Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف هذه الورقة عزلة واستزراع الخلايا العصبية المتعاطفة مع الفئران الجنينية من العقدة العنقية المتفوقة. كما يوفر بروتوكولات مفصلة للتلوين المناعي الكيميائي وإعداد مقتطفات الخلايا العصبية لتحليل الطيف الشامل.

Abstract

وقد استخدمت الخلايا العصبية المتعاطفة من ganglia عنق الرحم الجرذان الجنينية متفوقة (SCG) كنظام نموذج في المختبر للخلايا العصبية الطرفية لدراسة نمو محور عصبي، والاتجار المحوري، synaptogenesis، والنمو التشعب، واللدونة التشعب والتفاعلات العصبية الهدف في أنظمة الثقافة المشتركة. يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا العصبية وتفككها عن العقدة العنقية المتفوقة من أجنة الفئران E21 ، يليها إعداد وصيانة الثقافات العصبية النقية في وسط خال من المصل. منذ الخلايا العصبية لا تلتزم البلاستيك غير المصقول, وسوف تكون الخلايا العصبية المستزرعة على إما 12 مم الزجاج يغطي أو 6-لوحات جيدا المغلفة بولي-د-ليسين. بعد العلاج مع عامل مضاد للتشنج (Ara-C, cytosine β-D-arabinofuranoside), هذا البروتوكول يولد الثقافات العصبية صحية مع أقل من 5% غير الخلايا العصبية, والتي يمكن الحفاظ عليها لأكثر من شهر في المختبر. على الرغم من أن الخلايا العصبية SCG الفئران الجنينية هي متعددة الأقطاب مع 5-8 dendrites في الجسم الحي; تحت شروط المصل خالية، هذه الخلايا العصبية تمتد فقط محور عصبي واحد في الثقافة وتستمر لتكون أحادية القطب لمدة الثقافة. ومع ذلك، يمكن أن تكون هذه الخلايا العصبية التي تسببها لتمديد dendrites في وجود استخراج غشاء الطابق السفلي، البروتينات مورفوجينيك العظام (BMPs)، أو 10٪ مصل عجل الجنين. ويمكن استخدام هذه الثقافات العصبية المتجانسة لتلطيخ المناعة الكيميائية والدراسات الكيميائية الحيوية. تصف هذه الورقة أيضا بروتوكول الأمثل للتلوين المناعية الكيميائية للmicrotubule البروتين المرتبطة-2 (MAP-2) في هذه الخلايا العصبية وإعداد مستخلصات الخلايا العصبية لقياس الطيف الشامل.

Introduction

الخلايا العصبية المتعاطفة المستمدة من العقدة الجنينية متفوقة عنق الرحم (SCG) وقد استخدمت على نطاق واسع كنظام ثقافة الخلايا العصبية الأولية لدراسة العديد من جوانب التنمية العصبية بما في ذلك الاعتماد على عامل النمو، العصبية الهدف التفاعلات، إشارات العصبي، نمو محور عصبي، التنمية dendrite واللدونة، synaptogenesis وآليات إشارة الكامنة العصبية الهدف / العصبية- التفاعلاتglia 1،2،3،4،5،6،7،8،9.5 على الرغم من صغر حجمها (حوالي 10000 الخلايا العصبية / ganglia), هناك ثلاثة أسباب رئيسية لتطوير واستخدام واسع النطاق من هذا النظام الثقافة هي ط) كونها العقدة الأولى في سلسلة متعاطفة, هم أكبر, وبالتالي أسهل لعزل, من بقية ganglia متعاطفة10; ii) على عكس الخلايا العصبية المركزية، والخلايا العصبية في SCG متجانسة إلى حد ما مع جميع الخلايا العصبية التي تستمد من قمة العصبية، وجود حجم مماثل، والاعتماد على عامل نمو الأعصاب ويجري ولا-adrenergic. وهذا يجعلها نموذجا قيما للدراسات المورفولوجية والمجينية10و11 و 3) يمكن الحفاظ على هذه الخلايا العصبية في وسيط محدد خال من المصل يحتوي على عامل نمو الأعصاب لأكثر من شهر10,12. وقد استخدمت الخلايا العصبية SCG ما حول الولادة على نطاق واسع لدراسة الآليات الكامنة في بدء وصيانة dendrites2. ويرجع ذلك أساسا إلى أنه على الرغم من أن الخلايا العصبية SCG لديها arbor تسخين واسعة النطاق في الجسم الحي، فإنها لا تمتد التشعبات في المختبر في غياب المصل ولكن يمكن أن يكون السبب في نمو dendrites في وجود عوامل نمو معينة مثل بروتينات العظام موروجينيك2،12،13.

هذه الورقة يصف بروتوكول لعزل واستزراع الخلايا العصبية SCG الفئران الجنينية. على مدى السنوات ال 50 الماضية، استخدمت الثقافات العصبية الأولية من SCG أساسا للدراسات المورفولوجية مع عدد محدود من الدراسات التي تدرس التغيرات الجينومية أو البروتيومية واسعة النطاق. ويرجع ذلك أساسا إلى صغر حجم الأنسجة مما أدى إلى عزل كميات منخفضة من الحمض النووي أو البروتين، مما يجعل من الصعب إجراء التحليلات الجينومية والبروتيومية على هذه الخلايا العصبية. ومع ذلك، في السنوات الأخيرة، زادت حساسية الكشف قد مكنت من تطوير أساليب لدراسة الجينوم، miRNome والبروتيوم في الخلايا العصبية SCG خلال التنمية النمو التشعب14،15،16،17. هذه الورقة سوف تصف أيضا طريقة للتحليل المورفولوجي لهذه الخلايا العصبية باستخدام الكيمياء المناعية وبروتوكول للحصول على مستخلصات البروتين العصبي لتحليل الطيف الشامل.

Protocol

وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في كلية سانت ماري في كاليفورنيا على جميع الإجراءات التي أجريت في الدراسات التي تشمل الحيوانات. وقد وضعت المبادئ التوجيهية لرعاية الحيوانات واستخدامها في كلية سانت ماري استنادا إلى المبادئ التوجيهية التي قدمها مكتب رعاية الحيوان المختبري في المعهد الوطني للصحة (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf).

1- إعداد وسائط الإعلام الثقافية (يُشار إليها أيضاً بوسيلة التحكم)

  1. إضافة المكونات التالية، بالترتيب المذكور أدناه، إلى قارورة معقم 500 مل: 190 مل من 1x DMEM منخفضة الجلوكوز، 10 مل من 20 ملغ/مل الأحماض الدهنية خالية من الأحماض البوفينية المصل الألبومين (FAF-BSA) في DMEM، 2.8 مل من 200 مل L-الجلوتامين, 4 مل من 100x الأنسولين-السيلينيوم-transferrin خليط, 0.4 مل من 125 ميكروغرام/ مل عامل نمو الأعصاب (في 0.2% مثبت البروتين الخامل في DMEM), و 200 مل من F-12 متوسطة لحم الخنزير.
  2. تأكد من أن معطف الماصة مع المتوسطة التي تحتوي على FAF-BSA قبل إضافة حلول تحتوي على البروتين مثل الأنسولين-السيلينيوم-transferrin وNGF لمنع الالتصاق البروتينات إلى ماصة.
  3. دوامة قارورة لخلط المكونات بعد كل إضافة. اخلطي جيدا مع ماصة 25 مل بعد إضافة F-12.
  4. Aliquot وسائل الإعلام الثقافة في 10 مل aliquots وتخزينها في -80 درجة مئوية. ويمكن تخزين aliquots لمدة ستة أشهر دون فقدان النشاط.

2. إعداد لوحات ل الخلايا العصبية زراعة

  1. تخفيف مخزون 1 ملغ / مل من بولي دي ليسين (المحرز في 0.5 M تريس العازلة، درجة الH 8) إلى 100 ميكروغرام / مل مع الماء المقطر العقيمة.
  2. لتحليل البروتيوم أو الجينوم، قبل يوم إلى يومين من تشريح، معطف 6-صحن مع ما يقرب من 2 مل من العقيمة 100 غرام / مل من بولي دي ليسين (PDL). وهذا ضروري لضمان التصاق الخلية إلى البئر. التفاف لوحات مع فيلم التشبث وتخزين لوحات بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
  3. للتحليل المورفولوجي والمجهر، ضع 12 مم2 غطاء الزجاج الألماني المعالج مسبقا (والتي يمكن تنظيفها باستخدام العلاج بحمض النيتريك كما هو موضح سابقا18 أو شراؤها) في كل بئر من ألواح 24 جيدا.
    1. معطف الأغطية مع 0.3 مل من العقيمة 100 غرام / مل من بولي دي ليسين (PDL). تخزين لوحات بين عشية وضحاها في 4 °C.
  4. في يوم التشريح ، قبل بدء التشريح ، قم بإزالة محلول بولي دي ليسين من الآبار وشطف الآبار خمس مرات بالماء المقطر العقيم ، يليه مرة واحدة مع انخفاض الجلوكوز DMEM.
  5. خلال الهضم الأنزيمي لل ganglia (حوالي ساعة قبل طلاء الخلايا) ، يُشعّر DMEM من اللوحات ويستبدله بـ 0.3 مل من وسائل الإعلام المسيطرة. تخزين لوحات في 35.5 درجة مئوية تحت 5٪ CO2 في غرفة مرطبة.

3. إعداد تشريح

  1. إعداد 200 مل من وسائل الإعلام للتشريح (يشار إليها باسم وسائل الإعلام تشريح)
    1. إضافة 8 مل من 20 ملغ / مل الأحماض الدهنية خالية من الأحماض البقرية المصل الألبومين (FAF-BSA) في DMEM منخفضة الجلوكوز (مع 1 ملغ / مل الجلوكوز) و 2 مل من 100x بينسلين شتربتوميسين إلى 193 مل من Leibovitz العقيمة L-15 المتوسطة (أو أي وسيط عازلة الهواء)
  2. في غطاء محرك السيارة، وإعداد العناصر التالية للتشريح: أربعة أنابيب مخروطية معقم 50 مل مع حوالي 20 مل من وسائل الإعلام تشريح في كل أنبوب، وأربعة أطباق معقمة 35 ملم مع 1.5 مل من وسائل الإعلام تشريح، واحد عقيم 50 مل أنبوب مخروطي مع 20 مل من وسائل الإعلام تشريح للطرد المركزي، واحد عقيم 15 مل أنبوب مخرون لcontrifuging ، واحد أنبوب 10 مل عقيم لجمع الخلايا المنفصلة.
  3. استخدام معقم الخرز الجاف لتعقيم زوج من ملقط غرامة (no.4 أو لا. 5 ملقط) لمدة دقيقة واحدة على الأقل.

4. عزل العقدة العنقية المتفوقة عن الجراء الجنينية

  1. إزالة الأجنة E21 من الفئران الحامل
    ملاحظة: يمكن إجراء إزالة قرن الرحم خارج غطاء محرك السيارة إذا تم تعقيم المنطقة المحيطة بها بشكل دقيق.
    1. القتل الرحيم الفئران الحامل باستخدامCO 2 استنشاق. القص الفراء من منطقة البطن ومسح الجلد في المنطقة مع 70٪ الكحول لتعقيمه.
    2. باستخدام مجموعة جديدة من مقص معقمة ملقط، وقطع من خلال الجلد ومن ثم طبقة العضلات لفضح قرون الرحم التي تحتوي على الأجنة. إزالة قرون الرحم مع الأجنة باستخدام مجموعة جديدة من مقص ملقط، مع الحرص على عدم تلف الأمعاء في هذه العملية.
    3. نقل قرون الرحم مع الأجنة في 150 مم2 طبق بيتري عقيمة ونقلها إلى غطاء محرك السيارة.
    4. باستخدام مجموعة جديدة من ملقط ومقص، إزالة الأجنة من قرن الرحم وفصل الأجنة من الأغشية السلوية والمشيمة.
    5. القتل الرحيم الأجنة، وقطع الحبل الشوكي من الأجنة على طول خط الوسط تحت الذراع اليمنى. وهذا سوف يقلل أيضا من نزيف من الشريان السباتي أثناء إزالة SCG.
    6. نقل هذه الأجنة في أنابيب مخروطية 50 مل أعدت تحتوي على وسائل الإعلام تشريح. تأكد من أن الأجنة مغمورة في وسائل الإعلام. يمكن لكل أنبوب أن يحمل ما يصل إلى 3 أجنة.
  2. عزل العقدة العنقية المتفوقة عن الجنين
    1. نقل جرو واحد من وسائل الإعلام تشريح على طبق معقمة 150 مم2 بيتري نصف مليئة الركيزة الصلبة (إما الشمع البارافين أو سيليكون بوليمر)، مع سطحها الظهرية على الركيزة. باستخدام ثلاث إبر معقمة 23 G، دبوس الجرو إلى الطبق مع إبرة واحدة تحت كل ذراع وإبرة ثالثة من خلال الفم لفرط الرقبة بعناية.
    2. قطع من خلال الجلد في منطقة الرقبة باستخدام ملقط غرامة معقمة (رقم 4 أو لا. 5 ملقط) لفضح الغدد اللعابية تحت. إزالة هذه الغدد باستخدام ملقط غرامة.
    3. حدد موقع عضلات ستروموكلويد وomohyoid بالقرب من الترقوة والقصبة الهوائية، على التوالي. قطع أولا عضلات sternocleidomastoid عرضية ثم قطع بعناية العضلات رقيقة omohyoid باستخدام ملقط غرامة. وبمجرد إزالة هذه العضلات، فإن التشعب في الشريان السباتي على الطرف الأمامي تكون مرئية على جانبي القصبة الهوائية، مع SCG تقع تحت هذه الشوكة في الشريان السباتي.
    4. باستخدام ملقط مغلقة، رفع بلطف الشريان السباتي لتصور SCG. باستخدام ملقط واحد على جانبي SCG، اسحب السباتي ونقله إلى أطباق 35 ملم المعقمةالمعدة. هذا النسيج سوف تحتوي على الأرجح SCG مع الشريان السباتي, العصب المبهم مع ganglia الإيماءة وكذلك أجزاء أخرى من العضلات أو الدهون في المنطقة.
    5. كرر عملية التشريح على الجانب الآخر. إزالة SCGs من جميع الأجنة قبل الاستمرار في خطوات التشريح المتبقية المبينة أدناه. توزيع الأنسجة المعزولة بين اثنين من 35 مم2 أطباق لتسهيل تجهيز عينات الأنسجة.
  3. بعد تجهيز SCG
    1. لفصل SCG عن الأنسجة التشريحية ، استخدم أولاً ملقطًا ناعمًا لإزالة أي أنسجة دخيلة ، مثل الدهون أو العضلات ، مع الحرص على تجنب المنطقة القريبة من التشعب السباتي.
    2. بمجرد إزالة هذه الأنسجة ، اثنين من ganglia مرئية. العقدة الإيماءة أصغر حجماً ودائرية، في حين أن SCG على شكل اللوز. سحب بلطف على العصب المبهم لفصل العصب المبهم وgdose ganglia من السباتي ومن ثم فصل SCG من الشريان السباتي.
    3. استخدم ملقطًا ناعمًا لإزالة الكبسولة التي تحيط بـ SCG. نقل SCG إلى طبق جديد ثقافة 35 ملم. كرر العملية مع جميع عينات الأنسجة تشريح.
    4. معطف مُصّة زجاجية مُعقمة، قطنية موصولة مع وسائلُ تسلخ لمنع الأنسجة من التمسك بجدران الماصات. استخدام ماصة لاستبدال وسائل الإعلام تشريح مع عقيمة 2 مل من نوع Collagenase الثاني (1 ملغ / مل) / dispase نوع الثاني (5 ملغ / مل) في الكالسيوم والمغنيسيوم خالية من HBSS، واحتضان لمدة 50 دقيقة في 37 درجة مئوية للمساعدة في كسر الأنسجة.
      ملاحظة: قد يحتاج وقت الحضانة إلى تحسين مع دفعات مختلفة من Collagenase/Dispase ويتراوح عادة من 40 دقيقة إلى ساعة.
    5. أثناء الحضانة، وpirem DMEM من لوحات واستبداله مع 0.3 مل من وسائل الإعلام التحكم. تخزين لوحات في 35.5 درجة مئوية تحت 5٪ CO2 في غرفة مرطبة.
    6. بعد الحضانة، نقل SCGs في الكولاجين/ dispase إلى أنبوب مخروطي معقم 15 مل. استخدام وسائل الإعلام تشريح لشطف لوحات ونقل الحل إلى أنبوب. إضافة ما يكفي من وسائل الإعلام تشريح لإحضار ما يصل حجم إلى ما يقرب من 10 مل.
    7. أجهزة الطرد المركزي عند 200 × ز (1000 - 1200 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ل بيليه العينة. الطامح المابير، مع الحرص على عدم طرد بيليه. Resuspend بيليه مع 10 مل من وسائل الإعلام تشريح. كرر الطرد المركزي وتجاهل المابير.
    8. استبدال مع 1 - 2 مل من الثقافة المتوسطة. باستخدام ماصة البسترة الضيقة الاضاءة ذات الوثنية (المغلفة مسبقًا بوسيط الثقافة) ، افصل الكتل ميكانيكيًا عن طريق التتريك بلطف 5-6 مرات. دع الكتل الأكبر تستقر لمدة دقيقة واحدة تقريباً نقل تعليق الخلية فائقة إلى أنبوب جديد 10 مل.
    9. كرر هذه العملية 3 مرات أكثر، مع زيادة قوة التثاقل في كل مرة لضمان تفكك كامل تقريبا من SCGs. نقل افرا بعد كل جولة من التثاقل إلى أنبوب 10 مل مع افرط من التثاب الأول.
    10. إضافة ما يكفي من وسائل الإعلام الثقافة لإحضار وحدة التخزين إلى 8 - 10 مل. خلط بلطف تعليق الخلية وقياس كثافة الخلية مع قياس الهيموسيت.
    11. توزيع تعليق الخلية في الآبار في كثافة الخلايا المناسبة للتجارب. اخلطي تعليق الخلية باستمرار أثناء عملية الطلاء لضمان التوزيع حتى للخلايا في الآبار.
      ملاحظة: بالنسبة للتحليل المورفولوجي، قم بلوحة الخلايا حول 8000 خلية/بئر في 24 بئرًا وللبروتوكولات الجينومية والبروتومية، صفي الخلايا التي يصل ارتفاعها إلى 30,000 خلية/بئر.
    12. نقل لوحات إلى مجفف الزجاج مع الماء المعقم في الجزء السفلي لإنشاء غرفة مرطبة. حقن ما يكفي من CO2 (حوالي 120 مل) للحصول على 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 البيئة في desiccator، قبل الختم. الحفاظ على لوحات في 35.5 درجة مئوية. ويشار إلى هذا اليوم 0 في البروتوكول.
      ملاحظة: يمكن أيضا الحفاظ على هذه اللوحات في حاضنة CO2 العادية 5٪ . الطريقة المذكورة أعلاه يقلل من درجة الحرارة ودرجة الحرارة التغيرات ويساعد أيضا على منع التلوث المتبادل.

5. صيانة الخلايا العصبية SCG مثقف والعلاجات

  1. في اليوم 1 (24 ساعة بعد الطلاء) ، وإزالة بعناية نصف وسائل الإعلام الثقافة ، واستبدالها ب2 μM Ara-C (cytosine β - D - arabinofuranoside ، وهو عامل مضاد للميتوتيك). ترك العلاج على الخلايا لمدة 48 ساعة. عادة، هذا الطول من العلاج يكفي للقضاء على الخلايا غير العصبية في الثقافة.
  2. في اليوم الثالث، يُشعّر نصف الوسط بلطف ويُستعاض عنه بوسيلة التحكم.
  3. في اليوم الرابع، تكون الخلايا جاهزة للعلاج التجريبي. تغذية الثقافات كل يومين مع وسيلة مناسبة، استبدال بلطف نصف المتوسطة في البئر مع المتوسطة الطازجة.
  4. الخلايا العصبية SCG المستزرعة في المتوسطة خالية من المصل تمتد فقط محاور. إذا كانت التجارب تتطلب وجود dendrites، علاج الخلايا مع مصل العجل الجنينية 10٪، 75-100 ميكروغرام / مل من استخراج مصفوفة غشاء الطابق السفلي أو 50 نانوغرام / مل من البروتين مورفوجيني العظام-7. ويلاحظ نمو التشعب في غضون 48 ساعة من العلاج مع arbor متشعب وضع لوحظ في غضون أسبوع من العلاج.

6. الخلايا العصبية SCG المستزرعة التي تحتوي على المناعة

  1. استبدال تدريجيا متوسطة ثقافة الخلية في البئر مع 4٪ شبهformaldehyde في 0.1 M الفوسفات العازلة، وhH 7.2 في غطاء الدخان.
    1. إزالة نصف وسائل الإعلام الثقافة في البئر واستبدالها بلطف مع 4٪ شبهformaldehyde. ثم، كرر العملية مرتين على الأقل، وإزالة ثلثي وسائل الإعلام في البئر في كل مرة واستبدالها بنسبة 4٪ شبه شكلي. في نهاية هذه العملية، كان يجب أن يتغير لون الوسائط في البئر من الوردي إلى عديم اللون.
    2. مرة واحدة تم استبدال كل المتوسطة بنسبة 4٪ شبهformaldehyde، احتضان الآبار لمدة 15-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  2. مع عملية مماثلة كما هو موضح أعلاه، تدريجيا استبدال حل شبهformaldehyde 4٪ مع المالحة الفوسفات المخزنة (PBS)، وhH 7.2. اترك لمدة 5 دقائق. شطف الآبار مرتين أكثر لمدة 5 دقائق مع كل برنامج تلفزيوني.
    1. وبمجرد إزالة 4٪ paraformaldehyde، نقل لوحات إلى benchtop لمزيد من المعالجة. هذه الخطوة هي نقطة توقف جيدة حيث يمكن تخزين لوحات في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  3. إزالة كل برنامج تلفزيوني. إضافة ما يكفي من حجم 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لتغطية الخلايا. اتركه على الثقافات لمدة 5 دقائق لـ permeabilize الخلايا العصبية. توقيت هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية لضمان تلطيخ جيدة مع الحفاظ على سلامة الخلايا.
  4. قم بإزالة محلول Triton X-100 بعناية وشطف الآبار ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة باستخدام PBS. إزالة حل PBS.
  5. أضف ما يكفي من 5٪ BSA في برنامج تلفزيوني لتغطية الخلايا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة للحد من ربط الأجسام المضادة غير محددة.
  6. إزالة حل حظر واستبداله مع جسم مضاد أحادي النسيلة الماوس ضد بروتين MAP-2 المخفف في 5٪ BSA في برنامج تلفزيوني. اترك الجسم المضاد الأساسي على الخلايا بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
  7. إزالة وحفظ الأجسام المضادة الأساسية لإعادة استخدامها. يمكن إعادة استخدام الأجسام المضادة الأولية مرتين على الأقل دون فقدان كثافة الكشف.
  8. شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ما يكفي لتغطية الخلايا. ترك برنامج تلفزيوني على الخلايا لمدة 10 دقائق لكل شطف.
  9. إزالة حل PBS واستبداله مع الفلورسنت العلامة مترافق الماعز المضادة للماوس IgG الأجسام المضادة الثانوية في 1:1000 تخفيف في 5٪ BSA في برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 2 ساعة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
  10. إزالة الأجسام المضادة الثانوية واستبدالها مع برنامج تلفزيوني. شطف الآبار ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق لكل شطف. شطف الآبار مرة واحدة بالماء لإزالة أي أملاح.
  11. قم بتركيب الأغطية على الشرائح الزجاجية التي تحتوي على قطرة من الماونت المائية المناسبة للعينات ذات التسمية الفلورية. تخزين الشرائح في 4 درجة مئوية، في مجلد الشرائح حتى جاهزة للتصوير.

7- إعداد العينة لتحليل البروتيوم باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة مقرونة بالمسح الطيفي الكتلي

  1. تحلل الخلايا العصبية المستنمِكة
    1. قم بإزالة جميع وسائل الإعلام الثقافية بلطف في الآبار. استبدله بالكالسيوم البارد العقيم والماجنزيوم الخالي من الفوسفات (PBS)، 7.4 pH. إزالة بسرعة واستبدالها مع برنامج تلفزيوني والسماح لها الجلوس لمدة 5 دقائق. يتم إجراء هذه الخطوة لإزالة أي بروتينات موجودة في وسائل الإعلام الثقافة.
    2. إزالة بعناية كل برنامج تلفزيوني من جميع الآبار لعلاج معين. كرر العملية مرة أخرى. الحفاظ على لوحات فوق الجليد عند التحلل الخلايا لتقليل تلف الخلايا العصبية وتحلل البروتي.
    3. إضافة 100 - 150 ميكرولتر من 50 mM بيكربونات، pH 7.5 (NH4HCO3)إلى واحدة من الآبار وكشط الخلايا باستخدام مكشطة خلية معقمة. باستخدام ميكروريبيت، نقل السائل وتكرار عملية الكشط مع جميع الآبار لعلاج معين. فحص الآبار تحت المجهر بعد كشط للتأكد من أن معظم الخلايا قد أزيلت.
      1. مع انخفاض عدد الخلايا العصبية، واستخدام حجم محدود لlyse الخلايا لضمان تركيز عالية بما فيه الكفاية لتحليل البروتيوم.
    4. تجميد الحل في -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها للمساعدة في تحلل الخلية. ويمكن تخزين lysates في هذه المرحلة حتى جاهزة لمزيد من المعالجة.
    5. بمجرد إذابة، بخ العينات من خلال حقنة مع إبرة 26 G أو 28 G لميكانيكيا lyse الخلايا.
    6. سونيكات العينات في حمام المياه sonicating مرتين لمدة 10 دقائق. إضافة الثلج إلى حمام الماء لمنع ارتفاع درجة الحرارة والتشبع بالبروتينات. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية عند 12000 x g.
    7. قياس تركيز البروتين. تتراوح تركيزات البروتين النموذجية من 0.4 - 1 ميكروغرام/ميكرولتر
  2. إعداد العينة والهضم التربسين لتحليل البروتيوم
    1. نقل بحد أقصى 60 ميكرولتر من اللسات أو 50 ميكروغرام من البروتين إلى أنبوب 1.5 مل خالية من الـ DNase وRNase وprotease. إذا كان حجم lysate أقل من 60 ميكرولتر، إضافة ما يكفي 50 mM بيكربونات الأمونيوم لتعويض حجم.
    2. إضافة 25 μL من 0.2٪ حمض اضمب السطحي ودوامته. احتضان الأنبوب في سخان كتلة في 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 12،000 س ز لمدة 30 s.
    3. إضافة 2.5 μL من 100 mm dithiothreitol ودوامة. وهذا يجعل البروتين أكثر سهولة للحصول على الألكليل والهضم. احتضان الأنبوب في 60 درجة مئوية في سخان كتلة لمدة 30 دقيقة. بارد لدرجة حرارة الغرفة والطرد المركزي.
    4. إضافة 2.5 μL من 300 mM iodoacetamide إلى العينة ودوامة. هذه الخطوة تساعد على alkylate السيستينات ويمنعهم من إصلاح الروابط كبريتيد. احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة.
    5. إضافة التربسين درجة قياس الطيف الشامل (0.5 ميكروغرام/ميكرولتر) إلى الأنبوب في التربسين: نسبة البروتين 1:10. اجسّد العينات عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    6. إضافة 10 ميكرولتر من 5٪ حمض ثلاثي الفلوراستيك (TFA) ودوامة. احتضان العينات في 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. هذه الخطوة ضرورية لhylyze السطحي لابل حمض لمنع التداخل أثناء القياس الطيفي الشامل.
    7. الطرد المركزي العينات في 12000 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ونقل فائقة إلى قارورة الزجاج معتمدة الكروموغرافيا واضحة مع قبل شق تفلون / سيليكون قبعات الحاجز. يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية قبل تحليل قياس الطيف الشامل.
    8. اخضاع قوارير العينة لوني سائل مقرونة مع قياس الطيف الكتلي عالي الوضوح.

النتائج

عزل والحفاظ على الثقافات العصبية من الخلايا العصبية SCG الجنينية
تم طلاء الخلايا المنفصلة من SCG الجنينية الفئران في لوحة مغلفة بـ Poly-D-lysine أو coverlip ومصانة في وسائل الإعلام للثقافة الحرة في المصل التي تحتوي على عامل نمو الأعصاب ب. الخلايا المنفصلة التي تحتوي على خليط من الخلايا العص...

Discussion

هذه الورقة تصف بروتوكولات لاستزراع الخلايا العصبية المتعاطفة من ganglia عنق الرحم متفوقة من الجراء الفئران الجنينية. مزايا استخدام هذا النظام النموذجي هي أنه من الممكن الحصول على مجموعة متجانسة من الخلايا العصبية توفير استجابة مماثلة لعوامل النمو، وبما أن متطلبات عامل النمو لهذه الخلايا ا?...

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل من قبل صندوق تطوير الكلية وبرنامج البحوث الصيفية منحة في كلية سانت ماري في كاليفورنيا. كما يود المؤلفان أن يشكرا الدكتورة باميلا لين في جامعة كاليفورنيا في ديفيس والدكتور أنتوني ايافارون في مرفق قياس الطيف الشامل في جامعة كاليفورنيا بيركلي على نصائحهم أثناء تطوير هذه البروتوكولات. كما يود المؤلفان أن يشكرا هالي نيلسون في مكتب الاتصالات الجامعية في كلية سانت ماري في كاليفورنيا على مساعدتها في إنتاج الفيديو وتحريره.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2D nanoACQUITYWaters Corporation
Ammonium bicarbonateSigma-Aldrich9830
BMP-7R&D Systems354-BP
Bovine Serum AluminSigma-Aldrich5470
Cell scraperCorningCLS-3010
CollagenaseWorthington Biochemical4176
Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture platesFisher Scientific07-200, 140675, 142475
Cytosine- β- D-arabinofuranosideSigma-AldrichC1768
D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free)ATCC30-2200
Dispase IIRoche4942078001
Distilled WaterThermo Fisher Scientific15230
DithiothreitolSigma-AldrichD0632
DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvateThermo Fisher Scientific11885
Fatty Acid Free BSACalbiochem12660920 mg/mL stock in low glucose DMEM
Fine forceps Dumont no.4 and no.5Ted Pella Inc5621, 5622
Forceps and Scissors for DissectionTed Pella Inc1328, 1329, 5002
Glass coverlips - 12mmNeuvitro CorporationGG-12
Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugatedThermo Fisher ScientificA32723
Ham's F-12 Nutrient MixThermo Fisher Scientific11765
Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free)Thermo Fisher Scientific14185
Insulin-Selenium-Transferrin (100X)Thermo Fisher Scientific41400-045
IodoacetamideSigma-AldrichA3221
L-GlutamineThermo Fisher Scientific25030
Leibovitz L-15 mediumThermo Fisher Scientific11415064
Mounting media for glass coverslipsThermo Fisher ScientificP36931, P36934
Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52)BioLegendSMI 52
Nerve growth factorEnvigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts)BT5017Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM
ParaformaldehyeSpectrum ChemicalsP1010
Penicillin-Streptomycin (100X)Thermo Fisher Scientific15140
Poly-D-LysineSigma-AldrichP0899
PrionexMillipore52960010% solution, 100 mL
RapiGest SFWaters Corporation1860018615 X 1 mg
Synapt G2 High Definition Mass SpectrometryWaters Corporation
Trifluoro acetic acid - Sequencing gradeThermo Fisher Scientific2890410 X 1 mL
Triton X-100Sigma-AldrichX100
TrypsinPromega or NEBV511A, P8101S100 μg or 5 X 20 mg
Waters Total recovery vialsWaters Corporation186000385c

References

  1. Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture. Journal of Cell Biology. 9, (1976).
  2. Chandrasekaran, V., Lein, P. J. Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons. Autonomic Nervous System. , (2018).
  3. Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. Mechanisms of neuronal polarity. Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).
  4. Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).
  5. Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).
  6. Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons. Developmental Biology. 161 (1), 96-106 (1994).
  7. Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlström, A. Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons. Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).
  8. Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. , 176-189 (2017).
  9. Wingerd, K. L., et al. α4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).
  10. Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M., Banker, G., Goslin, K. Tissue culture of autonomic neurons. Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).
  11. Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).
  12. Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. Developmental Biology. 128 (2), 337-348 (1988).
  13. Voyvodic, J. T. Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion. The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).
  14. Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth. PLoS ONE. 6 (7), 21754 (2011).
  15. Pravoverov, K., et al. MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).
  16. Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons. RNA (New York, N.Y.). 16 (8), 1516-1529 (2010).
  17. Aschrafi, A., et al. Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine β-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons. Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).
  18. Ghogha, A., Bruun, D. a., Lein, P. J. Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons. Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).
  19. Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture. Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).
  20. Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).
  21. Mi, H., et al. PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements. Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).
  22. Chandrasekaran, V., et al. Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons. Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).
  23. Courter, L. A., et al. BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling. Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).
  24. Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons. Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).
  25. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
  26. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9 (1), 82 (2016).
  27. Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), e3200 (2011).
  28. Takeuchi, A., et al. Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).
  29. Takeuchi, A., et al. Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte. Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).
  30. Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).
  31. Kim, W. Y., et al. Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation. Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).
  32. Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
  33. Szpara, M. L., et al. Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration. BMC Neuroscience. 8 (1), 100 (2007).
  34. Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue. Clujul Medical. 87 (4), 5 (2014).
  35. Vit, O., Petrak, J. Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box. Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

163 SCG

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved