培养胚胎高级宫颈神经群中的大鼠交感神经元进行形态学和蛋白质学分析

摘要

本文描述了胚胎大鼠交感神经元从优越的宫颈神经的分离和培养。它还为免疫细胞化学染色和制备用于质谱分析的神经元提取物提供了详细的方案。

摘要

来自胚胎大鼠高级宫颈节（SCG）的交感神经元已被用作周围神经元的体外模型系统，用于研究共培养系统中的突触生长、斧质贩运、突触、树突生长、树突增合和神经靶相互作用。该协议描述了神经元与E21大鼠胚胎的优越宫颈神经分离，随后在无血清培养中制备和维持纯神经元培养。由于神经元不粘附于未涂覆的塑料，神经元将在 12 mm 玻璃盖玻片或涂有聚 D-lysine 的 6 孔板上培养。在用抗米理剂（Ara-C，细胞素β-D-阿拉伯富拉诺赛德）治疗后，该协议产生健康神经元培养，非神经元细胞少于5%，可以在体外维持一个多月。虽然胚胎大鼠SCG神经元是多极的，体内有5-8个树突;在无血清条件下，这些神经元在培养中只延伸单个轴突，并在培养期间继续是单极的。然而，这些神经元可以诱导扩大树突在地下膜提取物，骨形态遗传蛋白（BPS），或10%胎儿小牛血清的存在。这些同质神经元培养物可用于免疫细胞化学染色和生化研究。本文还介绍了这些神经元中微管相关蛋白-2（MAP-2）的免疫细胞化学染色的优化方案，以及用于质谱学的神经元提取物的制备。

引言

来自胚胎优越的宫颈神经群（SCG）的交感神经元已被广泛用作研究神经元发育的初级神经元培养系统，包括生长因子依赖、神经元靶向相互作用、神经递质信号、突克生长、树突发育和可塑性、突触发生和信号机制，其基础神经靶点/神经胶质相互作用^,,,1,1、2、3、4、5、6、7、8、9。^7,8,95,6,234尽管它们体积小（大约10000个神经元/神经），但有三个主要原因，发展和广泛使用这种文化系统是一）作为第一个神经群在同情链，他们更大，因此更容易隔离，比其余的同情神经^10;ii） 与中央神经元不同，SCG 中的神经元相当均匀，所有神经元都来自神经峰，大小相似，依赖于神经生长因子，并且无肾上腺素。这使得它们成为形态学和基因组研究^{的宝贵模型10，11,11}和iii）这些神经元可以保持在一个定义的无血清介质包含神经生长因子超过一个月10，12。^10,12围产期SCG神经元已被广泛使用，用于研究树突2的启动和维持^机制。这主要是因为，虽然SCG神经元在体内有广泛的树突状，但在缺乏血清的情况下，它们不在体外延伸树突，但在某些生长因子（如骨形态遗传蛋白^{,2、12、13）,12}的存在下，可以诱导树突生长树突。¹³

本文介绍了胚胎大鼠SCG神经元的隔离和培养方案。在过去50年中，SCG的原发神经元培养主要用于形态学研究，研究大规模基因组或蛋白质组变化的研究数量有限。这主要是由于组织体积小，导致低量的DNA或蛋白质的分离，这使得很难对这些神经元进行基因组和蛋白质组分析。然而，近年来，检测敏感性的提高使得在树突生长发育过程中，在SCG神经元中检查基因组、miRNome和蛋白质组^{的方法的发展已经能够发展14、15、16、17。,15,16,17}本文还将描述利用免疫细胞化学和获取神经蛋白提取物进行质谱分析的神经元形态分析方法。

研究方案

加州圣玛丽学院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准了有关动物研究的所有程序。圣玛丽学院的动物护理和使用指南是根据国家卫生研究所实验室动物福利办公室提供的准则（https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf和https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf） https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf。

1. 文化媒体的准备（也称为控制媒介）

1. 将下列成分，按以下顺序添加到无菌的500 mL烧瓶中:190 mL的1x低葡萄糖DMEM，10 mL的20毫克/mL脂肪酸无牛血清白蛋白（FAF-BSA） 在DMEM， 2.8 mL 的 200 mM L-谷氨酰胺，4 mL 的 100 倍胰岛素-氦-转移素混合物，0.4 mL 的 125 μg/mL 神经生长因子（在 DMEM 中的 0.2% 惰性蛋白稳定剂中），以及 200 mL 的 Ham F-12 介质。
2. 在添加含蛋白质溶液（如胰岛素-钚转移素和NGF）之前，确保用含有FAF-BSA的介质涂覆移液器，以防止蛋白质粘附在移液器上。
3. 旋转烧瓶，每次添加后混合成分。加入 F-12 后，与 25 mL 移液器彻底混合。
4. 在10 mL等分中对培养基进行等分，储存在-80°C。 等分可以储存六个月，而不会损失活动。

2. 培养神经元的板的准备

1. 用无菌蒸馏水稀释1mg/mL的多D-Lysine（在0.5 M Tris缓冲液中制造，pH 8）至100μg/mL。
2. 对于蛋白质组或基因组分析，解剖前一到两天，涂上约2 mL的无菌100g/mL聚D-lysine（PDL）。的6孔板。这是确保细胞附着力到井中所必需的。用保鲜膜包裹板，并在4°C下将盘子过夜。
3. 对于形态分析和显微镜，将 12 mm² 预处理的德国玻璃盖玻片（可按^{前 18} 条所述或购买的硝酸处理进行清洁）放入 24 孔板的每个孔中。
   1. 用 0.3 mL 的无菌 100 g/mL 聚 D-晶烯 （PDL） 涂覆唇。将盘子在4°C下过夜。
4. 解剖当天，在解剖开始前，从井中去除多D-lysine溶液，用无菌蒸馏水冲洗井五次，然后用低血糖DMEM冲洗一次。
5. 在刚体酶消化过程中（在电镀细胞前大约一小时），从板中吸出DMEM，用0.3 mL的控制介质进行更换。将板材以 35.5 °C 低于 5% CO₂ 的温度存放在加湿室中。

3. 解剖设置

1. 制备 200 mL 的解剖介质（称为解剖介质）
   1. 在低葡萄糖DMEM（含1mg/mL葡萄糖）中加入8 mL 20mg/mL无脂肪酸牛血清白蛋白（含1mg/mL葡萄糖）和2 mL 100倍青霉素链霉素至193 mL的无菌Lebovitz的L-15介质（或任何空气缓冲介质）
2. 在机罩中，设置以下用于解剖的项目:四个 50 mL 无菌锥形管，每个管中带约 20 mL 的解剖介质，四个无菌 35 mm 培养皿，1.5 mL 解剖介质，一个无菌 50 mL 锥形管与 20 mL 解剖介质进行离心，一个 15 mL 的无菌锥形管用于离心，以及一个无菌的10 mL管，用于收集分离的细胞。
3. 使用干珠消毒器对一对细钳（4 号或 5 号钳子）进行消毒至少一分钟。

4. 将优越的颈椎与胚胎鼠幼崽隔离在一起

1. 从怀孕大鼠中去除E21胚胎
   注:如果对周围区域进行彻底消毒，可以在发动机罩外进行子宫角的切除。
   1. 使用CO2吸入对怀孕_{大鼠实施安乐死} 。从腹部区域剪下毛皮，用 70% 的酒精擦拭该区域的皮肤以消毒。
   2. 使用一套新的无菌剪刀和钳子，切开皮肤，然后肌肉层暴露含有胚胎的子宫角。用一套新的剪刀和钳子取出子宫角，注意不要在这个过程中损害肠道。
   3. 将子宫角与胚胎一起转移到150毫米² 无菌培养皿中，然后将其转移到机罩中。
   4. 使用一套新的钳子和剪刀，从子宫角取出胚胎，将胚胎从羊膜和胎盘分离。
   5. 要对胚胎进行安乐死，请沿着右臂下的中线切割胚胎的脊髓。这也将减少从胡萝卜动脉出血期间，去除SCG。
   6. 这些胚胎移植到准备好的含有解剖介质的50mL锥形管中。确保胚胎浸入介质中。每个管可以容纳多达3个胚胎。
2. 将优越的宫颈从胚胎中分离
   1. 将一只小狗从解剖介质转移到无菌的 150 mm² Petri 盘中，该培养皿半填充固体基材（石蜡或硅胶聚合物），其后面位于基材上。使用三根无菌的23G针，将幼崽固定在菜上，每根手臂下一根针，第三根针穿过嘴，小心地超伸长颈部。
   2. 用无菌细钳（No.4 或 No. 5 钳）切割颈部区域的皮肤，以暴露下面的唾液腺。使用细钳去除这些腺体。
   3. 分别找到锁骨和气管附近的胸腺肌和肌肽肌肉。首先切割横向胸肌肌肉，然后用细钳小心地切割细肌。一旦这些肌肉被移除，前端的胡萝卜动脉的分叉将在气管的两侧可见，SCG 位于这个叉下，位于胡萝卜动脉中。
   4. 使用闭合钳，轻轻抬起胡萝卜动脉以可视化 SCG。使用 SCG 两侧的一个钳子，拉出卡罗蒂德，将其转移到准备好的无菌 35 mm² 盘。这种组织将最有可能包含SCG与胡萝卜动脉，迷走神经与结节神经，以及在该地区的其他部分的肌肉或脂肪。
   5. 在另一侧重复解剖过程。在继续执行下面概述的其余解剖步骤之前，先从所有胚胎中去除 SCG。将分离的组织分配在 35 mm^{2 盘中的两} 个盘之间，以便于组织样品的处理。
3. SCG 的后期处理
   1. 要将SCG与解剖组织分离，首先使用细钳去除任何无关的组织，如脂肪或肌肉，注意避免肉皮分叉附近的区域。
   2. 一旦这些组织被移除，两个小将可见。结节更小，圆形，而SCG是杏仁形的。轻轻拉上迷走神经，将迷走神经和结点神经与胡萝卜状神经分离，然后将SCG与胡萝卜动脉分离。
   3. 使用精细钳子取出 SCG 周围的胶囊。将 SCG 转移到新的 35 毫米培养皿中。对所有解剖组织样本重复此过程。
   4. 用解剖介质涂上经过消毒的棉质玻璃移液器，以防止组织粘附在移液器壁上。使用移液器在不含钙和镁的HSS中用无菌2mL的胶原酶II型（1mg/mL）/dispaseII型（5mg/mL）代替解剖介质，并在37°C下孵育50分钟，帮助分解组织。
      注:孵育时间可能需要用不同批次的胶原蛋白酶/Dispase进行优化，通常从40分钟到1小时。
   5. 在孵育过程中，从板中吸出DMEM，代之以0.3 mL的控制介质。将板材以 35.5 °C 低于 5% CO₂ 的温度存放在加湿室中。
   6. 孵育后，将胶原酶/分离中的SCG转移到无菌的15 mL锥形管中。使用解剖介质冲洗板，将溶液转移到管中。添加足够的解剖介质，使体积达到约 10 mL。
   7. 在室温下以 200 x g （1000 - 1200 rpm） 离心 5 分钟，以对样品进行分粒。吸上一道，注意不要将颗粒分离。用 10 mL 解剖介质重新暂停颗粒。重复离心并丢弃上经剂。
   8. 替换为 1 - 2 mL 的培养介质。使用窄孔、弯头无菌巴氏移液器（预涂有培养基），通过轻轻三角 5-6 次，机械地分离团块。让较大的团块沉淀约一分钟。将上一功能细胞悬浮液转移到新的 10 mL 管中。
   9. 重复此过程 3 次，每次增加三分法力，以确保几乎完全分离 SCG。
   10. 添加足够的培养媒体，使音量达到 8 - 10 mL。轻轻地混合细胞悬浮液，用血细胞计量化细胞密度。
   11. 将细胞悬浮液以适当的细胞密度分配到孔中，用于实验。在电镀过程中连续混合细胞悬浮液，以确保细胞均匀分布到井中。
       注:对于形态学分析，将细胞在24个孔板中对大约8，000个细胞/孔进行板，对于基因组和蛋白质体方案，将细胞板高至30，000个细胞/孔。
   12. 将板转移到底部有无菌水的玻璃干燥器，以形成加湿室。在密封之前，注入足够的 CO_2（ 约 120 mL），在干燥器中获得 5% 的 CO₂ 环境。将板保持 35.5 °C。 这在协议中称为第 0 天。
       注:这些板也可以保持在一个正常的5%的CO2培养箱。上述方法可最大限度降低温度和pH值变化，还有助于防止交叉污染。

5. 维持培养的SCG神经元和治疗

1. 在第1天（电镀后24小时），小心地取出一半的培养基，并更换为2μM Ara-C（细胞氨酸+-D-Arabinofuranoside，一种抗粒菌剂）。将治疗留在细胞上48小时。通常，这种治疗时间足以消除培养中的非神经元细胞。
2. 第 3 天，轻轻吸气一半的介质，然后更换为控制介质。
3. 第4天，细胞准备进行实验治疗。每隔一天用适当的培养物喂养一次，用新鲜的介质轻轻替换井中一半的培养物。
4. 无血清介质中的培养SCG神经元仅延伸轴突。如果实验需要树突的存在，用10%的胎儿小牛血清、75-100μg/mL的基膜基质提取物或50纳克/mL的骨形态遗传蛋白-7治疗细胞。在治疗后48小时内观察到树突生长，在治疗后一周内观察到精心制作的树突状。

6. 免疫污染培养SCG神经元

1. 在0.1 M磷酸盐缓冲液中用4%的甲醛，在烟罩中用pH7.2逐渐取代井中的细胞培养基。
   1. 取出井中一半的培养基，用4%的甲醛轻轻更换。然后，重复此过程至少两次，每次去除井中三分之二的介质，并用 4% 的甲醛替换。在这个过程结束时，井中的介质颜色应该从粉红色变成无色。
   2. 一旦所有介质被4%的甲醛所取代，在室温下孵育15-20分钟。
2. 与上述类似工艺，逐渐用磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH7.2，逐渐取代4%的半成甲醛溶液。离开5分钟。用 PBS 再次冲洗两次，每次冲洗 5 分钟。
   1. 去除 4% 的半甲醛后，将板移动到台面进行进一步处理。此步骤是一个很好的停止点，板可以储存在4°C过夜。
3. 卸下所有 PBS。在 PBS 中添加足够的 0.1% Triton X-100 体积，以覆盖细胞。在培养物上保留5分钟，使神经元渗透。此步骤的时机对于确保良好的染色，同时保持细胞的完整性至关重要。
4. 小心地取出Triton X-100溶液，每次用PBS冲洗3次，冲洗5分钟。卸下 PBS 溶液。
5. 在PBS中加入足够的5%BSA，覆盖细胞，并在室温下孵育20分钟，以减少非特异性抗体结合。
6. 去除阻断溶液，代之以小鼠单克隆抗体，以对抗在PBS中稀释5%BSA中的 MAP-2 蛋白。将原抗体在4°C下在细胞上过夜。
7. 取出并保存原抗体以重复使用。原抗体可至少重复使用两次，而不会损失检测强度。
8. 用足够的 PBS 冲洗三次，以覆盖细胞。每次冲洗时在细胞上保留 PBS 10 分钟。
9. 去除PBS溶液，在PBS中5%BSA中稀释1:1000，用荧光标签结合山羊抗小鼠IgG二次抗体进行更换。在室温下在黑暗中孵育2小时。
10. 去除二级抗体，用PBS代替。每次冲洗用 PBS 冲洗井三次，每次冲洗 10 分钟。用水冲洗水一次，去除任何盐分。
11. 将盖玻片安装到玻璃玻片上，玻璃幻灯片上装有一滴水性安装剂，适用于荧光标记样品。将幻灯片存放在 4°C，在幻灯片文件夹中，直到准备好进行成像。

7. 使用液相色谱和质谱法分析蛋白质组的分析样品制备

1. 培养神经元的透析
   1. 轻轻去除井中的所有培养介质。用冷、无菌钙和无镁磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （PBS） pH 7.4 代替。快速取出并更换为 PBS，让它坐 5 分钟。此步骤是去除培养基中存在的任何蛋白质。
   2. 小心地从所有油井中去除所有 PBS，以进行特定处理。重复此过程一次。在融化细胞时，在冰上保持板，以尽量减少神经元损伤和蛋白细胞解。
   3. 将 100 - 150 μL 的 50 mM 碳酸氢铵，pH 7.5 （NH₄HCO_3）添加到其中一口，并使用无菌细胞刮刀刮取细胞。使用微管，转移液体，并重复刮擦过程与所有的井进行特定处理。刮擦后，在显微镜下检查孔，以确保大部分细胞已被移除。
      1. 神经元数量减少时，使用有限的体积对细胞进行解剖，以确保足够高的浓度用于蛋白质组分析。
   4. 将溶液在-80°C冷冻过夜，以帮助细胞解。在此阶段可以存储 lysates，直到准备进一步处理。
   5. 解冻后，用26G或28G针头将样品通过注射器喷出，以机械方式将细胞融化。
   6. 在声波水浴中对样品进行两次声波处理，时间为10分钟。在水浴中加入冰，防止蛋白质过热和变性。在 4 °C 下在 12，000 x g 下离心 5 分钟。
   7. 测量蛋白质浓度。典型蛋白质浓度范围为 0.4 - 1 μg/μL
2. 样品制备和蛋白酶消化用于蛋白质组分析
   1. 将最大60μL的利酸盐或50μg的蛋白质转移到DNase-、RNase-和蛋白酶1.5 mL管中。如果裂酸的体积小于 60 μL，则加入足够的 50 mM 碳酸氢铵以补充体积。
   2. 加入25μL的0.2%酸乳化表面活性剂和涡流。在80°C的块加热器中孵育管15分钟。将管以 12，000 x g 离心 30 s。
   3. 加入2.5μL的100 mM二次醇和涡流。这使得蛋白质更容易获得烷基化和消化。在60°C的块加热器中孵育管30分钟。冷却至室温和离心机。
   4. 向样品和涡流中加入 2.5 μL 的 300 mM 碘乙酰胺。这一步有助于使半胱氨酸化，并防止它们改革二硫化债券。在黑暗中的室温下孵育管子30分钟。
   5. 在三辛下向管中加入质谱级三辛（0.5 μg/μL）:蛋白质比为1:10。在37°C下隔夜消化样品。
   6. 加入10微升5%三氟乙酸（TFA）和涡流。在37°C下孵育样品90分钟。此步骤是水解酸实验室表面活性剂，以防止在质谱过程中干扰所必需的。
   7. 在 4 °C 下以 12，000 x g 将样品离心 30 分钟，然后将清明转移到经过色谱认证的透明玻璃瓶中，并预切碎特氟龙/硅体隔膜盖。样品在质谱分析之前可以储存在-20°C。
   8. 将样品小瓶与高清晰度质谱法相结合，进行液相色谱。

结果

隔离和维护胚胎SCG神经元的神经元培养
大鼠胚胎SCG分离的细胞被镀在多D-lysine涂层板或盖玻片中，并保留在含有b神经生长因子的血清自由培养基中。含有神经元和胶质细胞混合物的分离细胞在电镀时看起来是圆形的（图1A）。在电镀的24小时内，神经元扩展小轴突过程与胶质细胞扁平化，并在相位对比度显微镜下出现相暗（图1B）。在使?...

讨论

本文介绍了从胚胎大鼠幼崽的上颈神经群中培养交感神经元的规程。使用这个模型系统的优点是，有可能获得一个均匀的神经元群，提供类似的反应生长因子，并且由于这些神经元的生长因子要求已经很好地特征化，有可能在无血清条件下^在定义的介质中体外生长这些神经元。虽然该协议描述了从E21大鼠幼崽隔离SCG的过程，但该协议可用于从E17到E21的鼠幼幼解剖SCG，以及解剖胚?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2D nanoACQUITY	Waters Corporation
Ammonium bicarbonate	Sigma-Aldrich	9830
BMP-7	R&D Systems	354-BP
Bovine Serum Alumin	Sigma-Aldrich	5470
Cell scraper	Corning	CLS-3010
Collagenase	Worthington Biochemical	4176
Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates	Fisher Scientific	07-200, 140675, 142475
Cytosine- β- D-arabinofuranoside	Sigma-Aldrich	C1768
D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free)	ATCC	30-2200
Dispase II	Roche	4942078001
Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	15230
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632
DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11885
Fatty Acid Free BSA	Calbiochem	126609	20 mg/mL stock in low glucose DMEM
Fine forceps Dumont no.4 and no.5	Ted Pella Inc	5621, 5622
Forceps and Scissors for Dissection	Ted Pella Inc	1328, 1329, 5002
Glass coverlips - 12mm	Neuvitro Corporation	GG-12
Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated	Thermo Fisher Scientific	A32723
Ham's F-12 Nutrient Mix	Thermo Fisher Scientific	11765
Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free)	Thermo Fisher Scientific	14185
Insulin-Selenium-Transferrin (100X)	Thermo Fisher Scientific	41400-045
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	A3221
L-Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030
Leibovitz L-15 medium	Thermo Fisher Scientific	11415064
Mounting media for glass coverslips	Thermo Fisher Scientific	P36931, P36934
Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52)	BioLegend	SMI 52
Nerve growth factor	Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts)	BT5017	Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM
Paraformaldehye	Spectrum Chemicals	P1010
Penicillin-Streptomycin (100X)	Thermo Fisher Scientific	15140
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P0899
Prionex	Millipore	529600	10% solution, 100 mL
RapiGest SF	Waters Corporation	186001861	5 X 1 mg
Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry	Waters Corporation
Trifluoro acetic acid - Sequencing grade	Thermo Fisher Scientific	28904	10 X 1 mL
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trypsin	Promega or NEB	V511A, P8101S	100 μg or 5 X 20 mg
Waters Total recovery vials	Waters Corporation	186000385c