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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo articolo descrive l'isolamento e la tatura dei neuroni simpatici del ratto embrionale dai gangli cervicali superiori. Fornisce anche protocolli dettagliati per la colorazione immunocitomica e per la preparazione di estratti neuronali per l'analisi spettrometrica di massa.

Abstract

I neuroni simpatici dei gangli cervicali superiori del ratto embrionale (SCG) sono stati utilizzati come sistema modello in vitro per i neuroni periferici per studiare la crescita assonale, il traffico assonale, la sinaptogenesi, la crescita dendritica, la plasticità dendritica e le interazioni nervo-bersaglio nei sistemi di co-coltura. Questo protocollo descrive l'isolamento e la dissociazione dei neuroni dai gangli cervicali superiori degli embrioni di ratto E21, seguiti dalla preparazione e dal mantenimento di colture neuronali pure in mezzo senza siero. Poiché i neuroni non aderiscono alla plastica non rivestita, i neuroni saranno colturati su coperture di vetro da 12 mm o su piastre da 6 po 'rivestite con poli-D-lisina. Dopo il trattamento con un agente antimitotico (Ara-C, citosina β-D-arabinofuranoside), questo protocollo genera colture neuronali sane con meno del 5% di cellule non neuronali, che possono essere mantenute per oltre un mese in vitro. Anche se i neuroni SCG ratto embrionale sono multipolari con 5-8 dendriti in vivo; in condizioni di non siero, questi neuroni estendono solo un singolo assone in coltura e continuano ad essere unipolari per tutta la durata della coltura. Tuttavia, questi neuroni possono essere indotti ad estendere i dendriti in presenza di estratto di membrana seminterrato, proteine morfogenetiche ossee (BMPs), o 10% siero di vitello fetale. Queste colture neuronali omogenee possono essere utilizzate per la colorazione immunocitomica e per studi biochimici. Questo documento descrive anche il protocollo ottimizzato per la colorazione immunocitomica per la proteina-2 associata al microtubulo (MAP-2) in questi neuroni e per la preparazione di estratti neuronali per la spettrometria di massa.

Introduzione

I neuroni simpatici derivati da gangli cervicali superiori embrionali (SCG) sono stati ampiamente utilizzati come sistema di coltura neuronale primario per studiare molti aspetti dello sviluppo neuronale, tra cui la dipendenza dal fattore di crescita, interazioni neurone-bersaglio, segnalazione neurotrasmettitore, crescita assonale, sviluppo dendrite e plasticità, sinaptogenesi e meccanismi di segnalazione alla base delle interazioni nervo-bersaglio/neurone-glia1,2,3,4,5,6,7,8,9. Nonostante le loro piccole dimensioni (circa 10000 neuroni/ganglia), ci sono tre ragioni principali per lo sviluppo e l'ampio uso di questo sistema culturale sono i) essendo i primi gangli nella catena simpatica, sono più grandi, e quindi più facili da isolare, rispetto al resto dei ganglisimpatici 10; ii) a differenza dei neuroni centrali, i neuroni nella SCG sono abbastanza omogenei con tutti i neuroni derivati dalla cresta neurale, avendo una dimensione simile, dipendenza dal fattore di crescita del nervo e l'essere né-adrenergico. Questo li rende un modello prezioso per gli studi morfologici egenomici 10,11 e iii) questi neuroni possono essere mantenuti in un mezzo definito privo di siero contenente il fattore di crescita del nervo per oltreun mese 10,12. I neuroni SCG perinatale sono stati ampiamente utilizzati per studiare i meccanismi alla base dell'iniziazione e del mantenimento dei dendriti2. Questo è principalmente perché, anche se i neuroni SCG hanno un ampio pergolato dendritico in vivo, non estendono i dendriti in vitro in assenza di siero, ma possono essere indotti a crescere dendriti in presenza di alcuni fattori di crescita come le proteine morfogeneticheossee 2,12,13.

Questo documento descrive il protocollo per isolare e cultare i neuroni SCG del ratto embrionale. Negli ultimi 50 anni, le colture neuronali primarie del SCG sono state utilizzate principalmente per studi morfologici con un numero limitato di studi che esaminano i cambiamenti genomici o proteomici su larga scala. Ciò è dovuto principalmente alle piccole dimensioni dei tessuti che hanno portato all'isolamento di basse quantità di DNA o proteine, il che rende difficile eseguire analisi genomiche e proteomiche su questi neuroni. Tuttavia, negli ultimi anni, una maggiore sensibilità al rilevamento ha permesso lo sviluppo di metodi per esaminare il genoma, miRNome e proteoma nei neuroni SCG durante lo sviluppo della crescita dendritica14,15,16,17. Questo articolo descriverà anche il metodo per l'analisi morfologica di questi neuroni utilizzando l'immunocitochimica e un protocollo per ottenere estratti di proteine neuronali per l'analisi spettrometrica di massa.

Protocollo

Tutte le procedure eseguite in studi che coinvolgono animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Saint Mary's College of California. Le linee guida per la cura e l'uso degli animali presso il Saint Mary's College sono state sviluppate sulla base delle linee guida fornite dall'Office of Laboratory Animal Welfare presso l'Istituto Nazionale per la Salute (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf e https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf).

1. Preparazione dei supporti di coltura (noto anche come mezzo di controllo)

  1. Aggiungere i seguenti ingredienti, nell'ordine indicato di seguito, ad un flacone sterile da 500 mL: 190 mL di 1x DMEM a basso glucosio, 10 mL di 20 mg/mL di siero bovino libero da acido grasso (FAF-BSA) in DMEM, 2,8 mL di 200 mM L-glutamina, 4 mL di 100x miscela insulino-selenio-transferrina, 0,4 mL di 125 g/mL fattore di crescita del nervo (in 0,2% stabilizzatore proteico inerte in DMEM) e 200 mL del mezzo F-12 di Ham.
  2. Assicurarsi di rivestire la pipetta con il mezzo contenente FAF-BSA prima dell'aggiunta di soluzioni contenenti proteine come insulin-selenio-transferrin e NGF per evitare l'attaccamento di proteine alla pipetta.
  3. Swirl il flacone per mescolare gli ingredienti dopo ogni aggiunta. Mescolare accuratamente con una pipetta da 25 mL dopo l'aggiunta di F-12.
  4. Aliquot i mezzi di coltura in 10 mL aliquots e memorizzare a -80 gradi centigradi. Gli aliquot possono essere conservati per sei mesi senza perdita di attività.

2. Preparazione delle piastre per la tatura dei neuroni

  1. Diluire uno stock di 1 mg/mL di poli-d-lysina (fatto in tampone Tris 0,5 M, pH 8) a 100 g/mL con acqua distillata sterile.
  2. Per l'analisi proteomica o genomica, uno o due giorni prima della dissezione, rivestire piastre da 6 pozzetti con circa 2 mL di sterili 100 g/mL di poli-D-lysina (PDL). Questo è necessario per garantire l'adesione cellulare al pozzo. Avvolgere i piatti con pellicola trasparente e conservare i piatti durante la notte a 4 gradi centigradi.
  3. Per l'analisi morfologica e la microscopia, inserire 12 mm2 coperture di vetro tedesco pre-trattate (che possono essere pulite utilizzando il trattamento con acido nitrico descrittoin precedenza 18 o acquistato) in ciascuno dei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.
    1. Rivestire le coperture con 0,3 mL di sterile 100 g/mL di poli-D-lsensilina (PDL). Conservare i piatti durante la notte a 4 gradi centigradi.
  4. Il giorno della dissezione, prima dell'inizio della dissezione, rimuovere la soluzione poli-D-lisina dai pozzetti e risciacquare i pozzi cinque volte con acqua distillata sterile, seguita da una volta con DMEM a basso glucosio.
  5. Durante la digestione ezimatica dei gangli (circa un'ora prima di placcare le cellule), aspirare il DMEM dalle piastre e sostituirlo con 0,3 mL di supporti di controllo. Conservare le piastre a 35,5 gradi centigradi sotto il 5% di CO2 in una camera umidificata.

3. Impostazione della dissezione

  1. Preparazione di 200 mL di supporti per la dissezione (denominati mezzi di dissezione)
    1. Aggiungere 8 mL di 20 mg/mL di albumina di siero bovino senza acidi grassi (FAF-BSA) in DMEM a basso glucosio (con glucosio 1 mg/mL) e 2 mL di 100x penicillina-streptomicina a 193 mL di sterile leibovitz's L-15 medium (o qualsiasi mezzo tamponato d'aria)
  2. Nel cofano, impostare i seguenti elementi per la dissezione: quattro tubi conici sterili da 50 mL con circa 20 mL di mezzi di dissezione in ogni tubo, quattro piatti sterili da 35 mm con 1,5 mL di supporti di dissezione, un tubo conico sterile da 50 mL con 20 mL di mezzi di dissezione per la centrifugazione, uno sterile tubo conico da 15 mL per la centrifugazione e un tubo sterile da 10 mL per la raccolta delle cellule dissociate.
  3. Utilizzare uno sterilizzatore di perline secche per sterilizzare un paio di forze sottili (n. 4 o n. 5, per almeno un minuto.

4. Isolamento dei gangli cervicali superiori dai cuccioli di ratto embrionale

  1. Rimozione degli embrioni E21 dal ratto in gravidanza
    NOTA: La rimozione del corno uterino può essere eseguita al di fuori del cofano se l'area circostante è completamente sterilizzata.
    1. Eutanasia del ratto incinta coninalazione di CO 2. Cesoiare la pelliccia dalla regione addominale e pulire la pelle nella zona con 70% di alcol per sterilizzarla.
    2. Utilizzando una nuova serie di forbici sterili e forbici, tagliare attraverso la pelle e poi lo strato muscolare per esporre le corna uterino contenenti gli embrioni. Rimuovere le corna uterino con gli embrioni utilizzando una nuova serie di forbici e forbici, facendo attenzione a non danneggiare l'intestino nel processo.
    3. Trasferire le corna uterino con gli embrioni in un piatto Petri sterile da 150 mm2 e trasferirle nel cappuccio.
    4. Utilizzando una nuova serie di forbici e forbici, rimuovere gli embrioni dal corno uterino e separare gli embrioni dalle membrane amniotiche e dalla placenta.
    5. Per eutanasia gli embrioni, tagliare il midollo spinale degli embrioni lungo la linea mediana sotto il braccio destro. Questo ridurrà anche l'emorragia dall'arteria carotide durante la rimozione del SCG.
    6. Trasferire questi embrioni nei tubi conici preparati da 50 mL contenenti supporti di dissezione. Assicurarsi che gli embrioni siano sommersi dai media. Ogni tubo può contenere fino a 3 embrioni.
  2. Isolamento del ganglio cervicale superiore dall'embrione
    1. Trasferire un cucciolo dal supporto di dissezione su un piatto sterile di 150 mm2 Petri mezzo riempito con substrato solido (cera di paraffina o polimero di silicone), con la sua superficie dorsale sul substrato. Utilizzando tre aghi sterili da 23 G, fissare il cucciolo al piatto con un ago sotto ogni braccio e un terzo ago attraverso la bocca per iperestersire con attenzione il collo.
    2. Tagliare la pelle nella regione del collo utilizzando taglie sottili sterili (n. 4 o n. 5 taglie) per esporre le ghiandole salivari sotto. Rimuovere queste ghiandole con le force misure fini.
    3. Individuare i muscoli sternocleidomastoid e omohyoid vicino alla clavicola e alla trachea, rispettivamente. Tagliare prima i muscoli sternocleidostoidi trasversale e quindi tagliare con cura il muscolo omoidoide sottile utilizzando forti. Una volta rimossi questi muscoli, la biforcazione nell'arteria carotide all'estremità anteriore sarà visibile su entrambi i lati della trachea, con il SCG situato sotto questa forchetta nell'arteria carotidea.
    4. Utilizzando le forcelle chiuse, sollevare delicatamente l'arteria carotide per visualizzare il SCG. Utilizzando una forza su entrambi i lati del SCG, estrarre la carotide e trasferirla nei piatti sterili preparati da 35 mm2. Questo tessuto conterrà molto probabilmente il SCG con l'arteria carotide, il nervo vago con i gangli nodosi e altri segmenti di muscolo o grasso nella zona.
    5. Ripetere il processo di dissezione sull'altro lato. Rimuovere gli SCG da tutti gli embrioni prima di continuare con le fasi di dissezione rimanenti descritte di seguito. Distribuire i tessuti isolati tra due dei piatti da 35 mm2 per facilitare l'elaborazione dei campioni di tessuto.
  3. Post-elaborazione di SCG
    1. Per separare il SCG dal tessuto sezionato, utilizzare prima le forcelle fini per rimuovere qualsiasi tessuto estraneo, come grasso o muscolo, facendo attenzione a evitare l'area vicino alla biforcazione carotide.
    2. Una volta che questi tessuti sono stati rimossi, due gangli sono visibili. Il ganglio nodoso è più piccolo e circolare, mentre il SCG è a forma di mandorla. Tirare delicatamente il nervo vago per separare il nervo vago e nodosare gangli dalla carotide e quindi separare il SCG dall'arteria carotide.
    3. Utilizzare le forcepi fini per rimuovere la capsula che circonda il SCG. Trasferire l'SCG in un nuovo piatto di coltura da 35 mm. Ripetere il processo con tutti i campioni di tessuto sezionati.
    4. Rivestire una pipetta di vetro sterilizzata in cotone con supporti di dissezione per evitare che il tessuto adasi alle pareti delle pipette. Utilizzare la pipetta per sostituire il supporto di dissezione con sterili 2 mL di Collagenase di tipo II (1 mg/mL)/dispase di tipo II (5 mg/mL) in HBSS senza calcio e magnesio, e incubare per 50 min a 37 gradi centigradi per aiutare a scomporsi i tessuti.
      NOTA: Il tempo di incubazione potrebbe essere necessario ottimizzare con diversi lotti di Collagenase/Dispase e di solito varia da 40 min a un'ora.
    5. Durante l'incubazione, aspirare il DMEM dalle piastre e sostituirlo con 0,3 mL di supporti di controllo. Conservare le piastre a 35,5 gradi centigradi sotto il 5% di CO2 in una camera umidificata.
    6. Dopo l'incubazione, trasferire gli SCG in collagenase/dispase in un tubo conico sterile da 15 mL. Utilizzare il supporto di dissezione per risciacquare le piastre e trasferire la soluzione al tubo. Aggiungere un supporto di dissezione sufficiente per portare il volume a circa 10 mL.
    7. Centrifuga a 200 x g (1000 - 1200 giri/min) per 5 minuti a temperatura ambiente per pellet il campione. Aspirare il supernatant, facendo attenzione a non spostare il pellet. Rispendere il pellet con 10 mL di supporti di dissezione. Ripetere la centrifugazione e scartare il supernatant.
    8. Sostituire con 1 - 2 mL di media coltura. Utilizzando una pipetta di pasteur sterile a foro stretto e piegato (pre-rivestita con mezzo di coltura), dissocia meccanicamente i grumi triturando delicatamente 5-6 volte. Lasciate che i grumi più grandi si stabiliscano per circa un minuto. Trasferire la sospensione della cella supernatant in un nuovo tubo da 10 mL.
    9. Ripetere questo processo altre 3 volte, con una forza di triturazione crescente ogni volta per garantire la dissociazione quasi completa degli SCG. Trasferire il supernante dopo ogni giro di triturazione in un tubo da 10 mL con il supernatante dalla prima triturazione.
    10. Aggiungere un supporto di coltura sufficiente per portare il volume a 8 - 10 mL. Mescolare delicatamente le sospensioni cellulari e quantificare la densità cellulare con un emocitometro.
    11. Distribuire la sospensione cellulare nei pozzetti alla densità cellulare appropriata per gli esperimenti. Mescolare continuamente la sospensione cellulare durante il processo di placcatura per garantire anche la distribuzione delle cellule nei pozzetti.
      NOTA: Per l'analisi morfologica, placcare le cellule intorno a 8.000 cellule/pozzo in un pozzo di 24 pozzetti e per protocolli genomici e proteomici, placcare le cellule fino a 30.000 cellule/bene.
    12. Trasferire le piastre in un desiccatore di vetro con acqua sterile sul fondo per creare una camera umidificata. Iniettare abbastanza CO2 (circa 120 mL) per ottenere un ambiente 5% CO2 nel desiccatore, prima della sigillatura. Mantenere le piastre a 35,5 gradi centigradi. Questo è indicato come Giorno 0 nel protocollo.
      NOTA: Queste piastre possono essere mantenute anche in un normale incubatore di CO2 del 5%. Il metodo descritto in precedenza riduce al minimo i cambiamenti di temperatura e pH e aiuta anche a prevenire la contaminazione incrociata.

5. Manutenzione dei neuroni e dei trattamenti SCG colturati

  1. Il primo giorno (24 ore dopo la placcatura), rimuovere con attenzione metà dei mezzi di coltura, e sostituirlo con 2 Ara-C (citosina β-D-arabinofuranoside, un agente anti-mitotico). Lasciare il trattamento sulle cellule per 48 h. Di solito, questa lunghezza del trattamento è sufficiente per eliminare le cellule non neuronali nella coltura.
  2. Il giorno 3, aspirare delicatamente metà del mezzo e sostituire con mezzo di controllo.
  3. Il giorno 4, le cellule sono pronte per trattamenti sperimentali. Nutrire le colture ogni due giorni con il mezzo appropriato, sostituendo delicatamente metà del mezzo nel pozzo con mezzo fresco.
  4. I neuroni SCG colturati in mezzo senza siero estendono solo gli assoni. Se gli esperimenti richiedono la presenza di dendriti, trattare le cellule con siero del vitello fetale al 10%, 75-100 g/mL di estratto di matrice di membrana seminterrato o 50 ng/mL di proteina morfogenetica ossea-7. La crescita dendritica si osserva entro 48 ore dal trattamento con un pergolato dendritico elaborato osservato entro una settimana dal trattamento.

6. Immunostaining neuroni SCG colturati

  1. Sostituire gradualmente il mezzo di coltura cellulare nel pozzo con 4% di paraformaldeide in tampone di fosfato di 0,1 M, pH 7.2 in una cappa di fumi.
    1. Rimuovere metà dei mezzi di coltura nel pozzo e sostituirlo delicatamente con 4% di paraformaldeide. Quindi, ripetere il processo almeno altre due volte, rimuovendo ogni volta due terzi dei supporti nel pozzo e sostituendolo con il 4% di paraformaldeide. Alla fine di questo processo, il colore dei media nel pozzo avrebbe dovuto cambiare da rosa a incolore.
    2. Una volta che tutto il mezzo è stato sostituito da 4% paraformaldeide, incubare i pozzi per 15 - 20 minuti a temperatura ambiente.
  2. Con un processo simile a quello descritto in precedenza, sostituire gradualmente la soluzione di paraformaldeide del 4% con salina tamponata di fosfato (PBS), pH 7.2. Lasciare partire per 5 minuti. Sciacquare i pozzetti altre due volte per 5 minuti ciascuno con PBS.
    1. Una volta rimossa la paraformaldeide del 4%, spostare le piastre sul piano di panca per un'ulteriore lavorazione. Questo passaggio è un buon punto di sosta in cui le piastre possono essere conservate a 4 gradi centigradi durante la notte.
  3. Rimuovere tutto il PBS. Aggiungere un volume sufficiente di 0,1% Triton X-100 in PBS per coprire le cellule. Lasciare sulle colture per 5 minuti per permeare i neuroni. La tempistica di questo passaggio è fondamentale per garantire una buona colorazione pur mantenendo l'integrità delle cellule.
  4. Rimuovere con cura la soluzione Triton X-100 e sciacquare i pozzetti tre volte per 5 minuti ogni volta con PBS. Rimuovere la soluzione PBS.
  5. Aggiungere abbastanza 5% BSA in PBS per coprire le cellule e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti per ridurre il legame anticorpo non specifico.
  6. Rimuovere la soluzione di blocco e sostituirla con un anticorpo monoclonale del topo contro la proteina MAP-2 diluita in 5% BSA in PBS. Lasciare l'anticorpo primario sulle cellule durante la notte a 4 gradi centigradi.
  7. Rimuovere e salvare l'anticorpo primario per il riutilizzo. L'anticorpo primario può essere riutilizzato almeno due volte senza perdita di intensità di rilevamento.
  8. Risciacquare tre volte con abbastanza PBS per coprire le cellule. Lasciare PBS sulle cellule per 10 minuti per risciacquo.
  9. Rimuovere la soluzione PBS e sostituirla con un anticorpo secondario anti-mouse IgG capra fluorescente con tag a 1:1000 in BSA del 5% in PBS. Incubare per 2 ore al buio a temperatura ambiente.
  10. Rimuovere l'anticorpo secondario e sostituirlo con PBS. Sciacquare i pozzetti tre volte con PBS per 10 minuti per risciacquo. Sciacquare i pozzetti una volta con acqua per rimuovere eventuali sali.
  11. Montare le coperture su vetrini contenenti una goccia di montante aques appropriata per i campioni etichettati in modo fluorescente. Conservare le diapositive a 4 gradi centigradi, in una cartella di diapositive fino a quando non sono pronte per l'imaging.

7. Preparazione del campione per l'analisi del proteoma utilizzando la cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa

  1. Lisi dei neuroni colturati
    1. Rimuovere delicatamente tutti i mezzi di coltura nei pozzi. Sostituirlo con calcio freddo e sterile e salina tamponata al fosfato senza magnesio (PBS), pH 7.4. Rimuovere rapidamente e sostituire con PBS e lasciarlo riposare per 5 min. Questo passaggio viene fatto per rimuovere tutte le proteine presenti nei media di coltura.
    2. Rimuovere con attenzione tutti i PBS da tutti i pozzetti per un particolare trattamento. Ripetere il processo ancora una volta. Mantenere le piastre sul ghiaccio durante la lalisa delle cellule per ridurre al minimo i danni neuronali e la proteolysi.
    3. Aggiungere 100 - 150 l di bicarbonato di ammonio da 50 mM, pH 7,5 (NH4HCO3) a uno dei pozzi e raschiare le cellule utilizzando un raschietto sterile. Utilizzando una micropipetta, trasferire il liquido e ripetere il processo di raschiare con tutti i pozzetti per un particolare trattamento. Esaminare i pozzi al microscopio dopo la raschitura per assicurarsi che la maggior parte delle cellule siano state rimosse.
      1. Con il basso numero di neuroni, utilizzare un volume limitato per lyse le cellule per garantire una concentrazione abbastanza elevata per l'analisi proteomica.
    4. Congelare la soluzione a -80 gradi centigradi durante la notte per aiutare con la lisi cellulare. I lysates possono essere conservati in questa fase fino a quando non sono pronti per un'ulteriore elaborazione.
    5. Una volta scongelati, spruzzare i campioni attraverso una siringa con un ago da 26 G o 28 G per sliviare meccanicamente le cellule.
    6. Srotolariare i campioni in un bagno d'acqua sonicante due volte per 10 minuti. Aggiungere ghiaccio al bagno d'acqua per evitare il surriscaldamento e la denaturazione delle proteine. Centrifuga per 5 minuti a 4 gradi centigradi a 12.000 x g.
    7. Misurare la concentrazione di proteine. Le concentrazioni proteiche tipiche variano da 0,4 a 1 g/L
  2. Preparazione del campione e digestione della trypsina per l'analisi del proteoma
    1. Trasferire un massimo di 60 L del liato o 50 g di proteina in un tubo DNase-, RNase- e protease-free da 1,5 mL. Se il volume del llito è inferiore a 60 L, aggiungere abbastanza bicarbonato di ammonio da 50 mM per molare il volume.
    2. Aggiungere 25 L dello 0,2% di labile surfactant acido e vortice. Incubare il tubo in un riscaldatore a blocchi a 80 gradi centigradi per 15 minuti. Centrifugare il tubo a 12.000 x g per 30 s.
    3. Aggiungere 2,5 L di 100 mM dithiothreitol e vortice. Questo rende la proteina più accessibile per l'alchilazione e la digestione. Incubare il tubo a 60 gradi centigradi in un riscaldatore a blocchi per 30 minuti. Raffreddare a temperatura ambiente e centrifuga.
    4. Aggiungere 2,5 L di 300 mM iodoacetamide al campione e al vortice. Questo passo aiuta ad alchilare i cisteine e impedisce loro di riformare i legami disulfide. Incubare i tubi a temperatura ambiente al buio per 30 minuti.
    5. Aggiungere la metapsina di grado di spettrometria di massa (0,5 g/L) al tubo in una prova: rapporto proteico di 1:10. Digerire i campioni a 37 gradi centigradi durante la notte.
    6. Aggiungere 10 L di acido trifluoroacetico (TFA) e vortice. Incubare i campioni a 37 gradi centigradi per 90 minuti. Questo passaggio è necessario per idrolizzare il surfactant labile acido per prevenire interferenze durante la spettrometria di massa.
    7. Centrifugare i campioni a 12.000 x g a 4 gradi centigradi per 30 minuti e trasferire il supernatant in una fiala di vetro trasparente certificata cromatografica con tappi di setto Teflon/Silicone pre fessura. I campioni possono essere conservati a -20 gradi centigradi prima dell'analisi della spettrometria di massa.
    8. Sottoponete le fiale del campione alla cromatografia liquida abbinata alla spettrometria di massa ad alta definizione.

Risultati

Isolare e mantenere colture neuronali di neuroni SCG embrionali
Le cellule dissociate dal RATto embrionale SCG sono state placcate in una piastra rivestita in poli-D-lisina o coverslip e mantenute in supporti di coltura libera dal siero contenenti fattore di crescita b-nerve. Le cellule dissociate contenenti una miscela di neuroni e cellule gliali sembrano circolari sulla placcatura (Figura 1A). Entro 24 ore dalla placcatura, i neuroni estendono piccoli processi asoriali ...

Discussione

Questo documento descrive i protocolli per la tatura di neuroni simpatici da gangli cervicali superiori di cuccioli di ratto embrionale. I vantaggi dell'utilizzo di questo sistema di modelli sono che è possibile ottenere una popolazione omogenea di neuroni che forniscono una risposta simile ai fattori di crescita, e dal momento che il fabbisogno di fattore di crescita per questi neuroni è stato ben caratterizzato, è possibile far crescere questi neuroni in vitro in supporti definiti, in condizioni di siero-libero

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Faculty Development Fund e dalla borsa di studio Summer Research Program presso il Saint Mary's College of California. Gli autori vorrebbero anche ringraziare la Dott.ssa Pamela Lein dell'Università della California a Davis e il Dr. Anthony Iavarone presso la struttura di spettrometria di massa uc Berkeley per i loro consigli durante lo sviluppo di questi protocolli. Gli autori ringraziano anche Haley Nelson dell'Office of College Communications del Saint Mary's College of California per il suo aiuto nella produzione e nell'editing video.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
2D nanoACQUITYWaters Corporation
Ammonium bicarbonateSigma-Aldrich9830
BMP-7R&D Systems354-BP
Bovine Serum AluminSigma-Aldrich5470
Cell scraperCorningCLS-3010
CollagenaseWorthington Biochemical4176
Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture platesFisher Scientific07-200, 140675, 142475
Cytosine- β- D-arabinofuranosideSigma-AldrichC1768
D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free)ATCC30-2200
Dispase IIRoche4942078001
Distilled WaterThermo Fisher Scientific15230
DithiothreitolSigma-AldrichD0632
DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvateThermo Fisher Scientific11885
Fatty Acid Free BSACalbiochem12660920 mg/mL stock in low glucose DMEM
Fine forceps Dumont no.4 and no.5Ted Pella Inc5621, 5622
Forceps and Scissors for DissectionTed Pella Inc1328, 1329, 5002
Glass coverlips - 12mmNeuvitro CorporationGG-12
Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugatedThermo Fisher ScientificA32723
Ham's F-12 Nutrient MixThermo Fisher Scientific11765
Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free)Thermo Fisher Scientific14185
Insulin-Selenium-Transferrin (100X)Thermo Fisher Scientific41400-045
IodoacetamideSigma-AldrichA3221
L-GlutamineThermo Fisher Scientific25030
Leibovitz L-15 mediumThermo Fisher Scientific11415064
Mounting media for glass coverslipsThermo Fisher ScientificP36931, P36934
Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52)BioLegendSMI 52
Nerve growth factorEnvigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts)BT5017Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM
ParaformaldehyeSpectrum ChemicalsP1010
Penicillin-Streptomycin (100X)Thermo Fisher Scientific15140
Poly-D-LysineSigma-AldrichP0899
PrionexMillipore52960010% solution, 100 mL
RapiGest SFWaters Corporation1860018615 X 1 mg
Synapt G2 High Definition Mass SpectrometryWaters Corporation
Trifluoro acetic acid - Sequencing gradeThermo Fisher Scientific2890410 X 1 mL
Triton X-100Sigma-AldrichX100
TrypsinPromega or NEBV511A, P8101S100 μg or 5 X 20 mg
Waters Total recovery vialsWaters Corporation186000385c

Riferimenti

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