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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Papier beschreibt die Isolierung und Kultivierung von embryonalen Ratten sympathischen Neuronen aus den überlegenen zervikalen Ganglien. Es bietet auch detaillierte Protokolle für immunzytochemische Färbung und für die Vorbereitung neuronaler Extrakte für die Massenspektrometrie-Analyse.

Zusammenfassung

Sympathische Neuronen aus der embryonalen Ratte überlegene Zervixganglien (SCG) wurden als In-vitro-Modellsystem für periphere Neuronen verwendet, um axonales Wachstum, Axonalhandel, Synaptogenese, dendritisches Wachstum, dendritische Plastizität und Nerven-Ziel-Wechselwirkungen in Co-Kultur-Systemen zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Dissoziation von Neuronen von den überlegenen zervikalen Ganglien von E21-Rattenembryonen, gefolgt von der Herstellung und Aufrechterhaltung reiner neuronaler Kulturen im serumfreien Medium. Da Neuronen nicht an unbeschichtetem Kunststoff haften, werden Neuronen entweder auf 12 mm Glasabdeckungen oder 6-Well-Platten mit Poly-D-Lysin beschichtet kultiviert. Nach der Behandlung mit einem antimitatischen Mittel (Ara-C, Cytosin-D-Arabinofuranosid) erzeugt dieses Protokoll gesunde neuronale Kulturen mit weniger als 5% nicht-neuronalen Zellen, die über einen Monat in vitro aufrechterhalten werden können. Obwohl embryonale Ratten-SCG-Neuronen multipolar mit 5-8 Dendriten in vivo sind; unter serumfreien Bedingungen dehnen sich diese Neuronen nur ein einziges Axon in der Kultur aus und sind für die Dauer der Kultur weiterhin unipolar. Jedoch, Diese Neuronen können induziert werden, um Dendriten in Gegenwart von Kellermembran-Extrakt, Knochen morphogenetische Proteine (BMPs) oder 10% fetales Kalbsserum zu erweitern. Diese homogenen neuronalen Kulturen können für immunzytochemische Färbung und für biochemische Studien verwendet werden. In diesem Beitrag wird auch das optimierte Protokoll für die immunzytochemische Färbung für Mikrotubuli-assoziiertes Protein-2 (MAP-2) in diesen Neuronen und für die Herstellung neuronaler Extrakte für die Massenspektrometrie beschrieben.

Einleitung

Sympathische Neuronen, die aus embryonalen überlegenen Halsbandlien (SCG) abgeleitet wurden, wurden weithin als primäres neuronales Kultursystem für die Untersuchung vieler Aspekte der neuronalen Entwicklung verwendet, einschließlich Wachstumsfaktorabhängigkeit, Neuron-Ziel-Interaktionen, Neurotransmitter-Signalisierung, Axonalwachstum, Dendritenentwicklung und Plastizität, Synaptogenese und Signalmechanismen, die Nervenziel-/Neuron-Glia-Wechselwirkungen zugrunde liegen1,2,3,4,5,,,6 ,7,9,9 ,. Trotz ihrer geringen Größe (ca. 10000 Neuronen/Ganglien) gibt es drei Hauptgründe für die Entwicklung und den umfassenden Einsatz dieses Kultursystems sind i) die ersten Ganglien in der sympathischen Kette, sie sind größer und daher leichter zu isolieren, als der Rest der sympathischen Ganglien10; ii) Im Gegensatz zu zentralen Neuronen sind die Neuronen im SCG ziemlich homogen, wobei alle Neuronen aus dem neuralen Kamm abgeleitet sind, eine ähnliche Größe haben, vom Nervenwachstumsfaktor abhängig sind und nor-adrenergen sind. Dies macht sie zu einem wertvollen Modell für morphologische und genomische Studien10,11 und iii) diese Neuronen können in einem definierten serumfreien Medium gehalten werden, das Nervenwachstumsfaktor für mehr als einen Monat10,12enthält. Perinatale SCG-Neuronen wurden ausgiebig für die Untersuchung der Mechanismen verwendet, die der Initiierung und Wartung von Dendriten zugrunde liegen2. Dies liegt vor allem daran, dass SCG-Neuronen zwar eine ausgedehnte dendritische Laube in vivo haben, aber sie nicht in vitro in Abwesenheit von Serum ausdehnen, sondern in Gegenwart bestimmter Wachstumsfaktoren wie Knochenmorphogenetische Proteine2,12,13zum Anbau von Dendriten induziert werden können.

Dieses Papier beschreibt das Protokoll zur Isolierung und Kultivierung embryonaler Ratten-SCG-Neuronen. In den letzten 50 Jahren wurden primäre neuronale Kulturen aus dem SCG hauptsächlich für morphologische Studien verwendet, wobei eine begrenzte Anzahl von Studien die groß angelegten genomischen oder proteomischen Veränderungen untersuchten. Dies ist hauptsächlich auf die geringe Gewebegröße zurückzuführen, die zur Isolierung geringer Mengen an DNA oder Protein führt, was es schwierig macht, genomische und proteomische Analysen an diesen Neuronen durchzuführen. Jedoch, in den letzten Jahren, erhöhte Nachweisempfindlichkeit hat die Entwicklung von Methoden zur Untersuchung des Genoms, miRNome und Proteom in den SCG-Neuronen während der dendritischen Wachstumsentwicklung14,15,16,17ermöglicht. In diesem Beitrag wird auch die Methode zur morphologischen Analyse dieser Neuronen mit Hilfe der Immunzytochemie und eines Protokolls zur Gewinnung neuronaler Proteinextrakte für die Massenspektrometrieanalyse beschrieben.

Protokoll

Alle Verfahren, die in Studien mit Tieren durchgeführt wurden, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Saint Mary es College of California genehmigt. Die Richtlinien für die Tierpflege und -nutzung am St. Mary es College wurden auf der Grundlage der Richtlinien des Office of Laboratory Animal Welfare am National Institute for Health (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf und https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf) entwickelt.

1. Vorbereitung von Kulturmedien (auch als Kontrollmedium bezeichnet)

  1. Fügen Sie die folgenden Zutaten in der unten aufgeführten Reihenfolge zu einem sterilen 500 ml Kolben hinzu: 190 ml 1x Glukose-Low-Glucose DMEM, 10 ml mit 20 mg/ml fettsäurefreiem Rinderserumalbumin(FAF-BSA) in DMEM, 2,8 ml 200 ml L-Glutamin, 4 ml 100x Insulin-Selen-Transferrin-Mischung, 0,4 ml mit 125 g/ml Nervenwachstumsfaktor (bei 0,2% inertes Proteinstabilisator in DMEM) und 200 ml des Schinken-Mediums F-12.
  2. Achten Sie darauf, die Pipette mit dem Medium zu beschichten, das FAF-BSA enthält, bevor Sie proteinhaltige Lösungen wie Insulin-Selen-Transferrin und NGF hinzufügen, um das Kleben von Proteinen an der Pipette zu verhindern.
  3. Wirbeln Sie den Kolben, um die Zutaten nach jeder Zugabe zu mischen. Mischen Sie gründlich mit einer 25 ml Pipette nach Zugabe von F-12.
  4. Aliquot die Kulturmedien in 10 ml aliquots und lagern bei -80 °C. Die Aliquots können sechs Monate lang ohne Aktivitätsverlust gelagert werden.

2. Vorbereitung von Platten zur Kultivierung von Neuronen

  1. Verdünnen Sie einen 1 mg/ml-Bestand an Poly-D-Lysin (hergestellt in 0,5 M Tris-Puffer, pH 8) auf 100 g/ml mit sterilem destilliertem Wasser.
  2. Für die proteomische oder genomische Analyse, ein bis zwei Tage vor der Zerlegung, beschichten 6-Well-Platten mit etwa 2 ml sterilen 100 g/ml Poly-D-Lysin (PDL). Dies ist notwendig, um die Zellhaftung am Brunnen zu gewährleisten. Die Platten mit Klebefolie umwickeln und die Platten über Nacht bei 4 °C lagern.
  3. Für die morphologische Analyse und Mikroskopie 12 mm2 vorbehandelte deutsche Glasabdeckungen (die mit Salpetersäurebehandlung wie zuvorbeschrieben 18 oder gekauft gereinigt werden können) in jeden brunnen einer 24-Well-Platte geben.
    1. Beschichten Sie die Abdeckungen mit 0,3 ml sterilem 100 g/ml Poly-D-Lysin (PDL). Lagern Sie die Platten über Nacht bei 4 °C.
  4. Am Tag der Zerlegung, vor Beginn der Zerlegung, entfernen Sie die Poly-D-Lysin-Lösung aus den Brunnen und spülen Sie die Brunnen fünfmal mit steril emstilliertem Wasser, gefolgt von einmal mit niedrigem Glukose-DMEM.
  5. Während der enzymatischen Verdauung der Ganglien (ca. eine Stunde vor dem Beschichten der Zellen) das DMEM von den Platten absaugen und durch 0,3 ml Steuermedien ersetzen. Lagern Sie die Platten bei 35,5 °C unter 5%CO2 in einer befeuchteten Kammer.

3. Dissektions-Setup

  1. Vorbereitung von 200 ml Medien zur Zerlegung (sogenannte Dissektionsmedien)
    1. 8 ml mit 20 mg/ml fettsäurefreiem Rinderserumalbumin (FAF-BSA) in glukosearmem DMEM (mit 1 mg/ml Glukose) und 2 ml 100x Penicillin-Streptomycin zu 193 ml sterilem Leibovitz-Medium L-15 (oder einem luftgepufferten Medium) hinzufügen.
  2. In der Haube die folgenden Teile für die Zerlegung aufstellen: vier 50 ml sterile konische Rohre mit ca. 20 ml Dissektionsmedien in jedem Rohr, vier sterile 35-mm-Schalen mit 1,5 ml Dissektionsmedien, ein steriles 50 ml konisches Rohr mit 20 ml Dissektionsmedium für die Zentrifugation, ein steriles 15 ml-Konikonrohr zur Zentrifugation der Ganglia und ein steriles 10 ml-Rohr zum Sammeln der dissoziierten Zellen.
  3. Verwenden Sie einen trockenen Perlensterilisator, um ein Paar feine Zangen (Nr. 4 oder Nr. 5 Zangen) für mindestens eine Minute zu sterilisieren.

4. Isolierung der überlegenen Zervixganglien von embryonalen Rattenwelpen

  1. Entfernung von E21-Embryonen von der trächtigen Ratte
    HINWEIS: Die Entfernung des Gebärmutterhorns kann außerhalb der Haube durchgeführt werden, wenn die Umgebung gründlich sterilisiert ist.
    1. Euthanisieren Sie die2 schwangere Ratte mit CO2-Inhalation. Das Fell aus dem Bauchbereich scheren und die Haut in der Gegend mit 70% Alkohol abwischen, um es zu sterilisieren.
    2. Mit einem frischen Satz von sterilen Scheren und Zangen, durch die Haut und dann die Muskelschicht schneiden, um die Gebärmutterhörner mit den Embryonen zu belichten. Entfernen Sie die Uterushörner mit den Embryonen mit einer neuen Reihe von Scheren und Zangen, wobei darauf geachtet wird, den Darm dabei nicht zu beschädigen.
    3. Die Uterushörner mit den Embryonen in eine 150 mm2 sterile Petrischale geben und in die Haube geben.
    4. Mit einem neuen Satz von Zangen und Scheren, entfernen Sie die Embryonen aus dem Gebärmutterhorn und trennen Sie die Embryonen von den Fruchtwassermembranen und der Plazenta.
    5. Um die Embryonen einzuschläfern, schneiden Sie das Rückenmark der Embryonen entlang der Mittellinie unter dem rechten Arm. Dies wird auch die Blutung aus der Halsschlagader während der Entfernung des SCG reduzieren.
    6. Übertragen Sie diese Embryonen in die präparierten 50 ml konischen Röhren, die Dissektionsmedien enthalten. Stellen Sie sicher, dass die Embryonen in den Medien untergetaucht sind. Jede Röhre kann bis zu 3 Embryonen aufnehmen.
  2. Isolierung des überlegenen Halsbandlions vom Embryo
    1. Einen Welpen aus dem Seziermedium auf eine sterile 150 mm2 Petrischale halbgefüllt mit festem Substrat (entweder Paraffinwachs oder Silikonpolymer) mit seiner dorsalen Oberfläche auf dem Substrat übertragen. Mit drei sterilen 23 G Nadeln, pin den Welpen auf die Schale mit einer Nadel unter jedem Arm und eine dritte Nadel durch den Mund, um vorsichtig hyperextend den Hals.
    2. Schneiden Sie die Haut im Nackenbereich mit sterilen feinen Zangen (Nr. 4 oder Nr. 5 Zangen) durch, um die Speicheldrüsen darunter freizulegen. Entfernen Sie diese Drüsen mit feinen Zangen.
    3. Suchen Sie die sternocleidomastoiden und omohyiden Muskeln in der Nähe des Schlüsselbeins bzw. der Luftröhre. Schneiden Sie zuerst die transversalen sternocleidomastoiden Muskeln und dann vorsichtig schneiden Sie den dünnen omohyoiden Muskel mit feinen Zangen. Sobald diese Muskeln entfernt sind, wird die Bifurkation in der Halsschlagader am vorderen Ende auf beiden Seiten der Luftröhre sichtbar sein, wobei sich das SCG unter dieser Gabel in der Halsschlagader befindet.
    4. Heben Sie die Halsschlagader mit geschlossenen Zangen vorsichtig an, um das SCG zu visualisieren. Mit einer Zange auf beiden Seiten des SCG, ziehen Sie die Carotis und übertragen Sie es auf die vorbereiteten sterilen 35 mm2 Gerichte. Dieses Gewebe wird höchstwahrscheinlich das SCG mit der Halsschlagader, den Vagusnerv mit den Nodose-Ganglien sowie andere Segmente von Muskel oder Fett in der Gegend enthalten.
    5. Wiederholen Sie den Seziervorgang auf der anderen Seite. Entfernen Sie SCGs von allen Embryonen, bevor Sie mit den unten beschriebenen verbleibenden Sezierschritten fortfahren. Verteilen Sie die isolierten Gewebe zwischen zwei der 35 mm2 Schalen, um die Verarbeitung der Gewebeproben zu erleichtern.
  3. Nachbearbeitung von SCG
    1. Um das SCG vom sezierten Gewebe zu trennen, verwenden Sie zuerst feine Zangen, um fremdartiges Gewebe, wie Fett oder Muskel, zu entfernen, wobei Darauf zu achten ist, den Bereich in der Nähe der Karotisbifurkation zu vermeiden.
    2. Sobald diese Gewebe entfernt wurden, sind zwei Ganglien sichtbar. Das Nodose Ganglion ist kleiner und kreisförmiger, während das SCG mandelförmig ist. Ziehen Sie vorsichtig auf den Vagusnerv, um den Vagusnerv und die Nodose-Ganglien vom Karotis zu trennen und trennen Sie dann das SCG von der Halsschlagader.
    3. Verwenden Sie feine Zangen, um die Kapsel zu entfernen, die das SCG umgibt. Übertragen Sie den SCG auf eine neue 35 mm Kulturschale. Wiederholen Sie den Vorgang mit allen sezierten Gewebeproben.
    4. Beschichten Sie eine sterilisierte, mit Baumwolle gesteckte Glaspipette mit Seziermedien, um zu verhindern, dass das Gewebe an den Pipettenwänden haften bleibt. Verwenden Sie die Pipette, um die Dissektionsmedien durch sterile 2 ml Kollagenase Typ II (1 mg/ml)/Dispase Typ II (5 mg/ml) in calcium- und magnesiumfreiem HBSS zu ersetzen, und brüten Sie für 50 min bei 37 °C, um das Gewebe aufzubrechen.
      HINWEIS: Die Inkubationszeit muss möglicherweise mit verschiedenen Chargen von Collagenase/Dispase optimiert werden und reicht in der Regel von 40 min bis zu einer Stunde.
    5. Während der Inkubation das DMEM von den Platten absaugen und durch 0,3 ml Steuermedien ersetzen. Lagern Sie die Platten bei 35,5 °C unter 5%CO2 in einer befeuchteten Kammer.
    6. Nach der Inkubation die SCGs in Kollagennase/Dispase in ein steriles 15 ml konisches Rohr übertragen. Verwenden Sie das Seziermedium, um die Platten zu spülen und die Lösung auf das Rohr zu übertragen. Fügen Sie genügend Seziermedien hinzu, um das Volumen auf ca. 10 ml zu erhöhen.
    7. Zentrifuge bei 200 x g (1000 - 1200 U/min) für 5 Minuten bei Raumtemperatur, um die Probe zu pellet. Aspirieren Sie den Überstand, achten Sie darauf, das Pellet nicht zu vertreiben. Das Pellet mit 10 ml Seziermedien aussetzen. Wiederholen Sie die Zentrifugation und entsorgen Sie den Überstand.
    8. Ersetzen Sie dies durch 1 - 2 ml Kulturmedium. Mit einer schmalbohrungen, gebogenen sterilen Pasteurpipetten (vorbeschichtet mit Kulturmedium) dissoziieren Sie die Klumpen mechanisch, indem sie 5-6-mal sanft trituieren. Lassen Sie die größeren Klumpen für etwa eine Minute begleichen. Übertragen Sie die überstande Zellsuspension in ein neues 10 ml Rohr.
    9. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3 weitere Male, mit zunehmender Triturationskraft jedes Mal, um eine nahezu vollständige Dissoziation der SCGs zu gewährleisten. Übertragen Sie den Überstand nach jeder Trituration auf ein 10 ml Rohr mit dem Überstand aus der ersten Trituration.
    10. Fügen Sie genügend Kulturmedien hinzu, um das Volumen auf 8 - 10 ml zu erhöhen. Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig und quantifizieren Sie die Zelldichte mit einem Hämozytometer.
    11. Verteilen Sie die Zellsuspension in die Brunnen mit der entsprechenden Zelldichte für die Experimente. Mischen Sie die Zellsuspension während des Beschichtungsprozesses kontinuierlich, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in die Brunnen zu gewährleisten.
      HINWEIS: Für die morphologische Analyse, Platte die Zellen um 8.000 Zellen / gut in einem 24 Brunnen Platten und für genomische und proteomische Protokolle, Plattdie nieren die Zellen so hoch wie 30.000 Zellen / Well.
    12. Übertragen Sie die Platten auf einen Glasaustrocknungsor mit sterilem Wasser am Boden, um eine befeuchtete Kammer zu schaffen. Injizieren Sie genügendCO2 (ca. 120 ml), um vor der Versiegelung eine 5%CO2-Umgebung im Trockenende zu erhalten. Bewahren Sie die Platten bei 35,5 °C auf. Dies wird im Protokoll als Tag 0 bezeichnet.
      HINWEIS: Diese Platten können auch in einem regelmäßigen 5% CO2-Inkubator aufbewahrt werden. Das oben beschriebene Verfahren minimiert Temperatur- und pH-Änderungen und hilft auch, Kreuzkontaminationen zu verhindern.

5. Pflege der kultivierten SCG-Neuronen und -Behandlungen

  1. Entfernen Sie an Tag 1 (24 Stunden nach der Beschichtung) sorgfältig die Hälfte der Kulturmedien und ersetzen Sie sie durch 2 M Ara-C (Cytosin-D-Arabinofuranosid, ein Anti-Mitotik-Mittel). Lassen Sie die Behandlung auf den Zellen für 48 h. In der Regel ist diese Behandlungsdauer ausreichend, um nicht-neuronale Zellen in der Kultur zu beseitigen.
  2. An Tag 3, vorsichtig die Hälfte des Mediums aspirieren und durch Steuermedium ersetzen.
  3. Am 4. Tag sind die Zellen bereit für experimentelle Behandlungen. Füttern Sie Kulturen jeden zweiten Tag mit dem entsprechenden Medium, sanft ersetzen die Hälfte des Mediums im Brunnen mit frischem Medium.
  4. Kultivierte SCG-Neuronen in serumfreiem Medium verlängern nur Axone. Wenn Experimente das Vorhandensein von Dendriten erfordern, behandeln Sie Zellen mit entweder 10% fetalem Kalbsserum, 75-100 g/ml Kellermembranmatrixextrakt oder 50 ng/ml Knochenmorphogenetisches Protein-7. Das dendritische Wachstum wird innerhalb von 48 Stunden nach der Behandlung mit aufwendigen dendritischen Lauben beobachtet, die innerhalb einer Woche nach der Behandlung beobachtet werden.

6. Immunostaining kultivierte SCG-Neuronen

  1. Nach und nach das Zellkulturmedium im Brunnen durch 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,2 in einer Dunstabzugshaube ersetzen.
    1. Entfernen Sie die Hälfte der Kulturmedien im Brunnen und ersetzen Sie sie sanft durch 4% Paraformaldehyd. Wiederholen Sie dann den Vorgang mindestens zwei weitere Male, entfernen Sie jedes Mal zwei Drittel der Medien im Brunnen und ersetzen Sie 4% Paraformaldehyd. Am Ende dieses Prozesses sollte sich die Farbe der Medien im Brunnen von rosa zu farblos geändert haben.
    2. Sobald das gesamte Medium durch 4% Paraformaldehyd ersetzt wurde, bebrüten die Brunnen für 15 - 20 Minuten bei Raumtemperatur.
  2. Bei einem ähnlichen Verfahren wie oben beschrieben, ersetzen Sie schrittweise die 4%ige Paraformaldehydlösung durch phosphatgepufferte Saline (PBS), pH 7.2. Lassen Sie für 5 Minuten. Spülen Sie die Brunnen zwei weitere Male für jeweils 5 Minuten mit PBS.
    1. Sobald das 4% Paraformaldehyd entfernt ist, bewegen Sie die Platten zur Weiterverarbeitung auf die Tischplatte. Dieser Schritt ist ein guter Haltepunkt, an dem Platten über Nacht bei 4 °C gelagert werden können.
  3. Entfernen Sie alle PBS. Fügen Sie genügend Volumen von 0,1% Triton X-100 in PBS hinzu, um die Zellen abzudecken. Lassen Sie es auf den Kulturen für 5 Minuten, um die Neuronen zu permeabilisieren. Der Zeitpunkt dieses Schritts ist entscheidend, um eine gute Färbung unter Beibehaltung der Integrität der Zellen zu gewährleisten.
  4. Entfernen Sie vorsichtig die Triton X-100 Lösung und spülen Sie die Brunnen dreimal für 5 Minuten jedes Mal mit PBS. Entfernen Sie die PBS-Lösung.
  5. Fügen Sie genügend 5% BSA in PBS hinzu, um die Zellen abzudecken und bei Raumtemperatur für 20 Minuten zu brüten, um die unspezifische Antikörperbindung zu reduzieren.
  6. Entfernen Sie die Blockierlösung und ersetzen Sie sie durch einen monoklonalen Mausantikörper gegen MAP-2-Protein, das in 5% BSA in PBS verdünnt ist. Lassen Sie den primären Antikörper über Nacht bei 4 °C auf den Zellen.
  7. Entfernen und speichern Sie den primären Antikörper zur Wiederverwendung. Der primäre Antikörper kann mindestens zweimal ohne Verlust der Erkennungsintensität wiederverwendet werden.
  8. Spülen Sie dreimal mit genügend PBS, um die Zellen zu bedecken. Lassen Sie PBS auf den Zellen für 10 Minuten pro Spüle.
  9. Entfernen Sie die PBS-Lösung und ersetzen Sie sie durch fluoreszierende Tag-konjugierte Goat Anti-Maus IgG Sekundärantikörper bei 1:1000 Verdünnung in 5% BSA in PBS. 2 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
  10. Entfernen Sie den sekundären Antikörper und ersetzen Sie ihn durch PBS. Spülen Sie die Brunnen dreimal mit PBS für 10 Minuten pro Spüle. Spülen Sie die Brunnen einmal mit Wasser, um alle Salze zu entfernen.
  11. Montieren Sie die Abdeckungen auf Glasschlitten, die einen Tropfen wässriger Halterung enthalten, der für fluoreszierend beschriftete Proben geeignet ist. Bewahren Sie die Dias bei 4 °C in einem Folienordner auf, bis sie für die Bildgebung bereit sind.

7. Probenvorbereitung zur Analyse des Proteoms mittels Flüssigchromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie

  1. Lyse kultivierter Neuronen
    1. Entfernen Sie vorsichtig alle Kulturmedien in den Brunnen. Ersetzen Sie es durch kaltes, steriles Kalzium und Magnesium-freies Phosphat-gepufferte Saline (PBS), pH 7.4. Schnell entfernen und durch PBS ersetzen und 5 min sitzen lassen. Dieser Schritt wird getan, um alle Proteine zu entfernen, die in den Kulturmedien vorhanden sind.
    2. Entfernen Sie vorsichtig alle PBS aus allen Brunnen für eine bestimmte Behandlung. Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal. Halten Sie Platten über Eis, wenn Sie die Zellen lysieren, um neuronale Schäden und Proteolyse zu minimieren.
    3. Fügen Sie 100 - 150 l 50 mM Ammoniumbicarbonat, pH 7,5 (NH4HCO3) mit einem sterilen Zellschaber zu einer der Brunnen und Schaberzellen hinzu. Übertragen Sie die Flüssigkeit mit einer Mikropipette und wiederholen Sie den Abkratzvorgang mit allen Brunnen für eine bestimmte Behandlung. Untersuchen Sie die Brunnen unter dem Mikroskop nach dem Abkratzen, um sicherzustellen, dass die meisten Zellen entfernt wurden.
      1. Mit der geringen Anzahl von Neuronen, verwenden Sie ein begrenztes Volumen, um die Zellen zu lysieren, um eine hohe Konzentration für die proteomische Analyse zu gewährleisten.
    4. Einfrieren Sie die Lösung über Nacht bei -80 °C, um bei der Zelllyse zu helfen. Die Lysate können in diesem Stadium bis zur Weiterverarbeitung gelagert werden.
    5. Nach dem Auftauen die Proben durch eine Spritze mit einer 26 G oder 28 G Nadel spritzen, um die Zellen mechanisch zu lysieren.
    6. Beschallen Sie die Proben in einem beschallenden Wasserbad zwei Mal für 10 Minuten. Fügen Sie dem Wasserbad Eis hinzu, um eine Überhitzung und Denaturierung von Proteinen zu verhindern. Zentrifuge für 5 Minuten bei 4 °C bei 12.000 x g.
    7. Messen Sie die Proteinkonzentration. Typische Proteinkonzentrationen reichen von 0,4 - 1 g/l
  2. Probenvorbereitung und Trypsinverdauung zur Proteomanalyse
    1. Übertragen Sie maximal 60 l des Lysats oder 50 g Protein in ein DNase-, RNase- und proteasefreies 1,5 ml-Rohr. Wenn das Volumen des Lysats weniger als 60 l beträgt, fügen Sie genügend 50 mM Ammoniumbicarbonat hinzu, um das Volumen zu bilden.
    2. Fügen Sie 25 l 0,2% säurelabilen Tensid und Wirbel hinzu. Inkubieren Sie das Rohr in einem Blockheizer bei 80 °C für 15 Minuten. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 12.000 x g für 30 s.
    3. Fügen Sie 2,5 l von 100 mM Dithiothreitol und Wirbel hinzu. Dies macht das Protein zugänglicher für Alkylierung und Verdauung. Inkubieren Sie das Rohr bei 60 °C in einer Blockheizung für 30 Minuten. Auf Raumtemperatur und Zentrifuge abkühlen.
    4. Fügen Sie der Probe und dem Wirbel 2,5 l 300 mM Iodoacetamid hinzu. Dieser Schritt hilft, die Cysteins zu alkyliern und verhindert, dass sie die Disulfidbindungen reformieren. Inkubieren Sie die Rohre bei Raumtemperatur im Dunkeln für 30 Minuten.
    5. Fügen Sie der Tube bei einem Trypsin eine Massespektrometrie-Grade-Trypsin (0,5 g/l) hinzu: Proteinverhältnis von 1:10. Verdauen Sie die Proben bei 37 °C über Nacht.
    6. Fügen Sie 10 l von 5% Trifluoressigsäure (TFA) und Wirbel hinzu. Inkubieren Sie die Proben bei 37 °C für 90 Minuten. Dieser Schritt ist notwendig, um das säurelabile Tensid zu hydrolysieren, um Interferenzen während der Massenspektrometrie zu verhindern.
    7. Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g bei 4 °C für 30 Minuten und übertragen Sie den Überstand auf eine chromatographisch zertifizierte Klarglasdurchstechflasche mit vorgeschlitzten Teflon/Silikonseptumkappen. Proben können vor der Massenspektrometrieanalyse bei -20 °C gelagert werden.
    8. Unterziehen Sie die Probenfläschchen einer Flüssigchromatographie in Verbindung mit einer hochauflösenden Massenspektrometrie.

Ergebnisse

Isolierung und Aufrechterhaltung neuronaler Kulturen embryonaler SCG-Neuronen
Dissoziierte Zellen aus dem embryonalen SCG der Ratte wurden in einer poly-D-Lysin-beschichteten Platte oder einem Coverslip plattiert und in serumfreien Kulturmedien mit B-Nerve-Wachstumsfaktor gehalten. Die dissoziierten Zellen, die eine Mischung aus Neuronen und Gliazellen enthalten, sehen bei der Beschichtung kreisförmig aus (Abbildung 1A). Innerhalb von 24 Stunden nach der Beschichtung erw...

Diskussion

Dieses Papier beschreibt die Protokolle für die Kultivierung sympathischer Neuronen aus überlegenen zervikalen Ganglien embryonaler Rattenwelpen. Die Vorteile dieses Modellsystems sind, dass es möglich ist, eine homogene Population von Neuronen zu erhalten, die eine ähnliche Reaktion auf Wachstumsfaktoren bietet, und da die Wachstumsfaktoranforderungen für diese Neuronen gut charakterisiert sind, ist es möglich, diese Neuronen in vitro in definierten Medien unter serumfreien Bedingungen zu züchten

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch den Faculty Development Fund und das Summer Research Program Stipendium am Saint Mary es College of California unterstützt. Die Autoren möchten auch Dr. Pamela Lein von der University of California at Davis und Dr. Anthony Iavarone an der UC Berkeley Mass Spectrometry Anlage für ihre Beratung bei der Entwicklung dieser Protokolle danken. Die Autoren möchten auch Haley Nelson im Office of College Communications am Saint Mary es College of California für ihre Hilfe bei der Videoproduktion und -bearbeitung danken.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
2D nanoACQUITYWaters Corporation
Ammonium bicarbonateSigma-Aldrich9830
BMP-7R&D Systems354-BP
Bovine Serum AluminSigma-Aldrich5470
Cell scraperCorningCLS-3010
CollagenaseWorthington Biochemical4176
Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture platesFisher Scientific07-200, 140675, 142475
Cytosine- β- D-arabinofuranosideSigma-AldrichC1768
D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free)ATCC30-2200
Dispase IIRoche4942078001
Distilled WaterThermo Fisher Scientific15230
DithiothreitolSigma-AldrichD0632
DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvateThermo Fisher Scientific11885
Fatty Acid Free BSACalbiochem12660920 mg/mL stock in low glucose DMEM
Fine forceps Dumont no.4 and no.5Ted Pella Inc5621, 5622
Forceps and Scissors for DissectionTed Pella Inc1328, 1329, 5002
Glass coverlips - 12mmNeuvitro CorporationGG-12
Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugatedThermo Fisher ScientificA32723
Ham's F-12 Nutrient MixThermo Fisher Scientific11765
Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free)Thermo Fisher Scientific14185
Insulin-Selenium-Transferrin (100X)Thermo Fisher Scientific41400-045
IodoacetamideSigma-AldrichA3221
L-GlutamineThermo Fisher Scientific25030
Leibovitz L-15 mediumThermo Fisher Scientific11415064
Mounting media for glass coverslipsThermo Fisher ScientificP36931, P36934
Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52)BioLegendSMI 52
Nerve growth factorEnvigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts)BT5017Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM
ParaformaldehyeSpectrum ChemicalsP1010
Penicillin-Streptomycin (100X)Thermo Fisher Scientific15140
Poly-D-LysineSigma-AldrichP0899
PrionexMillipore52960010% solution, 100 mL
RapiGest SFWaters Corporation1860018615 X 1 mg
Synapt G2 High Definition Mass SpectrometryWaters Corporation
Trifluoro acetic acid - Sequencing gradeThermo Fisher Scientific2890410 X 1 mL
Triton X-100Sigma-AldrichX100
TrypsinPromega or NEBV511A, P8101S100 μg or 5 X 20 mg
Waters Total recovery vialsWaters Corporation186000385c

Referenzen

  1. Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture. Journal of Cell Biology. 9, (1976).
  2. Chandrasekaran, V., Lein, P. J. Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons. Autonomic Nervous System. , (2018).
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