القياس الكمي لمدون المغذيات الكبيرة في شاشة عصبية حرارية جينية باستخدام يرقات دروسوفيلا

Summary

الموصوف هنا هو بروتوكول يمكن من القياس الكمي اللوني لكمية الطعام التي تؤكل في غضون فترة زمنية محددة من قبل يرقات Drosophila melanogaster المعرضة لأنظمة غذائية ذات جودة مختلفة من المغذيات الكبيرة. يتم إجراء هذه المقايسات في سياق شاشة عصبية حرارية.

Abstract

تسمح سلوكيات الأعلاف والتغذية للحيوانات بالوصول إلى مصادر الطاقة والمواد المغذية الضرورية لتطورها وصحتها وملاءمتها البدنية. التحقيق في تنظيم الخلايا العصبية من هذه السلوكيات أمر ضروري لفهم الآليات الفسيولوجية والجزيئية الكامنة وراء التوازن الغذائي. إن استخدام نماذج حيوانية قابلة للسحب وراثيا مثل الديدان والذباب والأسماك يسهل إلى حد كبير هذه الأنواع من الدراسات. في العقد الماضي، ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster وقد استخدمت كنموذج قوي من قبل علماء الأعصاب التحقيق في السيطرة العصبية من التغذية وسلوكيات الأعلاف. في حين أن قيمة بلا شك، معظم الدراسات دراسة الذباب الكبار. هنا ، نصف بروتوكولا يستفيد من الجهاز العصبي اليرقات الأبسط للتحقيق في الركائز العصبية التي تتحكم في سلوكيات التغذية عندما تتعرض اليرقات للوجبات الغذائية المختلفة في محتواها من البروتين والكربوهيدرات. تستند أساليبنا على فحص التغذية الكمي الملون بدون اختيار ، الذي يتم إجراؤه في سياق شاشة تنشيط حراري عصبي. كمقروءة ، تم استخدام كمية الطعام التي تأكلها اليرقات على مدى فترة ساعة واحدة عند التعرض لأحد الوجبات الغذائية الثلاثة المسماة بالصبغة التي تختلف في نسب البروتين إلى الكربوهيدرات (P:C). ويتضح فعالية هذا البروتوكول في سياق شاشة عصبية جينية في Drosophilaاليرقات , من خلال تحديد المجموعات العصبية المرشح تنظيم كمية الطعام تؤكل في الوجبات الغذائية من نوعية المغذيات الكبيرة المختلفة. كما تمكنا من تصنيف وتجميع الأنماط الجينية التي تم اختبارها في فصول فينوتبيك. وإلى جانب استعراض موجز للأساليب المتاحة حاليا في المؤلفات، تناقش مزايا هذه الأساليب وحدودها، كما تقدم بعض الاقتراحات بشأن كيفية تكييف هذا البروتوكول مع تجارب محددة أخرى.

Introduction

تعتمد جميع الحيوانات على نظام غذائي متوازن للحصول على الكميات الضرورية من المواد الغذائية للبقاء والنمو والتكاثر^1. يتأثر اختيار ما وكمية الطعام بالعديد من العوامل المتفاعلة المتعلقة بحالة الحيوان الداخلية ، مثل مستوى الشبع ، والظروف البيئية ، مثل جودة الطعام^{2و3و 4و5}. البروتين والكربوهيدرات هما المغذيات الكبيرة الرئيسية وتناولها متوازن ضروري للحفاظ على العمليات الفسيولوجية للحيوانات. لذلك ، فإن فهم الآليات العصبية التي تتحكم في سلوكيات التغذية والحفاظ على كمية متوازنة من هذه المغذيات الكبيرة أمر وثيق الصلة للغاية. وذلك لأن سمات تاريخ الحياة مثل العمر، والبراز، والصحة الأيضية تتأثر مباشرة بمستويات تناول البروتين^{6،7،8،9،10}.

إن استخدام كائنات أبسط أكثر قابلية للسحب تظهر عادات تغذية محفوظة تطوريا مع الحيوانات المعقدة، بما في ذلك الثدييات، أمر ضروري لهذا النوع من الدراسات. والأهم من ذلك أن هذه النماذج الحيوانية الأبسط توفر فرصة جيدة لتشريح الأسئلة البيولوجية المعقدة في سياق مكلف وأخلاقي وتقني أكثر فعالية. في العقود الأخيرة ، كان Drosophila، مع مجموعة أدواته الجينية القوية ، والسلوك المعقد والنمطي والهندسة المعمارية المحفوظة لآليات استشعار المحيطية والمغذيات مع الثدييات ، نموذجا مثمرا لعلماء الأعصاب السلوكية^11. في نهاية المطاف ، والأمل هو أنه من خلال فهم كيفية تنظيم تناول الطعام في هذا الحيوان ، مع أبسط جهاز عصبي ، يمكننا بعد ذلك البدء في فك الأعطال العصبية الكامنة وراء اضطرابات الأكل البشرية.

تعتمد دراسة الركائز العصبية لسلوكيات التغذية بشكل عميق على القدرة على قياس تناول الحيوانات الغذائي في وقت واحد مع التلاعب بنشاطها العصبي. نظرا للكميات الدنيا من الطعام الذي يتم تناوله ، فإن تحديد كمية الطعام الذي يأكله الذباب أمر صعب للغاية ، وجميع الطرق المتاحة حاليا تمثل قيودا كبيرة. وبالتالي ، فإن معيار الذهب هو استخدام مزيج من المنهجيات التكميلية¹². الذباب البالغ كان مفضلا تاريخيا كنموذج وراثي وسلوكي. ومع ذلك ، تقدم يرقات Drosophila أيضا فرصا للتحقيق في الركائز العصبية التي ترميز سلوك التغذية. الجهاز العصبي المركزي اليرقات (CNS)، مع حوالي 12،000 الخلايا العصبية، هو أقل تعقيدا بكثير من الكبار، الذي يحتوي على ما يقرب من 150،000 الخلايا العصبية. هذا التعقيد الأدنى ليس فقط عدديا ولكنه وظيفي أيضا ، نظرا لأن سلوكيات اليرقات تعتمد على وظائف قاطرة أبسط وأنظمة حسية. على الرغم من البساطة الواضحة لأنظمتها العصبية ، لا تزال اليرقات تظهر^{سلوكيات}تغذية كاملة ، وقد تم وصف بعض الطرق لقياس ابتلاع الطعام في يرقات Drosophila 5^و13و14و15. من خلال الاقتران مع التلاعب في نشاط الخلايا العصبية ، يمكن أن تشكل يرقات Drosophila نموذجا قابلا للسحب للغاية لفهم التنظيم العصبي لتناول الطعام.

يقدم هنا بروتوكول مفصل لتحديد كمية تناول الطعام في اليرقات المعرضة لأنظمة غذائية ذات جودة مغذيات كبيرة مختلفة. اختلفت الوجبات الغذائية، التي تسمى الوجبات الغذائية لتحقيق التوازن بين المغذيات الكبيرة، في محتويات البروتين والكربوهيدرات، وتحديدا فيما يتعلق بنسب البروتين إلى الكربوهيدرات (P:C): 1:1 (النظام الغذائي الغني بالبروتين)، و 1:4 (النظام الغذائي المتوسط)، و 1:16 (النظام الغذائي الفقير بالبروتين)، كما هو موضح في الشكل 1A. باختصار، تم إنشاء فحص التغذية الكمي بدون خيار باستخدام هذه الوجبات الغذائية الثلاثة القائمة على السكروز (SY) المصبوغة بصبغة غذائية زرقاء. لأن استخراج الخميرة والسكروز كانت تستخدم كمصادر البروتين والكربوهيدرات، وكلاهما يحتوي على الكربوهيدرات، تم الحصول على الاختلاف في نسب P:C عن طريق تغيير توازن هذين العنصرين، كما هو موضح سابقا¹⁶ وكما هو مبين في الشكل 1B. تتوفر نظرة عامة تخطيطية للبروتوكول، تظهر الخطوات التجريبية الرئيسية، في الشكل 2.

تم إنشاء هذا البروتوكول بهدف التحقيق في دور مجموعات معينة من الخلايا العصبية على تنظيم مستويات تغذية اليرقات في الوجبات الغذائية ذات نسب P:C المختلفة وفي سياق شاشة الخلايا العصبية الحرارية. تم استخدام أداة عصبية وراثية تتميز بشكل جيد من عائلة إمكانات المستقبلات العابرة (TRP): قناة Drosophila Transient Receptor Potential (dTRPA1) ، وهي قناة تسيؤ ذات درجة حرارة وبطرة ، مما يسمح بإطلاق إمكانات العمل عندما ترتفع درجات الحرارة المحيطة فوق 25 درجة مئوية¹⁷. للتعبير عن تحويل dTRPA1 ، استفدنا من خطوط Gal4 القائمة على المناطق التنظيمية لرابطة الدول المستقلةمن جينوم Drosophila ، الذي أنشئ في مختبر روبن ، في سياق مشروع FlyLight في حرم أبحاث Janelia^18،19.

على الرغم من أن البروتوكول، هنا وصفها، وقد أنشئت في سياق شاشة التنشيط، فإنه يمكن تكييفها بسهولة من قبل المجرب لاحتياجات محددة أخرى أو المصالح، وهي لأداء شاشة قمع باستخدام حساسة لدرجة الحرارة الخلايا العصبية كاتم الصوت ShibireTS^20،بدلا من dTRPA1. وتناقش هذه المواءمة وغيرها في أقسام البروتوكول والمناقشة.

Protocol

1. إعداد الوجبات الغذائية السكروز الخميرة (SY)

1. وزن جميع المكونات الجافة (أجار، الخميرة، السكروز) لتحقيق التوازن بين المغذيات الكبيرة والوجبات الغذائية L3 تربية. الكميات بالجرام لكل مكون من المكونات اللازمة لإعداد 1 لتر من الطعام مبينة في الشكل 1B.
   ملاحظة: خذ في الاعتبار أن هناك حاجة إلى ما يقرب من 13 مل من المواد الغذائية لملء طبق بيتري 60 ملم.
2. حل جميع المكونات في الماء المقطر العقيم (استخدام ما يقرب من 50٪ من إجمالي حجم المياه اللازمة لإعداد الطعام) ويحرك المتوسط لمدة 5-10 دقيقة.
3. الأوتوكلاف لمدة 50 دقيقة.
4. بعد السماح للوسط لتهدئة, إضافة حلول حمض نيباجين وبروبوينيك إلى الوجبات الغذائية, في تركيز النهائي (v/v) من 3٪ و 0.3٪, على التوالي. إلى الوجبات الغذائية موازنة المغذيات الكبيرة، إضافة صبغة الطعام الأزرق إلى تركيز النهائي (v/v) من 1٪. أكمل الكميات الإجمالية بالماء المقطر.
5. صب بعناية الوجبات الغذائية إلى أطباق بيتري 60 ملم، بحيث كمية الطعام سكب هو نفسه تقريبا في كل واحد من لوحات. تسمية لوحات مع نسب P:C من الوجبات الغذائية.
   ملاحظة: إعداد الوجبات الغذائية موازنة المغذيات الكبيرة في يوم الفحص التغذية. إذا لم يكن ذلك ممكنا، وتخزين الوجبات الغذائية المعدة في 4 درجة مئوية، في حاوية مختومة، لمدة أقصاها 3 أيام. فترات التخزين الأطول تجعل النظام الغذائي جافا وصعبا جدا ، ولا يمكن لليرقات أن تحفر في الوسط.

2. الصليب الوراثي للخطوط الأبوية

ملاحظة: استخدم Gal4/UAS النظام²¹ لإعداد الصلبان الوراثية. في هذا البروتوكول، من أجل تنشيط وظيفة الخلايا العصبية في مجموعات معينة من الخلايا العصبية، استخدمت العذارى الإناث من خط DTRPA1 UAS¹⁷ وعبرت إلى الذكور من خطوط جانيليا Gal4 (الشكل 2A). كانت السيطرة الجينية المستخدمة هي ذرية الصليب بين خط dTRPA1 وخط "GAL4 الفارغ" ، الذي يحمل Gal4 في المتجه المستخدم لتوليد مجموعة روبن Gal4 ولكن بدون وجود جزء تنظيمي (attP2)²². لتعزيز قمع الخلايا العصبية، يمكن استخدام خط UAS ترميز ShibireTS^20، بدلا من dTRPA1.

1. إعداد أقفاص جمع الأجنة 60 ملم مع لوحات النظام الغذائي L3 تربية، تكملها مع بعض عجينة الخميرة النشطة.
2. نقل الكبار UAS dTRPA1 أنثى العذارى والذكور جانيليا Gal4، الذين تتراوح أعمارهم بين 5-8 أيام، إلى أقفاص جمع الأجنة والسماح للتزاوج أن يحدث لمدة 24-48 ساعة، في 25 درجة مئوية، مع 60٪ الرطوبة ودورة 12:12 ضوء الظلام (الشكل 2A). بالنسبة لأقفاص جمع الأجنة مقاس 60 مم، استخدم حوالي 100 أنثى عذراء و30 ذكرا لكل صليب.
3. في نهاية فترة التزاوج، قم بإزالة وتخلص من لوحات النظام الغذائي للتربية L3 المستخدمة في الصلبان الوراثية. استبدالها لوحات النظام الغذائي L3 تربية الطازجة، من أجل تنفيذ يضع البيض والتدريج اليرقات.

3. إعداد يرقات النجم الثالث (L3)

1. نقل الذباب الكبار تزاوج إلى لوحات النظام الغذائي الطازج L3 تربية والسماح لوضع البيض أن يحدث لمدة 3-4 ساعة، في 25 درجة مئوية (الشكل 2B). تأكد من أن جميع لوحات وصفت مع النمط الجيني، P: C نسبة النظام الغذائي وتاريخ وضع البيض.
   ملاحظة: لتوفير الوقت، قم بوضع البيض مباشرة في نظام L3 الغذائي للتربية، والذي يتجنب التعامل مع البيض بشكل إضافي. في حالة الفحوصات الجينية الصغيرة الحجم ، يمكن الحصول على تحسين وضع البيض باستخدام لوحات عصير التفاح.
2. في نهاية فترة وضع البيض، قم بإزالة الصفائح من الأقفاص وتغطيتها بأغطية بلاستيكية. في حالة استخدام استخراج الخميرة لتكملة لوحات تربية L3، تأكد من إزالة جميع الخميرة المتبقية في نهاية وضع البيض. وهذا أمر مهم لتجنب التغذية غير الموحدة أثناء نمو اليرقات.
   ملاحظة: يمكن نقل البالغين المتزاوجين إلى لوحات النظام الغذائي الطازجة L3 ، لذلك يتم إجراء المزيد من بويضات اليرقات ، ويمكن الحصول على المزيد من اليرقات التجريبية. يمكن إجراء وضع البيض المتتالي مع نفس البالغين خلال أسبوع عمل واحد كامل.
3. تقدير عدد البويضات لكل طبق والحفاظ على كثافة اليرقات إلى 200 جنين كحد أقصى لكل طبق. يمكن إجراء هذا التقدير عن طريق حساب عدد الأجنة في ربع اللوحة.
   ملاحظة: ستؤخر الصفيحة المكتظة تطور اليرقات وتؤثر على سلوكيات تغذية اليرقات.
4. احتضان لوحات تربية L3 عند 18 درجة مئوية (درجة حرارة متساهلة) ، رطوبة 60 ٪ ودورة 12:12 ضوء الظلام ، والسماح لليرقات بالنمو لمدة 9 أيام(الشكل 2B).
5. في اليوم التاسع بعد وضع البيض (AEL)، جمع ثلاث مجموعات من 10 L3 من كل من الأنماط الجينية (وللكرات المتماثلة) ليتم اختبارها. بالإضافة إلى ذلك، جمع مجموعات من 10 L3 للسيطرة على "الغذاء صفر صبغ". تأكد من أن جمع اليرقات يتم خلال فترات زمنية مكافئة من اليوم تستخدم للقيام وضع البيض (على سبيل المثال، إذا كان زرع البيض حدث بين 10am-2pm، وجمع اليرقات خلال نفس الفترة من الزمن 9 أيام AEL) ويتم تنفيذها، بلطف قدر الإمكان، وذلك باستخدام ملقط #5 أو ملقط وزن الريشة. نقل اليرقات مباشرة كما هو مبين في الخطوة التالية (3.6).
   ملاحظة: "الغذاء صفر صبغ" السيطرة على الحيوانات هي اليرقات التي تعطى في المقايسة التغذية الغذاء دون صبغة زرقاء. هذه السيطرة ضرورية لإزالة امتصاص الخلفية من مقتطفات اليرقات.
6. نقل اليرقات التجريبية التي تم جمعها إلى قوارب وزن طبق بلاستيكي تحتوي على 1 مل من الماء. تأكد من جمع L3، وليس L2، باتباع التوجيهات الواردة في الشكل 3.
   ملاحظة: من المهم جمع L3 إلى القوارب البلاستيكية التي تحتوي على الماء أو المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) ، للحفاظ على رطوبة اليرقات جيدا قبل بدء فحص التغذية. وهذا أمر مهم بشكل خاص إذا تم جمع العديد من مجموعات L3 التجريبية من أنماط جينية مختلفة في نفس الوقت. تتبع أمر التحصيل لكل مجموعة، لذلك يتم تقليل الاختلافات في مدة الحرمان من الطعام لكل مجموعة. يسهل استخدام القوارب البلاستيكية في هذه الخطوة الخطوة الاختيارية 4.3 لأنها تمكن اليرقات من الطفو مباشرة في حمام الماء.

4. التنشيط الحراري والتغذية لا خيار المقايسة

ملاحظة: يوصى بإجراء فحوصات التغذية في نفس الوقت تقريبا من اليوم لتقليل الاختلافات المحتملة المتعلقة بالإيقاعات الإيقاعية. أيضا ، قم بتشغيل تجارب التحكم دائما (عبرت ذرية خط "Gal4 الفارغ" إلى UAS dTRPA1 ويرقات "الطعام الصفري الصبغة") ، بالتوازي مع الأنماط الجينية للاهتمام.

1. إنشاء حاضنة إلى 30 درجة مئوية (درجة حرارة غير مسموح بها) والحفاظ على مستويات عالية من الرطوبة (65٪ على الأقل) لتجنب جفاف اليرقات أثناء الفحص.
2. قبل البدء في فحص التغذية، يمكنك إعادة توازن درجة حرارة لوحات المقايسة عن طريق تسخينها عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
3. (اختياري) الحرارة صدمة اليرقات التجريبية لمدة 2 دقيقة في حمام الماء 37 درجة مئوية. تنفيذ هذه الخطوة مع الحيوانات في قوارب الوزن البلاستيك التي تحتوي على بعض الماء.
   ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو تكثيف تنشيط الخلايا العصبية من خلال تعزيز إطلاق الخلايا العصبية منذ بداية الفحص التغذية.
4. حافظ على ضبط الوقت المتعدد لمدة ساعة واحدة جاهزة. يعتمد عدد أجهزة ضبط الوقت التي سيتم استخدامها على عدد المجموعات التجريبية التي يتم اختبارها وعلى مستوى مهارة المجرب في التعامل مع اليرقات.
   ملاحظة: استخدام أجهزة ضبط الوقت متعددة أمر بالغ الأهمية للحفاظ على مدة الفحص متناسقة لكافة الأنماط الجينية.
5. استنزاف بعناية المياه من القوارب البلاستيكية، وباستخدام فرشاة ناعمة مبللة، ونقل بلطف مجموعات L3 من القوارب إلى وسط لوحات المقايسة. ضع أغطية اللوحات مرة أخرى وابدأ جهاز توقيت لكل لوحة (أو مجموعة من اللوحات) للحفاظ على جلسات تغذية دقيقة 1 ساعة.
6. السماح لليرقات لتغذية لمدة 1 ساعة، في 30 درجة مئوية، في الظلام(الشكل 2C).
   ملاحظة: أداء المقايسة في الظلام مهم للسيطرة على الاختلافات في الإشارات البصرية عبر الوجبات الغذائية، كما سوف تختلف الوجبات الغذائية في نغمات، على الرغم من أنها تحتوي على نفس تركيز صبغة.
7. وقف المقايسة التغذية عن طريق نقل لوحات لحمام جليدي. اضغط أسفل الجليد قدر الإمكان لتوفير سطح مستقر للوحات.
   ملاحظة: سوف تعزز درجات الحرارة الباردة نهاية التغذية عن طريق تثبيط سلوكيات التجشؤ والحفر. معظم اليرقات سوف تطفو على السطح لوحات الطعام بعد بضع دقائق، وتسهيل شفائهم في الخطوات التالية.

5. استخراج صبغة الطعام

1. إعداد 2 مل الأنابيب الدقيقة لكل مجموعة من 10 L3 اختبار، تحتوي على ما يقرب من نفس الكميات من الخرز الزجاج 0.5 ملم (ما يكفي لملء الجزء السفلي من microtube) و 300 ميكرولتر من الميثانول الجليد الباردة. الحفاظ على microtubes في البرد، وذلك باستخدام برودة مقاعد البدلاء.
   تحذير: الميثانول شديد الاشتعال والسامة. اتبع جميع إجراءات السلامة الموصى بها للتعامل مع هذا الكاشف، بما في ذلك العمل في منطقة جيدة التهوية وارتداء قفازات النتريل.
   ملاحظة: استخدام الميثانول مهم لإصلاح عينات اليرقات وتجنب ردود الفعل الميلانة في الجلدية.
2. باستخدام #5 أو ملقط وزن الريشة، واستعادة بعناية مجموعات من 10 L3 من لوحات المقايسة التغذية ونقلها إلى أغطية لوحات المقايسة التي تحتوي على بعض الماء. شطف اليرقات لإزالة أي حطام غذائي على أجسامها أثناء التعامل بلطف مع اليرقات لتجنب أي إصابات. احتفظ بسجل لعدد اليرقات المستردة لكل نمط جيني لكل تكرار ، بحيث يمكن قياس متوسط كمية المداواة الغذائية لكل يرقة كميا.
   ملاحظة: يجب التخلص من اليرقات المصابة لأنها ستكون قد قطعت الميلان ، كونها غير مناسبة للقياس الكمي للألوان.
3. نقل مجموعات L3 إلى 2 مل microtubes أعدت في 5.1.
4. ليس أنسجة اليرقات لاستخراج صبغة الطعام من الأحشاء عن طريق طريقة تحلل ميكانيكية باستخدام lyzer الأنسجة والخرز الزجاجي المضافة في الخطوة 5.1. (إذا لم يكن الأنسجة lyzer متوفرة، استخدم الحشرات المتجانسة). بشكل تفضيلي، قم بتنفيذ هذه الخطوة عند 4 °C(الشكل 2D).
   ملاحظة: تعتمد مدة هذه الخطوة على المعدات المستخدمة. باستخدام ليسر الأنسجة التقليدية، استخراج 1 دقيقة كافية. في حالة انقباضات الوقت، يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا في نهاية هذه الخطوة ثم المضي قدما لاحقا. تخزين العينات في -20 درجة مئوية.
5. نقل مقتطفات لتنظيف 1.5 مل الأنابيب الصغيرة، عن طريق عكس مباشرة الأنابيب الصغيرة 2 مل على الأنابيب الصغيرة 1.5 مل جديدة. إذا أجريت بلطف، فإن معظم الخرز الزجاجي يبقى في الجزء السفلي من الأنابيب الدقيقة 2 مل.
6. إزالة الحطام الخلوي عن طريق الطرد المركزي مقتطفات، بأقصى سرعة لمدة 10 دقيقة، في 4 درجة مئوية.
7. جمع supernatants لتنظيف 1.5 مل الأنابيب الدقيقة. إذا كان الحطام الخلوي لا يزال مرئيا في المضادات الفائقة، كرر الخطوتين 5.6 و5.7.

6. القياس الكمي للألوان لاستهلاك الأغذية

1. إعداد حلول قياسية، لتوليد منحنى المعايرة، من خلال تنفيذ المسلسل 1:2 التخفيف في الميثانول من محلول صبغة زرقاء بدءا. كما فارغة، واستخدام الميثانول فقط. ويعتمد تركيز المعايير على مستويات تناول الحيوانات للغذاء.
   ملاحظة: في حالة الشاشة التجريبية المعروضة هنا ، حيث تراوحت تركيزات الصبغة التي تم الحصول عليها لمستخلصات اليرقات من 0.02 إلى 1.93 ميكرولتر / مل ، تم استخدامه منحنى قياسي تم الحصول عليه عن طريق قياس امتصاص 8 تمييعات متسلسلة لمحلول صبغ أزرق 2 ميكرولتر / مل في الميثانول. إذا لزم الأمر، وزيادة أو تقليل تركيز هذه الحلول، اعتمادا على تركيز صبغة من العينات التجريبية.
2. نقل 100 ميكرولتر من العينات التجريبية (التي تم الحصول عليها في الخطوة 5.7) ، والمعايير والفارغة (الخطوة 6.1) إلى آبار لوحة صغيرة 96 جيدا وقياس الامتصاص في 600 نانومتر ، وذلك باستخدام قارئ لوحة(الشكل 2E). لإزالة امتصاص الخلفية ، قم بقياس امتصاص المستخلصات التي تم الحصول عليها من اليرقات التي تتغذى على الطعام دون صبغة زرقاء ك "صفر" لمستخلصات اليرقات ("التحكم الغذائي بدون صبغة).
3. توليد منحنى قياسي وربط قيم الامتصاص التي تم الحصول عليها للعينات من كل مجموعة يرقات تجريبية مع كمية المداواة الغذائية (الحجم بال مل). ابحث عن متوسط استهلاك الغذاء لكل يرقة من خلال مراعاة عدد اليرقات التي تم جمعها لكل مجموعة في الخطوة 5.2

النتائج

تنظم يرقات Drosophila تناول البروتين على حساب تناول الكربوهيدرات الزائدة^{23 (مؤامرة} تخطيطية في الشكل 2E). في الواقع، وقد لوحظ هذا تحديد أولويات تناول البروتين في العديد من الحيوانات الأخرى، ويسمى البروتين الاستفادة^24،25.

Discussion

مع هذا البروتوكول ، يمكن للمرء اختبار قدرة اليرقات تحت تنشيط الخلايا العصبية الحرارية المحددة لتنظيم مستويات تناول البروتين والكربوهيدرات ، وهما مغذيات كبيرة ، عندما تتعرض لوجبات غذائية ذات تكوين P:C مختلف. تم اختبار هذه الطريقة في سياق الفحص الأولي لليرقات بهدف تحديد مجموعات الخلايا الع...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtubes	Sarstedt AG & Co.	72.690.001
10xPBS	Nytech	MB18201
2.0 mL microtubes	Sarstedt AG & Co.	72.695.500
60 mm petri dishes	Greiner Bio-one, Austria	628161
96 well microplates	Santa Cruz Biotechnology	SC-204453
Agar	Pró-vida, Portugal
Bench cooler	Nalgene, USA	Labtop Cooler 5115-0032
Blue food dye	Rayner, Billingshurst, UK
Cell disruption media	Scientific Industries, Inc.	888-850-6208	(0.5 mm glass beads)
Dish weight boats	Santa Cruz Biotechnology	SC-201606
Embryo collection cage for 60 mm petri dishes	Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, UK	FLY1212 (59-100)
Featherweight forceps	BioQuip Products, USA	4750
Fly food for stocks maintenance			1 L food contains: 10 g Agar, 100 g Yeast Extract, 50 g Sucrose, 30 mL Nipagin, 3 mL propionic acid
Forceps #5	Dumont	0108-5-PS	Standard tips, INOX, 11cm
Incubator	LMS Ltd, UK	Series 2, Model 230	For thermogenetic feeding assay (30?C)
Incubator	Percival Scientific, USA	DR36NL	To stage larvae (19?C)
Janelia lines	Janelia Research Campus		Detailed information in Table 2
Macronutrient balancing diets			Composition and nutritional information in Figure 1
Methanol	VWR	CAS number: 67-56-1
Nipagin (Methyl 4-hydroxybenzoate)	Sigma-Aldrich	H5501
Nitrile gloves	VWR, USA
Refrigerated centrifuge	Eppendorf, Germany	5804 R / Serial number: 5805CI364293
Rubin Gal4 ines	Janelia Research Campus		Stoks available at Bloomington Drosophila Stock Center
ShibireTS UAS line	Bloomington Drosophila Stock Center	BDSC number: 66600	Provided by Carlos Ribeiro Group
Soft brushes			For sorting anaesthetised fruit flies
Spectrophotometer plate reader	Thermo Fisher Scientific	Multiskan Go 51119300
Stereo microscope	Nikon	1016625
Sucrose	Sidul, Portugal
Third-instar larvae (L3) rearing diet			Composition and nutritional information in Figure 1
Timer
Tissue lyzer / bead beater	MP Biomedicals, USA	FastPrep-24 6004500
TRPA1 UAS line	Bloomington Drosophila Stock Center	BDSC number: 26264	Expresses TrpA1 under UAS control; may be used to activate neurons experimentally at 25 ?C
Water bath	Sheldon Manufacturing Inc., USA	W20M-2 / 03068308 / 9021195
Yeast extract	Pró-vida, Portugal		51% Protein, 15% Carbohydrate