقة الينال تظهر قراءات الفلورانس أو التغيرات في الفلوريس خلال مراحل التضخيم والحنى، على التوالي. تعرض علامة التبويب النتائج عرضًا جدوليًا لنتائج المصباح التي تختلف قليلاً عن عرض لوحة العدادات.
   3. اضغط على علامة التبويب معدل التضخيم لعرض عرض رسومي لنسب الفلورسينس حسب الوقت. انقر على رمز الإعداد في أعلى يمين الشاشة ثم قم بضبط "نسبة عتبة الكشف الذروة" من 0.020 إلى 0.010.
      ملاحظة: التعديل ضروري لضمان تحديد جميع القمم الصالحة، والنتائج التي تم الحصول عليها باستخدام البرامج تتطابق مع تلك المعروضة على لوحة العدادات.
   4. اضغط على علامة التبويب النتيجة لمراقبة نتائج المصباح لكل بئر.
      ملاحظة: هناك أربعة أعمدة (اسم الرسم البياني رقم Well " " ، "اسم" و "قيمة الذروة"). الجزء العلوي من العمود "قيمة الذروة" يظهر "وقت أمبير"(T_max؛ min:sec) لكل عينة ("اسم البئر") بينما الجزء السفلي يظهر "مشتقة البين"(T_m; °C) لأي منتج مضخم في ذلك البئر.
   5. تفسير نتائج المصباح وتقرير نتائج المصباح النهائي بعد خطوات مماثلة كما هو الحال عند استخدام لوحة العدادات مع استثناء واحد أن المجلس الوطني الانتقالي جيدا والعينات السلبية الأخرى ينبغي أن يكون T_م فارغة كما إعدادات برنامج المصباح القضاء على تلك النتائج T_م < 83 درجة مئوية. وبالمثل، تعتبر جميع العينات مع T_م الصحيح (حوالي 90 درجة مئوية) و T كحد_أقصى (بين 5−30 دقيقة) إيجابية بالنسبة إلى السالمونيلا.

النتائج

الشكل 2 والشكل 3 تظهر الرسوم البيانية المصابيح التمثيلية / الجداول المعروضة على كلا المنصات. في هذا تشغيل المصباح، عينات S1 إلى S6 هي 10 أضعاف التخفيفات التسلسلية من S. enterica serovar ATCC ATCC 51741 تتراوح بين 1.1 × 10⁶ CFU إلى 11 CFU لكل رد فعل. السيطرة الإيجابية هو S. enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 (LT2) في 1.7 × 10⁴ CFU لكل رد فعل NTC هو المياه الصف الجزيئية.

كما هو مبين في الشكل 2E و 3G الشكل، كل من المجلس الوطني الانتقالي و آبار الكمبيوتر هي ضوابط صالحة. المجلس الوطني الانتقالي جيدا لديه _{T ماكس} فارغة في حين أن T _m هو < 83 درجة مئوية على لوحة أداة مصباح وفارغة في برنامج مصباح، مما يشير إلى نتيجة سلبية. الكمبيوتر جيدا لديه T_{كحد أقصى} من 7 دقيقة 45 ثانية و T _م من ~ 90 درجة مئوية على كلا المنصات، مما يشير إلى نتيجة إيجابية. عينات S1 إلى S6 لديها T_{كحد أقصى} بين 6 دقيقة 30 ثانية و 12 دقيقة 15 ثانية، وكلها السالمونيلا-إيجابية.

بعد تشغيل مكررة من نفس المجموعة من العينات، يتم الإبلاغ عن نتائج المصباح النهائية لهذه العينات. هذا التمثيل مصباح تشغيل يبين أن المصباح يكشف بنجاح السالمونيلا مع مجموعة واسعة من التركيزات في العينات.

الشكل 2: عرض نتائج المصباح التمثيلية على لوحة أداة LAMP. (A) تعرض علامة التبويب الملف الشخصي ملف درجة الحرارة المبرمج. (B) علامة التبويب درجة الحرارة يظهر درجات الحرارة الفعلية في الآبار عينة كما امبال رد فعل العائدات. (C) علامة التبويب التضخيم يظهر قراءات الفلوريسنس أثناء تضخيم المصباح. (D)علامة التبويب الـ Anneal تظهر التغيرات في الفلور (المشتق) خلال مرحلة الـ(هابل). (E) تظهر علامة التبويب "النتائج" طريقة عرض جدولية لنتائج المصباح. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: نتائج المصابيح التمثيلية التي يتم عرضها في برنامج LAMP. (A) تعرض علامة التبويب الملف الشخصي ملف درجة الحرارة المبرمج. (B) علامة التبويب درجة الحرارة يظهر درجات الحرارة الفعلية في الآبار عينة كما امبال رد فعل العائدات. (C) علامة التبويب التضخيم يظهر قراءات الفلوريسنس أثناء تضخيم المصباح. (D) علامة التبويب معدل التضخيم يظهر التغيرات في الفلوريسنس (نسبة الفلوريسين) أثناء تضخيم المصباح. (E) علامة التبويب الـ Anneal تعرض قراءات الفلورانس أثناء مرحلة الوَل. (F) علامة التبويب مشتقة الولاي تظهر التغيرات في الفلور (المشتق) خلال المرحلة اللدّية. (G) تظهر علامة التبويب النتيجة عرض جدولي لنتائج المصباح. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

لقد قدمنا هنا بسيطة وسريعة ومحددة ، وطريقة حساسة لفرز و تأكيد السالمونيلا في الغذاء الحيواني والثقافة النقية ، على التوالي. مع الراحة من مزيج سيد isothermal الذي يحتوي على أربع الكواشف الرئيسية، وجاهزة للاستخدام، في المنزل إعداد مزيج التمهيدي، وتجميع رد فعل مصباح يتطلب سوى بضع خطوات pipetting (الشكل 1). إجمالي وقت التشغيل بما في ذلك التضخيم ومراحل الثني أقل من 38 دقيقة(الشكل 2A، B والشكل 3A، B). يتم رصد النتائج الإيجابية عن طريق الفلورسينس في الوقت الحقيقي (الشكل 2C والشكل 3C, D) ويمكن الكشف عنها في وقت مبكر من 5 دقيقة²⁶. الطور الهاد بمثابة تأكيد إضافي خصوصية مصباح حيث أن العينات التي اُصيبت بـ T_m (حوالي 90 درجة مئوية) يتم الإبلاغ عنها على أنها إيجابية(الشكل 2D و E والشكل 3E−G). وقد تم الإبلاغ عن حساسيات من 1 خلية السالمونيلا في الثقافة النقية < 1 CFU/25 ز في الغذاء الحيواني سابقا²⁶.

كما مصباح فعالة جدا ويولد كمية كبيرة من الحمض النووي¹، فمن الأهمية بمكان أن يتم استخدام أفضل الممارسات المختبرية لمنع التلوث المتبادل ، والتي قد تشمل فصل جسديا المناطق اللازمة لإعداد المزيج الرئيسي مصباح وإضافة قوالب الحمض النووي ، وتجنب توليد الهباء الجوي ، وذلك باستخدام نصائح ماصة مرشح ، وتغيير القفازات في كثير من الأحيان ، والامتناع عن فتح ردود فعل المصباح بعد التضخيم.

وقد سبق اختبار خصوصية هذا الأسلوب لمبة السالمونيلا باستخدام 300 سلالات بكتيرية (247 السالمونيلا من 185 سيروفارس و 53 غيرالسالمونيلا)و أظهرت أن 100٪ محددة²⁶. وتجدر الإشارة إلى أن الاختلافات الكبيرة في T_ماكس لوحظ بين نوعي السالمونيلا، S. enterica وبونغوري السالمونيلا، وبين الأنواع الفرعية S. enterica، وخاصة subsp. أريزونا (IIIa)²⁶. ومع ذلك، كانت هذه النتائج الإيجابية لا تزال صالحة وفقا لقواعد لتفسير نتائج مصباح. في دراستنا التعاونية متعددة المختبرات في الغذاء الكلب الجاف التي شملت 14 المحللين¹⁹، وعينات وجود نتائج غير متناسقة في تشغيل مصباح مكررة لوحظت أحيانا. هذه عادة ما تنطوي على عينات مع نتائج إيجابية متأخرة (T_max > 15 دقيقة). تكرار كلا تشغيل بشكل مستقل عادة حل المشكلة. أكثر نادرا، لاحظنا عينات مع T_م الصحيح ولكن لا أو غير منتظمة T_{القيم القصوى} (< 5 دقيقة). وعادة ما يكون هذا بسبب فقاعات الهواء في أنبوب رد الفعل.

طوال دورة حياة تطوير الأسلوب LAMP ، والتقييم ، والدراسات قبل الدراسة ، والتحقق من صحة المختبرات المتعددة ، لاحظنا تحملًا عاليًا من LAMP إلى مثبطات في مختلف المواد الغذائية الحيوانية أو مصفوفات الطعام ووسائل الإعلام الثقافية^{4،19،22،23،24}، تسليط الضوء على قوة الطريقة والتعاون في العديد من الدراسات الأخرى على نطاق عالمي^8. وهذا أعلى بالمقارنة مع PCR أو PCR في الوقت الحقيقي، الأمر الذي يتطلب عادة مراقبة التضخيم الداخلية لضمان أن النتائج السلبية ليست بسبب تثبيط^{مصفوفة 28}. وعلاوة على ذلك، أظهر مصباح مماثلة (أو متفوقة) خصوصية وحساسية مقارنة PCR أو PCR في الوقت الحقيقي في الغالبية العظمى من الدراسات⁸. تكلفة كاشفات مصباح هو في حوالي 1 دولار لكل رد فعل. أجهزة LAMP المستخدمة في هذا البروتوكول هي صغيرة ومنخفضة الصيانة والمحمولة. ويمكن التعامل مع أي طريقة التضخيم متساوي الحرارة التي تستخدم الكشف عن الهدف عن طريق قياس الفلورانس، وشملت مصباح. باستخدام برنامج LAMP، يمكن إنشاء تقارير شاملة بتنسيق متعدد (pdf، نص، وصورة).

التحقق من صحة الأسلوب هو خطوة هامة قبل أن يمكن اعتماد أسلوب جديد للاستخدام الروتيني. ومن الجدير بالذكر أن بروتوكول المصابيح المبلغ عنها هنا قد أكمل بنجاح التحقق من صحة المختبرات المتعددة¹⁹. مع دمج مؤخرا هذا البروتوكول مصباح في الولايات المتحدة FDA في BAM الفصل 5 السالمونيلا²⁷, ومن المتوقع أن الطريقة سوف تكسب استخدام أوسع بكثير, سواء كوسيلة للفحص السريع في الغذاء الحيواني وكوسيلة تأكيد موثوق بها لعزلات السالمونيلا المفترضة من جميع فئات الغذاء.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain heart infusion (BHI) broth	BD Diagnostic Systems, Sparks, MD	299070	Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella.
Buffered peptone water (BPW)	BD Diagnostic Systems, Sparks, MD	218105	Preenrichment medium for the recovery of Salmonella from animal food samples.
DNA AWAY	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	7010	Eliminates unwanted DNA and DNase from laboratory bench, glassware, and plasticware without affecting subsequent DNA samples.
Genie Explorer software	OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom	Version 2.0.6.3	Supports remote operation of Genie instruments including LAMP runs and data analysis.
Genie II or Genie III (LAMP instrument)	OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom	GEN2-02 or GEN3-02	A small instrument capable of temperature control up to 100 °C with ± 0.1 °C accuracy and simultaneous fluorescence detection via the FAM channel. Genie II has 2 blocks (A and B) with 8 samples in each block. Genie III has a single block that accommodates 8 samples.
Genie strip	OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom	OP-0008	8-well microtube strips with integral locking caps and a working volume of 10 to 150 µl.
Genie strip holder	OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom	GBLOCK	Used to hold Genie strips when setting up a LAMP reaction, the aluminum holder can also be used as a cool block.
Hydrochloric acid (HCl) solution, 1 N	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	SA48-500	Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment.
Heat block	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	88-860-022	Heats samples at 100 ± 1 oC for DNA extraction.
Incubator	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	3960	Standard laboratory incubator.
ISO-001 isothermal master mix	OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom	ISO-001	An optimized master mix to simplify the assembly of a LAMP reaction, containing a strand-displacing GspSSD DNA polymerase large fragment from Geobacillus spp., thermostable inorganic pyrophosphatase, reaction buffer, MgSO4, dNTPs, and a double-stranded DNA binding dye (FAM detection channel).
Isopropanol	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	A416	Disinfects work surfaces.
LAMP primers	Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA	Custom	LAMP primers with detailed information in Table 1.
Microcentrifuge	Eppendorf North America, Hauppauge, NY	22620207	MiniSpin plus personal microcentrifuge.
Microcentrifuge tubes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	05-408-129	Standard microcentrifuge tubes.
Molecular grade water	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	AM9938	Used in making primer stocks, primer mix, and LAMP reaction mix.
Sodium hydroxide (NaOH) solution, 1 N	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	SS266-1	Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment.
Nonselective agar (e.g., blood agar, nutrient agar, and trypticase soy agar)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	R01202	Solid growth medium used in the cultivation of Salmonella.
Peptone water	BD Diagnostic Systems, Sparks, MD	218071	Dilutes overnight Salmonella cultures to make positive control DNA.
Pipettes and tips	Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CA	Pipet Lite LTS series	Standard laboratory pipettes and tips.
PrepMan Ultra sample preparation reagent	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	4318930	A simple kit used for the rapid preparation of DNA templates for use in a LAMP reaction.
Salmonella reference strain LT2	ATCC, Manassas, VA	700720	Salmonella reference strain used as positive control.
Trypticase soy broth (TSB)	BD Diagnostic Systems, Sparks, MD	211768	Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella.
Vortex mixer	Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY	SI-0236	Standard laboratory vortex mixer.
Whirl-pak filter bag	Nasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WI	B01318	Filter bags to hold animal food samples for preenrichment.