Amplificazione isotermica mediata ad anello per lo screening della Salmonella negli alimenti animali e conferma della Salmonella dall'isolamento della coltura

Riepilogo

L'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) è un test di amplificazione dell'acido nucleico isotermico (iNAAT) che ha attirato un ampio interesse nel campo del rilevamento degli agenti patogeni. Qui presentiamo un protocollo Salmonella LAMP convalidato in più laboratori come metodo rapido, affidabile e robusto per lo screening della Salmonella negli alimenti per animali e la conferma della Salmonella presuntiva dall'isolamento della coltura.

Abstract

L'amplificazione isotermica mediata ad anello (LAMP) è emersa come un potente test di amplificazione dell'acido nucleico per il rapido rilevamento di numerosi agenti batterici, fungini, parassiti e virali. La salmonella è un agente patogeno batterico di interesse mondiale per la sicurezza alimentare, compresi gli alimenti per animali. Qui è presentato un protocollo Salmonella LAMP convalidato da più laboratori che può essere utilizzato per migliorare rapidamente gli alimenti per animali per la presenza di contaminazione da Salmonella e può anche essere utilizzato per confermare presunti isolati di Salmonella recuperati da tutte le categorie alimentari. Il test LAMP si rivolge specificamente al gene di invasione della Salmonella (invA)ed è rapido, sensibile e altamente specifico. I DNA modello sono preparati con brodi di arricchimento di alimenti animali o colture pure di presunti isolati di Salmonella. La miscela di reagenti LAMP viene preparata combinando un mix di maestri isotermici, primer, modello di DNA e acqua. Il saggio LAMP funziona a una temperatura costante di 65 °C per 30 min. I risultati positivi sono monitorati tramite fluorescenza in tempo reale e possono essere rilevati già da 5 minuti. Il saggio LAMP mostra un'elevata tolleranza agli inibitori negli alimenti animali o nel mezzo di coltura, fungendo da metodo rapido, affidabile, robusto, economico e di facile utilizzo per lo screening e la conferma della Salmonella. Il metodo LAMP è stato recentemente incorporato nel Capitolo 5 del Manuale analitico batteriologico (BAM) della Food and Drug Administration degli Stati Uniti.

Introduzione

L'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) è un nuovo test di amplificazione dell'acido nucleico isotermico (iNAAT) inventato nel 2000 da un gruppo di scienziati^{giapponesi 1}. Attraverso la formazione di una struttura del DNA ad anello stelo specifica del bersaglio durante le fasi iniziali, LAMP utilizza una DNA polimerasi che sposta il filamento per amplificare in modo efficiente questo materiale di partenza quasi esponenzialmente, con il risultato di^{10 9} copie di bersaglio in meno di 1 h¹. Rispetto alla reazione a catena della polimerasi (PCR), un NAAT ampiamente utilizzato, LAMP possiede diversi vantaggi. In primo luogo, le reazioni LAMP vengono eseguite in condizioni isotermiche. Ciò ovvia alla necessità di un sofisticato strumento di ciclismo termico. In secondo luogo, LAMP è altamente tollerante ai mezzi di coltura e alle^{sostanze biologiche 2} con robustezza dimostrata sia per applicazioni^{cliniche che alimentari 3,4}. Ciò semplifica la preparazione del campione e riduce al minimo i risultati falsi negativi⁵. In terzo luogo, LAMP è suscettibile a più piattaforme di rilevamento, come torbidità, colorimetria, bioluminescenza, fluorescenza e microfluidica⁶. In quarto luogo, LAMP è altamente specifico in quanto utilizza da quattro a sei primer appositamente progettati per indirizzare da sei a otto regioni^{specifiche 1,7}. Quinto, LAMP è ultrasensibile e numerosi studi hanno riportato la sua sensibilità superiore alla PCR o al PCR 8 in^{tempo reale.} Infine, LAMP è più veloce con molti saggi che ora adottano un tempo di esecuzione standard di 30 minuti, mentre i test di tipo PCR di solito prendono 1−2 h⁸.

Queste caratteristiche interessanti hanno alimentato l'applicazione di LAMP in ampie aree di rilevamento di agenti patogeni, tra cui la diagnostica in vitro ^9,la diagnostica^{delle malattie animali 10}e i test^{alimentari e ambientali 11}. In particolare, un TB-LAMP (LAMP for Mycobacterium tuberculosis) è stato raccomandato dall'OMS come valido test sostitutivo per la microscopia a striscio di espettorato per diagnosi di tubercolosi polmonare in impostazioni periferiche¹². L'applicazione LAMP si espande anche oltre l'identificazione microbica per includere il rilevamento di allergeni, specie animali, resistenza ai farmaci, organismi geneticamente modificati e pesticidi¹³.

La Salmonella non foidale è un agente patogeno zoonotico di notevole interesse per la sicurezza alimentare e la salute pubblica in tutto il mondo¹⁴. È stato anche identificato come un importante pericolo microbico negli alimenti per animali (cioè alimenti per animali)^15,16. Per prevenire malattie/focolai di Salmonella da alimenti umani e alimenti animali contaminati, è imperativo disporre di metodi rapidi, affidabili e robusti per testare la Salmonella in una varietà di matrici. Nell'ultimo decennio, sono stati compiuti notevoli sforzi a livello internazionale per lo sviluppo e l'applicazione di saggi Salmonella LAMP in una vasta gamma di matrici alimentari, come recentemente riassunto in un'ampia^{revisione 8}. Diversi saggi Salmonella LAMP, tra cui quello qui presentato, hanno completato con successo la convalida multi-laboratorio seguendo le consolidate linee guida internazionali^17,18,19,20.

Il nostro test Salmonella LAMP si rivolge specificamente al gene di invasione della Salmonella invA (GenBank numero di adesione M90846)²¹ ed è rapido, affidabile e robusto in più matrici^{alimentari 4,22,23,24,25,26}. Il metodo è stato convalidato in sei matrici di alimenti per animali in uno studio precollaborativo²⁶ e nel cibo secco per cani in uno studio collaborativo multi-laboratorio¹⁹. Di conseguenza, il metodo Salmonella LAMP qui presentato è stato recentemente incorporato nel Manuale analitico batteriologico (BAM) della Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti (BAM) Capitolo 5 Salmonella²⁷ per servire a due scopi, uno come metodo di screening rapido per la presenza di Salmonella negli alimenti animali e due come metodo di conferma affidabile per la Salmonella presuntiva isolata da tutti gli alimenti.

Protocollo

NOTA: Un mix di reazione LAMP contiene DNA polimerasi, tampone, MgSO₄, dNTP, primer, modello di DNA e acqua. I primi quattro reagenti sono contenuti in un mix di maestri isotermici(Tabella dei materiali). I primer vengono premiscelati internamente per diventare un mix di primer (10x). I modelli di DNA possono essere preparati da brodi di arricchimento di campioni di alimenti per animali a scopo di screening o da colture di presunti isolati di Salmonella a scopo di conferma. Inoltre, un controllo positivo (DNA estratto da qualsiasi ceppi di riferimento di Salmonella, ad esempio Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 [LT2]) e un controllo senza modello (NTC; acqua sterile di grado molecolare) sono inclusi in ogni corsa LAMP.

1. Preparazione di modelli di DNA

1. Per preparare modelli di DNA da arricchimenti di alimenti animali, segui questi passaggi.
   1. Pesare aseticamente 25 g di campione di alimenti per animali (ad esempio, cibo secco per gatti, cibo secco per cani, mangimi per bovini, mangimi per cavalli, mangimi per pollame e mangimi per suini) in un sacchetto filtrante sterile(tabella dei materiali)o equivalente. Posizionare il sacchetto in un grande contenitore o rack per il supporto durante l'incubazione.
   2. Aggiungere 225 mL di acqua peptone tamponata sterile (BPW). Mescolare bene girando e breve massaggio alle mani. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 60 ± 5 minuti.
   3. Mescolare bene ruotando e determinare il pH con una carta di prova. Regolare il pH, se necessario, a 6,8 ± 0,2 con sterile 1 N NaOH o 1 N HCl. Incubare a 35 ± 2 °C per 24 ± 2 ore.
   4. Mescolare bene ruotando il sacchetto contenente brodi di arricchimento degli alimenti per animali. Trasferire 1 ml dal lato filtrato del sacchetto a un tubo di microcentrifugo. Vortice brevemente.
   5. Estrarre il DNA utilizzando un reagente per la preparazione delcampione (Tabella deimateriali) come segue.
      1. Centrifuga a 900 x g per 1 min per rimuovere particelle di grandi dimensioni e trasferire il supernatante su un nuovo tubo di microcentrifugo.
      2. Centrifuga a 16.000 x g per 2 min e scarta supernatante.
      3. Sospendere il pellet in 100 μL del reagente di preparazione del campione e riscaldare a 100 ± 1 °C per 10 minuti in un blocco di calore secco.
      4. Raffreddare a temperatura ambiente e conservare gli estratti di DNA campione a -20 °C.
2. Per preparare modelli di DNA da presunte colture di Salmonella, seguire questi passaggi.
   1. Ottenere presunti isolati di Salmonella dall'isolamento della coltura in tutti gli alimenti a seguito della sezione D della SALMONELLA BAM Chapter 5 della FDA: Isolamento della Salmonella²⁷.
   2. Inoculare la Salmonella presuntiva si isola su una piastra di agar non selezionabile (ad esempio, agar del sangue, agar nutriente e agar di soia triptatasi) e incubare a 35 ± 2 °C per 24 ± 2 ore.
   3. Trasferire diverse singole colonie a 5 mL di brodo di soia triptatasi (TSB) o brodo per infusione di cuore cerebrale (BHI) e incubare a 35 ± 2 °C per 16 ± 2 ore.
      NOTA: Questo passaggio può essere facoltativo se la coltura presuntiva di Salmonella è pura. In tal caso, i modelli di DNA possono essere preparati sospendendo diverse singole colonie in 5 mL di TSB e riscaldando 500 μL della sospensione a 100 ± 1 °C per 10 minuti in un blocco di calore secco. Continua con il passaggio 5 qui sotto.
   4. Trasferire 500 μL della coltura notturna in un tubo di microcentrifugo e riscaldare a 100 ± 1 °C per 10 minuti in un blocco di calore secco.
   5. Raffreddare a temperatura ambiente e conservare gli estratti di DNA isolati a -20 °C.
3. Per preparare il DNA di controllo positivo, seguire passaggi simili a quanto sopra per preparare modelli di DNA da presunte colture di Salmonella con una fase di diluizione aggiuntiva.
   1. Inoculare S. Typhimurium ATCC 19585 (LT2) o qualsiasi ceppi di riferimento di Salmonella su una piastra di agar non selezionato (ad esempio, agar del sangue, agar nutriente e agar di soia triptatasi) e incubare a 35 ± 2 °C per 24 ± 2 ore.
   2. Trasferire diverse singole colonie a 5 mL di brodo TSB o BHI e incubare a 35 ± 2 °C per 16 ± 2 ore per raggiungere ~10⁹ CFU/mL.
   3. Diluire serialmente la coltura notturna in acqua peptone allo 0,1% per ottenere ~ 10⁷ CFU / mL.
   4. Trasferire 500 μL di questa diluizione in un tubo di microcentrifugo e riscaldare a 100 ± 1 °C per 10 minuti in un blocco di calore secco.
   5. Raffreddare a temperatura ambiente e conservare il DNA di controllo positivo a -20 °C.

2. Preparazione del mix di primer (10x)

1. Ottenere primer LAMP sintetizzati commercialmente (Sal4-F3, Sal4-B3, Sal4-FIP, Sal4-BIP, Sal4-LF e Sal4-LB) con purificazione di dissalazione standard(tabella 1).

Nome primer	Descrizione	Sequenza (5'-3')	Lunghezza (bp)
Sal4-F3	Primer esterno in avanti	GAACGTGTCGCGGAAGTC	18
Sal4-B3	Primer esterno all'indietro	CGGCAATAGCGTCACCTT	18
Sal4-FIP	Primer interno in avanti	GCGCGGCATCCGCATCAATA-TCTGGATGGTATGCCCGG	38
Sal4-BIP	Primer interno all'indietro	GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC	38
Sal4-LF	Primer loop forward	TCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG	25
Sal4-LB	Primer loop all'indietro	AAAGGGAAAGCCAGCTTTACG	21

Tabella 1: Primer LAMP per lo screening della Salmonella negli alimenti per animali e conferma della Salmonella dall'isolamento della coltura. I primer sono progettati sulla base della sequenza Salmonella invA (numero di adesione GenBank M90846).

2. Preparare soluzioni stock di ogni primer (100 μM) reidratando il primer con una quantità appropriata di acqua sterile di grado molecolare. Mescolare bene con vortici per 10 s e conservare a -20 °C (-80 °C per lo stoccaggio a lungo termine).
3. Preparare la miscela di primer (10x) in base a un foglio di lavoro(tabella 2). Aggiungere volumi appropriati di soluzioni di primer stock e acqua sterile di grado molecolare in un tubo di microcentrifugo. Mescolare bene tutti i reagenti vortice per 10 s.

Componente	Conc. stock (μM)	Mix primer conc.	Volume (μL)
Primer Sal4-F3	100	1	10
Primer Sal4-B3	100	1	10
Primer Sal4-FIP	100	18	180
Primer Sal4-BIP	100	18	180
Primer Sal4-LF	100	10	100
Primer Sal4-LB	100	10	100
Acqua di grado molecolare	N/D	N/D	420
Totale	N/D	N/D	1000

Tabella 2: Foglio di lavoro per la preparazione del mix di primer LAMP (10x). I primer sono elencati nella tabella 1.

4. Aliquota la miscela di primer 10x a 500 μL per tubo di microcentrifugo e conservare a -20 °C.

3. Montaggio di una reazione LAMP

NOTA: Per prevenire la contaminazione incrociata, si consiglia vivamente di separare fisicamente le aree utilizzate per preparare il mix di master LAMP e aggiungere modelli di DNA. La figura 1 è un diagramma LAMP.

Figura 1: Diagramma schematico del flusso di lavoro Salmonella LAMP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Preparazione ed esecuzione del programma di installazione
   1. Panca pulita con isopropanolo e una soluzione degradante per DNA e DNasi(Tavolo dei Materiali). Pipette pulite e supporti per nastritubo(Table of Materials)con la soluzione degradante del DNA e della DNasi.
   2. Scongelare il mix di maestri isotermici, il mix di primer (10x), l'acqua di grado molecolare, il DNA di controllo positivo e i modelli di DNA a temperatura ambiente.
   3. Accendere lo strumento LAMP (Table of Materials) e toccare la schermata iniziale per accedere alla schermata iniziale. Seguire questa procedura per creare un'esecuzione.
      NOTA: Un modello dello strumento LAMP ha 2 blocchi (A e B) con 8 campioni in ogni blocco e un altro modello ha un singolo blocco che può ospitare 8campioni (Tavolo dei Materiali).
      1. Toccare LAMP+Ricottura e selezionare Modifica per immettere informazioni di esempio.
         NOTA: Il profilo di esecuzione LAMP predefinito è costituito da amplificazione a 65 °C per 30 min e una fase ricottura da 98 °C a 80 °C con decremento di 0,05 °C al secondo.
      2. Toccare ogni riga di esempio per attivare il cursore e immettere le informazioni di esempio pertinenti, utilizzando l'icona del blocco AB per passare da un blocco di strumenti LAMP all'altro.
      3. Toccare l'icona Controlla quando sono state immesse tutte le informazioni di esempio.
         NOTA: facoltativamente, l'impostazione di esecuzione (chiamata "Profilo", che contiene informazioni di esempio insieme al profilo di esecuzione LAMP predefinito) può essere salvata per un uso successivo. Toccare l'icona Salva e assegnare al profilo un nome univoco. Quando si testa questo stesso set di campioni la prossima volta, è possibile avviare una nuova esecuzione utilizzando il profilo salvato. Toccare l'icona Cartella in basso a sinistra della schermata iniziale e selezionare Profilo per caricare i profili salvati.
2. Gruppo di reazione LAMP
   NOTA: Quando si utilizzano entrambi i blocchi di strumenti LAMP (A e B, per un totale di 16 campioni), preparare il mix master LAMP per 18 campioni. Se si utilizza un solo blocco di strumenti LAMP (8 campioni in totale), preparare il mix master LAMP per 10 campioni. Per altri numeri di campione, regolare il volume di conseguenza per adattarsi alla perdita di pipettazione. Includere sempre un controllo positivo e un NTC in ogni esecuzione LAMP. Si consiglia il test duplicato di ogni campione in esecuzioni LAMP indipendenti.
   1. Preparare il master mix LAMP in base a un foglio di lavoro (Tabella 3). Aggiungere i volumi appropriati del mix di master isotermico, della miscela di primer e dell'acqua di grado molecolare in un tubo di microcentrifugo e vortice delicatamente per 3 s. Centrifugare brevemente.
   2. Posizionare la striscia del tubo nel supporto del nastro e distribuire 23 μL della miscela master LAMP ad ogni pozzo.
   3. Vortice tutti i modelli di DNA e centrifuga brevemente. Aggiungere 2 μL di modello di DNA al pozzo appropriato e cappuccio strettamente.
   4. Rimuovere la striscia del tubo dal supporto e scorrere il polso per assicurarsi che tutti i reagenti si siano raggruppati nella parte inferiore del tubo.
   5. Caricare la striscia del tubo nei blocchi dello strumento LAMP, assicurando che i tappi siano sicuri prima di chiudere il coperchio.

Componente	Lavoro conc.	Reazione finale conc.	Volume per campione (μL)	Volume per 18 campioni (μL)	Volume per 10 campioni (μL)
Mix master isotermico ISO-001	1,67x	1x	15	270	150
Mix primer	30:	1x	2.5	45	25
Acqua di grado molecolare	N/D	N/D	5.5	99	55
Totale parziale mix master	N/D	N/D	23	414	230
Modello DNA	N/D	N/D	2	N/D	N/D

Tabella 3: Foglio di lavoro per la preparazione del mix di reazioni LAMP. La miscela di primer (10x) è preparata secondo la tabella 2 utilizzando soluzioni stock di primer elencate nella tabella 1.

4. CORSA LAMP

NOTA: Durante una corsa LAMP, le letture di fluorescenza vengono acquisite utilizzando il canale FAM. I valori da tempo a picco (T_max; min) sono determinati automaticamente dallo strumento per il punto di tempo in cui il rapporto di fluorescenza raggiunge il valore massimo della curva della velocità di amplificazione. Il T_m (°C) è la temperatura di fusione/ricottura del prodotto finale amplificato.

1. Fare clic sull'icona Esegui in alto a destra dello schermo e selezionare i blocchi contenenti strisce tubole per avviare l'esecuzione lamp.
2. Facoltativamente, mentre la reazione è in corso, toccare le schede Temperatura, Amplificazione e Ricottura per visualizzare le modifiche dinamiche di vari parametri durante l'esecuzione lamp.
3. Una volta completata l'esecuzione, toccare le schede Amplificazione e Ricottura per visualizzare le curve complete di amplificazione e ricottura e toccare la scheda Risultati per visualizzare i risultati.
4. Facoltativamente, per la registrazione, registrare il numero di esecuzione situato in alto a sinistra dello schermo, utilizzando il formato "numero di number_run seriale dello strumento", ad esempio "GEN2-2209_0030".

5. Interpretazione dei risultati lamp

NOTA: I risultati della LAMPADA possono essere visualizzati direttamente sul quadro strumenti LAMP e/o utilizzando un software LAMP(Table of Materials).

1. Per interpretare i risultati LAMP sul quadro strumenti, attenersi alla seguente procedura.
   1. Toccare l'icona Cartella in basso a sinistra della schermata iniziale e selezionare Registra per passare al percorso del file per caricare l'esecuzione lamp di interesse.
      NOTA: Le corse LAMP sono organizzate per data, a partire dall'anno.
   2. Osservare le cinque schede associate a ciascuna esecuzione: Profile, Temperature, Amplification, Anneale Results.
      NOTA: Le schede Profilo e Temperatura mostrano rispettivamente le temperature programmate ed effettive nei pozzi campione man mano che la reazione LAMP procede. Le schede Amplificazione e Ricottura mostrano letture di fluorescenza e cambiamenti nella fluorescenza rispettivamente durante le fasi di amplificazione e ricottura. Nella scheda Risultati viene visualizzata una visualizzazione tabulare dei risultati LAMP.
   3. Toccare la scheda Risultati per osservare i risultati LAMP per ogni pozzo.
      NOTA: Ci sono tre colonne (Pozzo, Amplificazione e Ricottura). La colonna "Amplificazione" mostra i valori da tempo a picco (T_max; min:sec) per ogni campione ("Pozzo") e la colonna "Ricottura" mostra le temperature di fusione/ricottura (T_m; °C) per qualsiasi prodotto amplificato in quel pozzo.
   4. Interpretare i risultati lamp e segnalare i risultati finali di LAMP come segue.
      1. Esaminare prima i pozzi di controllo. Il pozzo NTC dovrebbe avere T_{max vuoto} mentre T m_può essere vuoto (entrambi i modelli di strumenti LAMP) o < 83 °C (solo per il modello di strumento LAMP con due blocchi). Il pozzo di controllo positivo dovrebbe avere T_max tra 5 e 10 min e T_m intorno a 90 °C.
      2. Esaminare i pozzi campione. Tutti i campioni con il T_{m corretto} (circa 90 °C) e T _max (tra 5−30 min) sono considerati positivi per salmonella.
      3. Segnalare i risultati finali di LAMP in base ai risultati di esecuzioni duplicate. Se le esecuzioni duplicate hanno risultati coerenti, è possibile riportare i risultati finali di LAMP. Se le esecuzioni duplicate non sono coerenti, ripetere entrambe le esecuzioni in modo indipendente. Se i risultati sono ancora incoerenti, il campione dovrebbe essere considerato presunto positivo per la Salmonella e dovrà passare attraverso la conferma della coltura.
2. Per interpretare i risultati LAMP utilizzando il software, attenersi alla seguente procedura.
   1. Fate clic sull'icona Computer sul pannello sinistro e spostate verso il percorso del file per caricare l'esecuzione lamp di interesse.
      NOTA: Il computer con il software installato non deve essere collegato allo strumento LAMP per analizzare i risultati lamp, cioè è disponibile l'accesso remoto. Le corse LAMP sono organizzate per data.
   2. Osservare le sette schede associate a ciascuna esecuzione: Profile, Temperature, Amplification, Amplification Rate, Anneal, Anneal Derivativee Result.
      NOTA: Analogamente alla vista del quadro strumenti, le schede Profilo e Temperatura mostrano, rispettivamente, le temperature programmate ed effettive nei pozzi del campione, mentre la reazione LAMP procede. Le schede Amplificazione/Amplificazionee Derivata Ricottura/DerivataRicottura mostrano letture di fluorescenza o cambiamenti nella fluorescenza rispettivamente durante le fasi di amplificazione e ricottura. La scheda Risultati mostra una vista tabulare dei risultati LAMP che differiscono leggermente dalla vista del quadro strumenti.
   3. Toccare la scheda Frequenza amplificazione per visualizzare una visualizzazione grafica dei rapporti di fluorescenza in base al tempo. Fare clic sull'icona Impostazione in alto a destra dello schermo e regolare il "Peak Detection Threshold Ratio" da 0,020 a 0,010.
      NOTA: La regolazione è necessaria per garantire che tutti i picchi validi siano identificati e che i risultati ottenuti utilizzando il software corrispondano a quelli visualizzati sul quadro strumenti.
   4. Toccare la scheda Risultato per osservare i risultati LAMP per ogni pozzo.
      NOTA: sono disponibili quattro colonne (Nome grafico, Numero pozzo, Nome pozzo e Valore massimo). La parte superiore della colonna "Valore picco" mostra "Amp Time" (T_max; min:sec) per ogni campione ("Well Name") mentre la parte inferiore mostra "Derivata ricottura" (T_m; °C) per qualsiasi prodotto amplificato in quel pozzo.
   5. Interpretare i risultati LAMP e segnalare i risultati finali di LAMP seguendo passaggi simili a quelli dell'utilizzo del quadro strumenti con una sola eccezione che il pozzo NTC e altri campioni negativi dovrebbero avere T_m vuoto poiché le impostazioni del software LAMP eliminano quei risultati T_m < 83 °C. Allo stesso modo, tutti i campioni con T_m corretto (circa 90 °C) e T_max (tra 5−30 min) sono considerati positivi per salmonella.

Risultati

La figura 2 e la figura 3 mostrano grafici/tabelle LAMP rappresentativi visualizzati su entrambe le piattaforme. In questa corsa LAMP, i campioni da S1 a S6 sono diluizioni seriali 10 volte di S. enterica serovar Infantis ATCC 51741 che vanno da 1,1 x 10⁶ CFU a 11 CFU per reazione. Il controllo positivo è S. enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 (LT2) a 1,7 x 10⁴ CFU per reazione e NTC è acqua di grado molecolare.

Come illustrato nella figura 2E e nella figura 3G, sia i pozzi NTC che PC sono controlli validi. Il pozzo NTC ha T_{max vuoto} mentre T_m è < 83 °C sul quadro strumenti LAMP e vuoto nel software LAMP, suggerendo un risultato negativo. Il PC ha T _{max di} 7 min 45 sec e T m _di ~ 90 °C su entrambe le piattaforme, suggerendo un risultato positivo. I campioni da S1 a S6 hanno T_max tra 6 min 30 sec e 12 min 15 sec, tutti positivialla Salmonella.

A seguito di esecuzioni duplicate dello stesso set di campioni, vengono riportati i risultati finali di LAMP per questi campioni. Questa corsa LAMP rappresentativa mostra che LAMP rileva con successo salmonella con un'ampia gamma di concentrazioni nei campioni.

Figura 2: Risultati LAMP rappresentativi visualizzati sul quadro strumenti LAMP. (A) La scheda Profilo mostra il profilo di temperatura programmato. (B) La scheda Temperatura mostra le temperature effettive nei pozzi del campione mentre procede la reazione LAMP. (C) La scheda Amplificazione mostra le letture di fluorescenza durante l'amplificazione LAMP. (D) La scheda Ricottura mostra cambiamenti nella fluorescenza (derivata) durante la fase ricottura. (E) Nella scheda Risultati viene visualizzata una visualizzazione tabellare dei risultati lamp. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Risultati LAMP rappresentativi visualizzati nel software LAMP. (A) La scheda Profilo mostra il profilo di temperatura programmato. (B) La scheda Temperatura mostra le temperature effettive nei pozzi del campione mentre procede la reazione LAMP. (C) La scheda Amplificazione mostra le letture di fluorescenza durante l'amplificazione LAMP. (D) La scheda Velocità di amplificazione mostra variazioni della fluorescenza (rapporto di fluorescenza) durante l'amplificazione lamp. (E) La scheda Ricottura mostra le letture di fluorescenza durante la fase di ricottura. (F) La scheda Derivata ricottura mostra le variazioni della fluorescenza (derivata) durante la fase ricottura. (G) Nella scheda Risultato viene visualizzata una visualizzazione tabellare dei risultati lamp. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Abbiamo presentato qui un metodo LAMP semplice, rapido, specifico e sensibile per lo screening e la conferma della Salmonella negli alimenti animali e nella coltura pura, rispettivamente. Con la comodità di un mix master isotermico che contiene quattro reagenti chiave e un mix di primer pronto all'uso preparato internamente, l'assemblaggio di una reazione LAMP richiede solo pochi passaggi di pipettaggio(Figura 1). Il tempo totale di esecuzione, comprese le fasi di amplificazione e ricottura, è inferiore a 38 minuti(figura 2A, B e figura 3A,B). I risultati positivi sono monitorati tramite fluorescenza in tempo reale(Figura 2C e Figura 3C,D) e possono essere rilevati già a 5 min²⁶. La fase ricottura serve come ulteriore conferma della specificità lamp poiché solo i campioni con T_m corretto(circa 90 °C) sono riportati come positivi(Figura 2D, E e Figura 3E−G). In precedenza sono state segnalate sensibilità di 1 cellula salmonella in coltura pura e < 1 CFU/25 g negli alimenti per animali²⁶.

Poiché LAMP è abbastanza efficace e genera una grande quantità di DNA¹, è fondamentale che le migliori pratiche di laboratorio siano utilizzate per prevenire la contaminazione incrociata, che può includere la separazione fisica delle aree per la preparazione del mix principale LAMP e l'aggiunta di modelli di DNA, evitando di generare aerosol, utilizzando punte di pipetta filtrante, cambiando spesso i guanti e astenendosi dall'aprire i tubi di reazione LAMP dopo l'amplificazione.

La specificità di questo metodo Salmonella LAMP è stata precedentemente testata utilizzando 300 ceppi batterici (247 Salmonella di 185 sierovar e 53 nonSalmonella)e ha dimostrato di essere specifica al 100%²⁶. In particolare, sono state osservate differenze significative nella T_max tra le due specie di Salmonella, S. enterica e Salmonella bongori, e tra le sottospecie di S. enterica, in particolare la sottosp. Tuttavia, questi erano ancora validi risultati positivi secondo le regole per l'interpretazione dei risultati LAMP. Nel nostro studio collaborativo multi-laboratorio sul cibo secco per cani che ha coinvolto 14^{analisti 19}, sono stati occasionalmente osservati campioni con risultati incoerenti in esecuzioni LAMP duplicate. Questi di solito riguardavano campioni con risultati positiviritardati (T_max > 15 min). Ripetere entrambe le esecuzioni in modo indipendente di solito risolveva il problema. Più raramente, abbiamo osservato campioni con valori T_m correttima senza valori massimi T_irregolari (< 5 min). Questo di solito era causato da bolle d'aria nel tubo di reazione.

Durante tutto il ciclo di vita dello sviluppo del metodo LAMP, della valutazione, dello studio precollaborativo e della convalida multi-laboratorio, abbiamo osservato un'elevata tolleranza di LAMP agli inibitori in varie matrici animali o alimentari e mezzi di^{coltura 4,19,22,23,24,}evidenziando la robustezza del metodo e collaborando a numerosi altri studi su scala globale^8. Questo è superiore rispetto alla PCR o alla PCR in tempo reale, che di solito richiede un controllo interno dell'amplificazione per garantire che i risultati negativi non siano dovuti all'inibizione della^{matrice 28}. Inoltre, LAMP ha dimostrato una specificità e una sensibilità simili (o superiori) rispetto alla PCR o alla PCR in tempo reale nella stragrande maggioranza degli studi⁸. Il costo dei reagenti LAMP è di circa $ 1 per reazione. Gli strumenti LAMP utilizzati in questo protocollo sono piccoli, a bassa manutenzione e portatili. Sono in grado di gestire qualsiasi metodo di amplificazione isotermica che utilizza il rilevamento del bersaglio mediante misurazione della fluorescenza, LAMP incluso. Utilizzando il software LAMP, è possibile generare report completi in più formati (pdf, testo e immagine).

La convalida del metodo è un passaggio critico prima che un nuovo metodo possa essere adottato per l'uso di routine. È da notare che il protocollo LAMP qui riportato ha completato con successo la convalida multi-laboratorio¹⁹. Con la recente incorporazione di questo protocollo LAMP nel BAM Chapter 5 Salmonella²⁷della FDA degli Stati Uniti, si prevede che il metodo o guadagnerà un uso molto più ampio, sia come metodo di screening rapido negli alimenti animali che come metodo di conferma affidabile per presunti isolati di Salmonella da tutte le categorie alimentari.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain heart infusion (BHI) broth	BD Diagnostic Systems, Sparks, MD	299070	Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella.
Buffered peptone water (BPW)	BD Diagnostic Systems, Sparks, MD	218105	Preenrichment medium for the recovery of Salmonella from animal food samples.
DNA AWAY	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	7010	Eliminates unwanted DNA and DNase from laboratory bench, glassware, and plasticware without affecting subsequent DNA samples.
Genie Explorer software	OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom	Version 2.0.6.3	Supports remote operation of Genie instruments including LAMP runs and data analysis.
Genie II or Genie III (LAMP instrument)	OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom	GEN2-02 or GEN3-02	A small instrument capable of temperature control up to 100 °C with ± 0.1 °C accuracy and simultaneous fluorescence detection via the FAM channel. Genie II has 2 blocks (A and B) with 8 samples in each block. Genie III has a single block that accommodates 8 samples.
Genie strip	OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom	OP-0008	8-well microtube strips with integral locking caps and a working volume of 10 to 150 µl.
Genie strip holder	OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom	GBLOCK	Used to hold Genie strips when setting up a LAMP reaction, the aluminum holder can also be used as a cool block.
Hydrochloric acid (HCl) solution, 1 N	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	SA48-500	Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment.
Heat block	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	88-860-022	Heats samples at 100 ± 1 oC for DNA extraction.
Incubator	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	3960	Standard laboratory incubator.
ISO-001 isothermal master mix	OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom	ISO-001	An optimized master mix to simplify the assembly of a LAMP reaction, containing a strand-displacing GspSSD DNA polymerase large fragment from Geobacillus spp., thermostable inorganic pyrophosphatase, reaction buffer, MgSO4, dNTPs, and a double-stranded DNA binding dye (FAM detection channel).
Isopropanol	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	A416	Disinfects work surfaces.
LAMP primers	Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA	Custom	LAMP primers with detailed information in Table 1.
Microcentrifuge	Eppendorf North America, Hauppauge, NY	22620207	MiniSpin plus personal microcentrifuge.
Microcentrifuge tubes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	05-408-129	Standard microcentrifuge tubes.
Molecular grade water	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	AM9938	Used in making primer stocks, primer mix, and LAMP reaction mix.
Sodium hydroxide (NaOH) solution, 1 N	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	SS266-1	Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment.
Nonselective agar (e.g., blood agar, nutrient agar, and trypticase soy agar)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	R01202	Solid growth medium used in the cultivation of Salmonella.
Peptone water	BD Diagnostic Systems, Sparks, MD	218071	Dilutes overnight Salmonella cultures to make positive control DNA.
Pipettes and tips	Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CA	Pipet Lite LTS series	Standard laboratory pipettes and tips.
PrepMan Ultra sample preparation reagent	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	4318930	A simple kit used for the rapid preparation of DNA templates for use in a LAMP reaction.
Salmonella reference strain LT2	ATCC, Manassas, VA	700720	Salmonella reference strain used as positive control.
Trypticase soy broth (TSB)	BD Diagnostic Systems, Sparks, MD	211768	Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella.
Vortex mixer	Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY	SI-0236	Standard laboratory vortex mixer.
Whirl-pak filter bag	Nasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WI	B01318	Filter bags to hold animal food samples for preenrichment.