JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מתאר את הבידוד וההתלות של נוירונים אוהדים של חולדה עוברית מגנגליה צוואר הרחם מעולה. הוא גם מספק פרוטוקולים מפורטים עבור כתמים חיסוניים והכנת תמציות עצביות לניתוח ספקטרומטרי מסה.

Abstract

נוירונים סימפטיים מן החולדה העוברית מעולה ganglia צוואר הרחם (SCG) שימשו כמערכת מודל מבחנה עבור נוירונים היקפיים לחקור צמיחה סקסונית, סחר באקסונים, סינפטוגנזה, צמיחה דנדריטית, פלסטיות דנדריטית ואינטראקציות מטרה עצבית במערכות תרבות שותף. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והניתיקות של תאי העצב מהגרגליה צוואר הרחם מעולה של עוברי חולדה E21, ואחריו הכנה ותחזוקה של תרבויות עצביות טהורות במדיום ללא סרום. מאז נוירונים אינם לדבוק פלסטיק לא מצופה, נוירונים יהיה תרבותי על או 12 מ"מ כיסוי זכוכית או 6-well צלחות מצופה פולי-D-לינזין. לאחר טיפול עם סוכן אנטימיוטי (Ara-C, ציטוסין β-D-arabinofuranoside), פרוטוקול זה יוצר תרביות עצביות בריאות עם פחות מ 5% תאים שאינם נוירוניים, אשר ניתן לשמור במשך יותר מחודש במבחנה. למרות חולדה עוברית SCG נוירונים הם רב קוטבי עם 5-8 דנדריטים ב vivo; בתנאים ללא סרום, נוירונים אלה להרחיב רק axon אחד בתרבות ולהמשיך להיות חד קוטבי למשך כל התרבות. עם זאת, נוירונים אלה יכולים להיות מושרה להאריך דנדריטים בנוכחות תמצית קרום מרתף, חלבונים מורפוגנטיים עצם (BMPs), או 10% סרום עגל עוברי. תרבויות עצביות הומוגניות אלה יכולות לשמש להכתמה חיסונית ולחקרים ביוכימיים. מאמר זה מתאר גם פרוטוקול אופטימיזציה עבור כתמים חיסוניים עבור microtubule הקשורים חלבון-2 (MAP-2) בנוירונים אלה, להכנת תמציות עצביות לספקטרומטריה מסה.

Introduction

נוירונים סימפטיים נגזר גנגליה צוואר הרחם מעולה עוברי (SCG) שימשו באופן נרחב כמערכת תרבות עצבית ראשית לחקר היבטים רבים של התפתחות עצבית כולל תלות גורם גדילה, אינטראקציות נוירון-יעד, נוירוטרנסמיטר איתות, צמיחה סקסוני, פיתוח דנדריט ו פלסטיות, סינפטוגנזה ומנגנוני איתות הבסיסית עצב-יעד / נוירון-glia אינטראקציות1,,2,,3,,4,,5,,6,,7,,8,,9. למרות גודלם הקטן (כ-10000 נוירונים/גנגליה), ישנן שלוש סיבות עיקריות לפיתוח ולשימוש נרחב במערכת תרבות זו הם אני) להיות הגנגליה הראשונה בשרשרת הסימפטית, הם גדולים יותר, ולכן קל יותר לבודד, מאשר שאר הגנגליה הסימפטית10; ii) בניגוד לנוירונים המרכזיים, הנוירונים ב-SCG הם הומוגניים למדי עם כל הנוירונים הנגזרים מהציצה העצבית, בעל גודל דומה, תלות בגורם גדילה עצבי ולהיות נור-adrenergic. זה הופך אותם מודל יקר ערך עבור מחקרים מורפולוגיים וגנומיים10,11 ו- iii) נוירונים אלה יכולים להישמר במדיום מוגדר ללא סרום המכיל גורם גדילהעצבי במשך יותר מחודש 10,12. נוירונים SCG Perinatal שימשו בהרחבה לחקר המנגנונים הבסיסיים ייזום ותחזוקה של דנדריטים2. הסיבה לכך היא בעיקר, למרות נוירונים SCG יש arbor דנדריטי נרחב vivo, הם לא להרחיב דנדריטים במבחנה בהיעדר סרום, אבל יכול להיות מושרה לגדול דנדריטים בנוכחות גורמי גדילה מסוימים כגון חלבונים מורפוגנטעצם 2,,12,13.

מאמר זה מתאר את הפרוטוקול לבידוד ולקולות נוירונים SCG חולדה עוברית. במהלך 50 השנים האחרונות, תרבויות עצביות עיקריות של SCG שימשו בעיקר מחקרים מורפולוגיים עם מספר מוגבל של מחקרים הבוחנים את השינויים הגנומיים או פרוטאומיים בקנה מידה גדול. זה בעיקר בשל גודל רקמה קטנה וכתוצאה מכך בידוד של כמויות נמוכות של DNA או חלבון, מה שמקשה לבצע ניתוחים גנומיים ופרוטונומיים על נוירונים אלה. עם זאת, בשנים האחרונות, רגישות גילוי מוגברת אפשרה פיתוח של שיטות לבחון את הגנום, miRNome ופרוטומה בנוירונים SCG במהלך פיתוח צמיחהדנדריטית 14,15,16,17. מאמר זה יתאר גם את השיטה לניתוח מורפולוגי של נוירונים אלה באמצעות אימונוציטוכימיה ופרוטוקול כדי להשיג תמציות חלבון עצבי לניתוח ספקטרומטרי מסה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ההליכים שבוצעו במחקרים הקשורים לבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) במכללת סנט מרי בקליפורניה. ההנחיות לטיפול בבעלי חיים ולשימוש במכללת סנט מרי פותחו בהתאם להנחיות שסיפק המשרד לרווחת בעלי חיים במעבדה במכון הלאומי לבריאות (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf).

1. הכנת מדיה תרבות (המכונה גם אמצעי בקרה)

  1. הוסף את המרכיבים הבאים, בסדר המפורט להלן, לבקבוקן סטרילי 500 מ"ל: 190 מ"ל של 1x DMEM דל גלוקוז, 10 מ"ל של 20 מ"ג / מ"ל חומצת שומן ללא חומצת שומן אלבומין סרום(FAF-BSA) ב DMEM, 2.8 מ"ל של 200 מ"ל ל-גלוטמין, 4 מ"ל של תערובת אינסולין-סלניום-transferrin 100x, 0.4 מ"ל של 125 μg/mL גורם גדילה עצבי (ב 0.2% מייצב חלבון אינרטי ב DMEM), ו 200 מ"ל של M-12 מדיום של האם.
  2. הקפד לכסות את הפיפטה עם המדיום המכיל FAF-BSA לפני תוספת של פתרונות המכילים חלבון כגון אינסולין-סלניום-transferrin ו NGF כדי למנוע דבק של חלבונים לפיפטה.
  3. מערבבים את הבקבוקון כדי לערבב את המרכיבים לאחר כל תוספת. מערבבים היטב עם פיפטה של 25 מ"ל לאחר תוספת של F-12.
  4. Aliquot התקשורת התרבות ב 10 mL aliquots ולאחסן ב -80 °C. ניתן לאחסן את האליקוטים במשך שישה חודשים ללא אובדן פעילות.

2. הכנת צלחות לתנוירונים

  1. לדלל 1 מ"ג / מ"ל מלאי של פולי-D-לינזין (עשוי 0.5 M Tris מאגר, pH 8) כדי 100 μg / מ"ל עם מים מזוקקים סטריליים.
  2. לניתוח פרוטאומי או גנומי, יום עד יומיים לפני הניתוח, מעיל 6-well צלחות עם כ 2 מ"ל של סטרילי 100 גרם/מ"ל של פולי-D-לינזין (PDL). זה הכרחי כדי להבטיח הדבקת תאים לבאר. עוטפים את הצלחות בניילון נצמד ומאחסנים את הצלחות למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
  3. לניתוח מורפולוגי ומיקרוסקופיה, המקום 12 מ"מ2 כיסויי זכוכית גרמנית מטופלים מראש (אשר ניתן לנקות באמצעות טיפול חומצה חנקתית כפי שתוארבעבר 18 או נרכש) לתוך כל בארות של צלחת 24 באר.
    1. לכסות את כיסויי עם 0.3 מ"ל של סטרילי 100 גרם/מ"ל של פולי-D-לינזין (PDL). לאחסן את הצלחות למשך הלילה ב-4°C.
  4. ביום הקטע, לפני תחילת הקטע, להסיר את תמיסת poly-D-לינזין מהבארות ולשטוף את הבארים חמש פעמים עם מים מזוקקים סטריליים, ואחריו פעם אחת עם DMEM גלוקוז נמוך.
  5. במהלך העיכול האנזימטי של הגנגליה (כשעה לפני ציפוי התאים), לשאוף DMEM מן הצלחות ולהחליף אותו עם 0.3 מ"ל של מדיה שליטה. לאחסן את הצלחות ב 35.5 ° C תחת 5% CO2 בתא לח.

3. כיוונון פעולה

  1. הכנת 200 מ"ל של מדיה עבור פירוק (המכונה מדיה פירוק)
    1. הוסף 8 מ"ל של 20 מ"ג/מ"ל ללא חומצת שומן סרום אלומין (FAF-BSA) ב DMEM גלוקוז נמוך (עם 1 מ"ג / מ"ל גלוקוז ) ו-2 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין פי 100 מ"ל עד 193 מ"ל של L-15 בינוני סטרילי (או כל מדיום עם אגירה אווירית)
  2. בשכונה, להגדיר את הפריטים הבאים עבור פירוק: ארבעה צינורות חסונים סטריליים 50 מ"ל עם כ 20 מ"ל של אמצעי פעולה פירוק בכל צינור, ארבע מנות סטריליות 35 מ"מ עם 1.5 מ"ל של תקשורת דיסטורית, שפופרת חרטית סטרילית אחת של 50 מ"ל עם 20 מ"ל של אמצעי פירוק צנטריפוגציה, צינור חנטרי אחד סטרילי של 15 מ"ל עבור צנטריפוגות הגנגליה וצינור סטרילי אחד של 10 מ"ל לאיסוף התאים התותקים.,
  3. השתמשו במחטא חרוז יבש כדי לחטא זוג מפסים עדינים (מס' 4 או לא 5 מפסים) למשך דקה אחת לפחות.

4. בידוד של גנגליה צוואר הרחם מעולה מגורי חולדות עובריות

  1. הסרת עוברי E21 מהעכברוש ההרה
    הערה: הסרת קרן הרחם יכולה להתבצע מחוץ למכסה המנוע אם האזור שמסביב הוא עיקור יסודי.
    1. המתת סד לעכברוש ההרה באמצעות שאיפת CO2. גזור את הפרווה מאזור הבטן ונגב את העור באזור עם 70% אלכוהול כדי לחטא אותו.
    2. באמצעות סט טרי של מספריים סטריליים ומקצות, לחתוך דרך העור ולאחר מכן את שכבת השריר כדי לחשוף את קרני הרחם המכילות את העוברים. הסר את קרני הרחם עם העוברים באמצעות סט חדש של מספריים ומלקחיים, תוך הקתה לא לפגוע במעיים בתהליך.
    3. מעבירים את קרני הרחם עם העוברים לצלחת פטרי סטריליתשל 150 מ"מ והעברתן למכסה המנוע.
    4. באמצעות סט חדש של מרטפים ומספריים, להוציא את העוברים מקרן הרחם ולהפריד את העוברים מן הממברנות מי המי שם ואת שליה.
    5. כדי להמתת סד העוברים, לחתוך את חוט השדרה של העוברים לאורך קו האמצע מתחת לזרוע ימין. זה גם יפחית את הדימום מהעורק הראשי במהלך הסרת SCG.
    6. להעביר עוברים אלה לתוך צינורות 50 mL קון מוכן המכיל מדיה פירוק. תוודא שהעוברים שקועים בתקשורת. כל צינור יכול להכיל עד 3 עוברים.
  2. בידוד של גנגליון צוואר הרחם מעולה מן העובר
    1. מעבירים גור אחד מהמדיה של הניתור לצלחת פטרי סטרילית של 150מ"מ 2 פטרי, חצי מלאה בעשייה מוצקה (שעוות פרפין או פולימר מסיליקון), עם משטח הגב שלה על המקום. באמצעות שלוש מחטים סטריליות 23 G, להצמיד את הגור לצלחת עם מחט אחת מתחת לכל זרוע מחט שלישית דרך הפה כדי להגזים בזהירות את הצוואר.
    2. חותכים את העור באזור הצוואר באמצעות מקצות דקים סטריליים (מס ' 4 או לא. 5 מקצות) כדי לחשוף את בלוטות הרוק מתחת. להסיר בלוטות אלה באמצעות מפסים עדינים.
    3. אתר את שרירי הסטרנוקלידומטואיד והאומוהיואידים ליד עצם הבריח וקנה הנשימה, בהתאמה. ראשית לחתוך את שרירי sternocleidomastoid רוחבי ולאחר מכן בזהירות לחתוך את שריר omohyoid דק באמצעות משקולות עדינות. ברגע שרירים אלה מוסרים, bifurcation בעורק הראשי בקצה הקדמי יהיה גלוי משני צידי קנה הנשימה, עם SCG ממוקם תחת זה ממוקם תחת זה פורק בעורק הראשי.
    4. באמצעות משקולות סגורות, הרם בעדינות את העורק הראשי כדי לדמיין את ה-SCG. Using one forceps on either side of the SCG, pull out the carotid and transfer it to the prepared sterile 35 mm2 dishes. רקמה זו תכיל ככל הנראה את SCG עם העורק הראשי, עצב התועה עם גנגליה nodose, כמו גם קטעים אחרים של שריר או שומן באזור.
    5. חזור על תהליך הפירוק בצד השני. הסר SCGs מכל העוברים לפני שתמשיך עם שאר שלבי הפירוק המתוארים להלן. להפיץ את הרקמות המבודדות בין שתיים 35 מ"מ2 כלים כדי להקל על עיבוד של דגימות רקמה.
  3. עיבוד לאחר העיבוד של SCG
    1. כדי להפריד את SCG מן הרקמה הניתח, הראשון להשתמש מלקחיים עדינים כדי להסיר כל רקמה מיותרת, כגון שומן או שריר, טיפול כדי למנוע את האזור ליד bifurcation העורק.
    2. ברגע שהרקמות האלה הוסרו, שתי גנגליה נראות לעין. הגנגליון של הנוקדים קטן ועגול יותר, ואילו ה-SCG הוא בצורת שקד. בעדינות למשוך את העצב vagus להפריד את העצב vagus ואת גנגליה nodose מהעורק הראשי ולאחר מכן להפריד את SCG מהעורק הראשי.
    3. השתמש במנכון כדי להסיר את הקפסולה המקיפה את ה-SCG. העבר את ה-SCG לצלחת תרבות חדשה של 35 מ"מ. חזור על התהליך עם כל דגימות הרקמה הנקטעו.
    4. מעיל פיפטת זכוכית מחטאת מכותנה עם אמצעי פעולה של פירוק כדי למנוע מהרקמות דבקות בקירות הפיפטה. השתמש פיפטה כדי להחליף את מדיית הניתור עם סטרילי 2 מ"ל של קולגנאז סוג II (1 מ"ג / מ"ל)/ dispase סוג II (5 מ"ג / מ"ל) ב HBSS ללא סידן ומגנזיום, דגירה במשך 50 דקות ב 37 ° C כדי לעזור לשבור את הרקמות.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך למטב את זמן הדגירה עם אצוות שונות של Collagenase/Dispase ובדרך כלל נע בין 40 דקות לשעה.
    5. במהלך הדגירה, לשאוף DMEM מן הלוחות ולהחליף אותו עם 0.3 מ"ל של מדיה שליטה. לאחסן את הצלחות ב 35.5 ° C תחת 5% CO2 בתא לח.
    6. בעקבות הדגירה, להעביר SCGs קולגנאז / דיפסה לצינור סטרילי 15 מ"ל חסין. השתמשו למדיית הניתור כדי לשטוף את הלוחות ולהעביר את הפתרון לצינור. הוסף מספיק מדיית פירוק כדי להעלות את עוצמת הקול לכ- 10 מ"ל.
    7. צנטריפוגה ב 200 x g (1000 - 1200 סל"ד) במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולת הדגימה. לשאוף את הסופרנטנט, לדאוג לא להוציא את הכדור. תולה מחדש את הכדור עם 10 מ"ל של תקשורת פירוק. חזור על הצנטריפוגה וזרוק את הסופרנטנט.
    8. החלף ב- 1 - 2 מ"ל של תרבות בינונית. באמצעות פיפטה פסטר סטרילי צר-משעמם, עקום קצה סטרילי (מצופה מראש עם מדיום תרבות), מכנית לנתק את הגושים על ידי בעדינות triturating 5-6 פעמים. תנו לגושים הגדולים יותר להסתפק בדקה אחת. העבר את מתלי התא העל-טבעיים לצינור חדש של 10 מ"ל.
    9. חזור על תהליך זה 3 פעמים נוספות, עם כוח גובר של טריטורציה בכל פעם כדי להבטיח ניתור כמעט מלא של SCGs. להעביר את supernatant לאחר כל סיבוב של טריטורציה לצינור 10 מ"ל עם העל-טבעי מהטריטוריה הראשונה.
    10. הוסף מספיק מדיה תרבות כדי להעלות את עוצמת הקול 8 - 10 מ"ל. מערבבים בעדינות את מתלי התא וכמתים את צפיפות התא עם מדים המיוצית.
    11. הפיצו את מתלי התא לבארות בצפיפות התא המתאימה לניסויים. מערבבים את מתלי התא ללא הרף במהלך תהליך הציפוי כדי להבטיח חלוקה שווה של תאים לתוך בארות.
      הערה: לניתוח מורפולוגי, לוח התאים סביב 8,000 תאים / גם ב 24 לוחות באר עבור פרוטוקולים גנומיים ופרוטונומיים, לוח התאים גבוה ככל 30,000 תאים / גם.
    12. מעבירים את הצלחות למתייוש זכוכית עם מים סטריליים בתחתית כדי ליצור תא לח. הזרק מספיק CO2 (סביב 120 מ"ל) כדי להשיג 5% CO2 סביבה במימש, לפני איטום. שמרו על הצלחות ב-35.5 מעלות צלזיוס. תיקרא יום 0 בפרוטוקול.
      הערה: ניתן לשמור על לוחות אלה גם באינקובטור CO2 רגיל של 5%. השיטה המתוארת לעיל ממזערת שינויי טמפרטורה ו-pH וגם מסייעת במניעת זיהום צולב.

5. תחזוקה של נוירונים וטיפולים SCG תרבותיים

  1. ביום הראשון (24 שעות לאחר הציפוי), הסירו בזהירות מחצית מהמדיה של התרבות, והחליפו ב-2 μM Ara-C (ציטוסין β-D-arabinofuranoside, חומר אנטי-מיטוטי). תשאיר את הטיפול בתאים למשך 48 שעות. בדרך כלל, אורך זה של טיפול מספיק כדי לחסל תאים שאינם עצביים בתרבות.
  2. ביום 3, שואפים בעדינות חצי מהמדיום והחלף במדיום שליטה.
  3. ביום ה-4, התאים מוכנים לטיפולים ניסיוניים. מזינים תרביות כל יומיים במדיום המתאים, ומחליף בעדינות חצי מהמדיום בבאר עם מדיום טרי.
  4. נוירונים SCG תרבותיים במדיום ללא סרום להאריך רק אקסונים. אם ניסויים דורשים נוכחות של דנדריטים, לטפל בתאים עם 10% סרום עגל עוברי, 75-100 μg / מ"ל של תמצית מטריצת קרום מרתף או 50 ng/mL של חלבון מורפוגנטי עצם-7. צמיחה דנדריטית נצפתה בתוך 48 שעות של טיפול עם arbor דנדריטי משוכלל שנצפה בתוך שבוע של טיפול.

6. תאי עצב SCG תרבותיים חיסוניים

  1. בהדרגה להחליף את מדיום תרבות התא בבאר עם 4% paraformaldehyde ב 0.1 M פוספט מאגר, pH 7.2 ב מכסה המנוע אדים.
    1. הסר מחצית מהמדיה התרבות בבאר ולהחליף אותו בעדינות עם 4% paraformaldehyde. לאחר מכן, חזור על התהליך לפחות פעמיים נוספות, הסרת שני שלישים של התקשורת בבאר בכל פעם והחלפת עם 4% paraformaldehyde. בסוף תהליך זה, צבע המדיה בבאר היה צריך להשתנות ורוד לצבע.
    2. לאחר שכל המדיום הוחלף ב-4% פארפורמלדהיד, דגירה את הבארים במשך 15-20 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. עם תהליך דומה כמתואר לעיל, בהדרגה להחליף את תמיסת paraformaldehyde 4% עם תמיסת מלח פוספט אגירה (PBS), pH 7.2. תעזוב ל-5 דקות. לשטוף את הבארים עוד פעמיים במשך 5 דקות כל אחד עם PBS.
    1. לאחר הסרת 4% paraformaldehyde, להעביר את הצלחות על גבי הספסל לעיבוד נוסף. שלב זה הוא נקודת עצירה טובה שבה ניתן לאחסן צלחות ב-4°C בין לילה.
  3. הסר את כל PBS. הוסף מספיק נפח של 0.1% Triton X-100 ב PBS כדי לכסות את התאים. תשאיר את זה על התרבויות ל-5 דקות כדי לחלחל את הנוירונים. התזמון של שלב זה הוא קריטי כדי להבטיח כתמים טובים תוך שמירה על שלמות התאים.
  4. הסר בזהירות את פתרון Triton X-100 ושטוף את הבארים שלוש פעמים במשך 5 דקות בכל פעם באמצעות PBS. הסר את פתרון PBS.
  5. הוסף מספיק 5% BSA ב PBS כדי לכסות את התאים דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות כדי להפחית כריכת נוגדנים לא ספציפית.
  6. הסר את פתרון החסימה והחלף אותו במניון חד-קלוני של עכבר מול חלבון MAP-2 מדולל ב-5% BSA ב-PBS. השאר את הנוגדן הראשי על התאים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
  7. הסר ושמור את הנוגדן הראשי עבור שימוש חוזר. הנוגדן העיקרי ניתן לעשות בו ערך לפחות פעמיים ללא אובדן עוצמת זיהוי.
  8. לשטוף שלוש פעמים עם מספיק PBS כדי לכסות את התאים. השאר את PBS בתאים למשך 10 דקות לכל שטיפה.
  9. הסר את פתרון PBS והחלף אותו בפרודן איגג אנטי-עכבר ים פלואורסצנטי ב- 1:1000 ב- 5% BSA ב- PBS. דגירה במשך שעתיים בחושך בטמפרטורת החדר.
  10. הסר את הנוגדן המשני והחלף אותו ב- PBS. לשטוף את הבארים שלוש פעמים עם PBS במשך 10 דקות לכל שטיפה. יש לשטוף את הבארות פעם אחת במים כדי להסיר מלחים.
  11. הר את הכיסויים על מגלשות זכוכית המכילות טיפה של mountant מים המתאים לדגימות המסוימות בנתון פלורסנט. אחסן את השקופיות ב- 4°C, בתיקיית שקופיות עד להכנה להדמיה.

7. הכנה לדוגמה לניתוח הפרוטאום באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריה מסה

  1. ליסיס של נוירונים תרבותיים
    1. הסר בעדינות את כל אמצעי התקשורת התרבות בארות. החלף אותו בסידן קר, סטרילי ותמיסת מלח ללא פוספט (PBS), pH 7.4. הסר במהירות ולהחליף עם PBS ולתת לו לשבת במשך 5 דקות. שלב זה נעשה כדי להסיר את כל החלבונים הנוכחים בתקשורת התרבות.
    2. בזהירות להסיר את כל PBS מכל הבארים לטיפול מסוים. חזור על התהליך עוד פעם אחת. לשמור על צלחות מעל קרח בעת תסיסת התאים כדי למזער נזק עצבי ופרוטוליזה.
    3. להוסיף 100 - 150 μL של 50 mM אמוניום ביקרבונט, pH 7.5 (NH4HCO3)לאחד הבארים ולגרד תאים באמצעות מגרד תא סטרילי. באמצעות מיקרופיפט, להעביר את הנוזל ולחזור על תהליך גירוד עם כל בארות לטיפול מסוים. בדוק את בארות תחת המיקרוסקופ לאחר גירוד כדי לוודא כי רוב התאים הוסרו.
      1. עם המספר הנמוך של נוירונים, להשתמש בנפח מוגבל כדי lyse התאים כדי להבטיח ריכוז גבוה מספיק לניתוח פרוטאומי.
    4. להקפיא את הפתרון ב -80 מעלות צלזיוס לילה כדי לסייע עם ליזיס התא. בשלב זה ניתן לאחסן את הליזה עד לעיבוד נוסף.
    5. לאחר הפשרה, להשפריץ את הדגימות דרך מזרק עם מחט 26 G או 28 G כדי ללקט את התאים באופן מכני.
    6. Sonicate הדגימות באמבט מים sonicating פעמיים במשך 10 דקות. מוסיפים קרח לאמבט המים כדי למנוע התחממות יתר ופירוק חלבונים. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 4 °C ב 12,000 x g.
    7. למדוד את ריכוז החלבון. ריכוזי חלבון טיפוסיים נעים בין 0.4 - 1 μg/μL
  2. הכנה לדוגמה ועיכול ניסיון לניתוח פרוטאום
    1. להעביר מקסימום של 60 μL של lysate או 50 μg של חלבון לתוך צינור DNase-, RNase- ופרוטאז 1.5 מ"ל. אם נפח lysate הוא פחות מ 60 μL, להוסיף מספיק 50 mM אמוניום ביקרבונט כדי להפוך את הנפח.
    2. להוסיף 25 μL של 0.2% חומצה labile פעילי שטח ומערבולת. דגירה הצינור ב דוד בלוק ב 80 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. צנטריפוגה הצינור ב 12,000 x g עבור 30 s.
    3. הוסף 2.5 μL של 100 mM dithiothreitol ומערבולת. זה הופך את החלבון נגיש יותר עבור אלקילציה ועיכול. דגירה הצינור ב 60 מעלות צלזיוס בתנור בלוק במשך 30 דקות. קריר לטמפרטורת החדר וצנטריפוגה.
    4. להוסיף 2.5 μL של 300 mm iodoacetamide לדגימה ומערבולת. צעד זה מסייע לאקסילציה של ציסטאין ומונע מהם לתקן את איגרות החוב. דגירה את הצינורות בטמפרטורת החדר בחושך במשך 30 דקות.
    5. להוסיף טריפסין כיתה ספקטרומטריה מסה (0.5 μg / μL) לצינור ב שלושה דרך: יחס חלבון של 1:10. לעכל את הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס הלילה.
    6. להוסיף 10 μL של 5% חומצה trifluoroacetic (TFA) ומערבולת. מדגירה את הדגימות ב-37°C למשך 90 דקות. שלב זה נחוץ כדי הידרוליזה פעילי שטח labile חומצה כדי למנוע הפרעה במהלך ספקטרומטריית מסה.
    7. צנטריפוגה הדגימות ב 12,000 x g ב 4 ° C במשך 30 דקות ולהעביר supernatant למבחנה זכוכית ברורה מוסמך כרומטוגרפיה עם טפלון חריץ מראש / סיליקון מחיצה כמוסות. ניתן לאחסן דגימות ב-20°C לפני ניתוח ספקטרומטריה מסה.
    8. נושא את הבקבוקונים לדוגמה כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריה מסה בהבחנה גבוהה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בידוד ותחזוקה של תרביות עצביות של נוירונים עובריים SCG
תאים תפורים מSCG עוברי חולדה היו מצופה בצלחת פולי-D-ליסין מצופה או כיסוי ומתוחזק בתקשורת תרבות חופשית סרום המכיל גורם גדילה B-עצב. התאים התופרקים המכילים תערובת של תאי עצב ותאי גליה נראים עגולים עלציפוי (איור 1A)....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מאמר זה מתאר את הפרוטוקולים לתפירת נוירונים סימפטיים מגנגליה צוואר הרחם מעולה של גורי חולדות עובריות. היתרונות של שימוש במערכת מודל זה הם כי ניתן להשיג אוכלוסייה הומוגנית של נוירונים מתן תגובה דומה גורמי גדילה, ומאז דרישות גורם גדילה עבור נוירונים אלה כבר מאופיין היטב, ניתן לגדל נוירונים...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן לפיתוח הפקולטה ומענק תוכנית מחקר קיץ במכללת סנט מרי של קליפורניה. המחברים גם רוצים להודות ד"ר פמלה לין באוניברסיטת קליפורניה דייוויס וד"ר אנתוני Iavarone באוניברסיטת ברקלי Mass ספקטרומטריה מתקן על עצתם במהלך הפיתוח של פרוטוקולים אלה. המחברים גם רוצים להודות להיילי נלסון במשרד לתקשורת במכללה סנט מרי של קליפורניה על עזרתה בהפקת וידאו ועריכה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2D nanoACQUITYWaters Corporation
Ammonium bicarbonateSigma-Aldrich9830
BMP-7R&D Systems354-BP
Bovine Serum AluminSigma-Aldrich5470
Cell scraperCorningCLS-3010
CollagenaseWorthington Biochemical4176
Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture platesFisher Scientific07-200, 140675, 142475
Cytosine- β- D-arabinofuranosideSigma-AldrichC1768
D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free)ATCC30-2200
Dispase IIRoche4942078001
Distilled WaterThermo Fisher Scientific15230
DithiothreitolSigma-AldrichD0632
DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvateThermo Fisher Scientific11885
Fatty Acid Free BSACalbiochem12660920 mg/mL stock in low glucose DMEM
Fine forceps Dumont no.4 and no.5Ted Pella Inc5621, 5622
Forceps and Scissors for DissectionTed Pella Inc1328, 1329, 5002
Glass coverlips - 12mmNeuvitro CorporationGG-12
Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugatedThermo Fisher ScientificA32723
Ham's F-12 Nutrient MixThermo Fisher Scientific11765
Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free)Thermo Fisher Scientific14185
Insulin-Selenium-Transferrin (100X)Thermo Fisher Scientific41400-045
IodoacetamideSigma-AldrichA3221
L-GlutamineThermo Fisher Scientific25030
Leibovitz L-15 mediumThermo Fisher Scientific11415064
Mounting media for glass coverslipsThermo Fisher ScientificP36931, P36934
Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52)BioLegendSMI 52
Nerve growth factorEnvigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts)BT5017Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM
ParaformaldehyeSpectrum ChemicalsP1010
Penicillin-Streptomycin (100X)Thermo Fisher Scientific15140
Poly-D-LysineSigma-AldrichP0899
PrionexMillipore52960010% solution, 100 mL
RapiGest SFWaters Corporation1860018615 X 1 mg
Synapt G2 High Definition Mass SpectrometryWaters Corporation
Trifluoro acetic acid - Sequencing gradeThermo Fisher Scientific2890410 X 1 mL
Triton X-100Sigma-AldrichX100
TrypsinPromega or NEBV511A, P8101S100 μg or 5 X 20 mg
Waters Total recovery vialsWaters Corporation186000385c

References

  1. Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture. Journal of Cell Biology. 9, (1976).
  2. Chandrasekaran, V., Lein, P. J. Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons. Autonomic Nervous System. , (2018).
  3. Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. Mechanisms of neuronal polarity. Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).
  4. Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).
  5. Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).
  6. Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons. Developmental Biology. 161 (1), 96-106 (1994).
  7. Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlström, A. Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons. Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).
  8. Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. , 176-189 (2017).
  9. Wingerd, K. L., et al. α4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).
  10. Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M. Tissue culture of autonomic neurons. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, MA. 177-205 (1991).
  11. Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).
  12. Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. Developmental Biology. 128 (2), 337-348 (1988).
  13. Voyvodic, J. T. Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion. The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).
  14. Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth. PLoS ONE. 6 (7), 21754(2011).
  15. Pravoverov, K., et al. MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).
  16. Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons. RNA (New York, N.Y.). 16 (8), 1516-1529 (2010).
  17. Aschrafi, A., et al. Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine β-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons. Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).
  18. Ghogha, A., Bruun, D. a, Lein, P. J. Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons. Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).
  19. Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture. Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).
  20. Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).
  21. Mi, H., et al. PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements. Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).
  22. Chandrasekaran, V., et al. Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons. Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).
  23. Courter, L. A., et al. BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling. Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).
  24. Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons. Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).
  25. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
  26. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9 (1), 82(2016).
  27. Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), e3200(2011).
  28. Takeuchi, A., et al. Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).
  29. Takeuchi, A., et al. Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte. Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).
  30. Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).
  31. Kim, W. Y., et al. Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation. Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).
  32. Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
  33. Szpara, M. L., et al. Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration. BMC Neuroscience. 8 (1), 100(2007).
  34. Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue. Clujul Medical. 87 (4), 5(2014).
  35. Vit, O., Petrak, J. Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box. Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

163ImmunostainingSCG

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved