بلازموديوم فالسيباروم ثقافة الخلايا الجامائية والعدوى البعوض من خلال تغذية الغشاء الاصطناعي

Summary

وتكريس التحريات المفصلة بشأن مراحل البعوض في طفيليات الملاريا أهمية حاسمة في تصميم استراتيجيات فعالة لمنع انتقال العدوى. يوضح هذا البروتوكول كيفية استزراع خلايا اللعب المعدية بشكل فعال ومن ثم تغذية هذه الخلايا اللعبة للبعوض لتوليد مراحل البعوض من P. falciparum.

Abstract

ولا تزال الملاريا واحدة من أهم مشاكل الصحة العامة، مما يسبب معدلات كبيرة من الاعتلال والوفيات. الملاريا مرض ينتقل عن طريق البعوض ينتقل عن طريق لدغة معدية من أنثى بعوضة الأنوفيليس. وستعتمد مكافحة الملاريا في نهاية المطاف على العديد من النهج، التي تشمل سبل منع انتقال العدوى من البعوض وعبره ومنه. لدراسة مراحل البعوض من طفيليات الملاريا في المختبر ، قمنا بتحسين بروتوكول زراعة خلايا الخلايا المنجلية المنجلية عالية العدوى ، وهي مرحلة طفيلية مطلوبة للانتقال من المضيف البشري إلى ناقل البعوض. P. فالسيباروم gametocytes تنضج من خلال خمس خطوات متميزة شكليا، والذي يستغرق ما يقرب من 1-2 أسابيع. يتم الانتهاء من ثقافة الخلايا المغموسة الموصوفة في هذا البروتوكول في 15 يوما وهي معدية للبعوض من أيام 15-18. وقد وضعت هذه البروتوكولات للحفاظ على دورة مستمرة من الخلايا اللعبة المختصة العدوى والحفاظ على إمدادات دون انقطاع من مراحل البعوض من الطفيلي. هنا ، نصف منهجية زراعة الخلايا الغامقة وكيفية إصابة البعوض بهذه الطفيليات باستخدام مغذيات الأغشية الزجاجية.

Introduction

تحدث الملاريا بسبب طفيليات البلازموديوم وتنتقل إلى مضيفيهم الفقاريين عن طريق لدغة معدية من بعوض الأنوفيليس الأنثوي. ووفقا لتقرير منظمة الصحة العالمية لعام 2019، كان هناك ما يقدر بنحو 405,000 حالة وفاة، من إجمالي 228 مليون حالة إصابة بالملاريا^1. وتركزت معظم الوفيات المتصلة بالملاريا في المنطقة الأفريقية، ولا سيما بين الأطفال دون سن الخامسة. وفي حين انخفض المعدل العام للإصابة بالملاريا على الصعيد العالمي منذ عام 2010، فقد استقر الانخفاض في السنوات الأخيرة، وهناك حاجة ماسة إلى استراتيجيات إضافية لمكافحة المرض.

مراحل الدم اللاجنسية الدورية من طفيليات الملاريا تسبب مرض الإمراض وفئة فرعية صغيرة من هذه تفرق إلى خلايا اللعبة الإناث والذكور. Plasmodium falciparum gametocytes هي فريدة من نوعها في طبيعتها لأنها تأخذ 7-10 أيام لتطوير من خلال خمس مراحل متميزة شكليا. يتم عزل الخلايا غير الناضجة من المرحلة الأولى إلى الرابعة في نخاع العظم parenchyma وتظل غائبة إلى حد كبير من الدورة الدموية الطرفية^2،3،4،5. يتم إطلاق كرات الدم الحمراء المصابة بخلايا اللعبة V الناضجة في مجرى الدم ويتم تداولها بحرية ليتم تناولها من قبل البعوض. مرة واحدة داخل midgut البعوض، يتم تنشيط gametocytes، من خلال تغيير في درجة الحرارة والتعرض لبيئة midgut، تتحول إلى الأمشاج الإناث والذكور والبدء في تطوير مراحل البعوض، والتي تبلغ ذروتها مع المراحل المعدية من sporozoites في الغدد اللعابية البعوض^6،7.

منذ تراجر وجنسون⁸ وصف طريقة موحدة لثقافة P. falciparum, وقد تقدمت الدراسات على مراحل الدم اللاجنسي إلى حد كبير. ومع ذلك ، فإن عدم وجود نظام ثقافة موثوق بها للمراحل الجنسية جعلت من الصعب دراسة P. falciparum gametocytes ، وبيولوجيا انتقال العدوى ومراحل البعوض. في السنوات الأخيرة، وقد نشرت عدة أساليب التي ساعدت المختبرات في إنشاء ثقافات gametocyte^{9،10،11،12}. تصف هذه المخطوطة بروتوكولا موحدا وموثوقا به لخلايا P. falciparum التي يمكن أن تمثل موردا قيما لمجتمع أبحاث الملاريا. تمكن هذه الطريقة من الإنتاج القوي لخلايا اللعب الناضجة والمعدية التي تؤدي إلى جانب بروتوكول موحد لتغذية البعوض إلى إصابة البعوض موثوقة للغاية. تم إنشاء هذه الطرق للحفاظ على إمدادات غير منقطعة من خلايا اللعبة ، وطفيليات مرحلة البعوض. في هذه المخطوطة، نقوم بوصف بروتوكول شامل لثقافة الخلايا الشاغة(الشكل 1)،وإعداد مغذيات الأغشية الزجاجية، والعدوى بالبعوض باستخدام مغذيات الأغشية هذه (الشكل 2)،وتشريح البراغيث(الشكل 3)والغدة اللعابية للبعوض(الشكل 4)،وتحديد كمي للعدوى في البعوض بعد تشريح الغدد الوسطى واللعابية.

Protocol

تمت الموافقة على مجموعات الدم الموضحة أدناه من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لجامعة جونز هوبكنز. يتم استزراع P. falciparum في ال RBCs الطازجة في ظروف معقمة في منشأة مستوى السلامة البيولوجية 2 (BSL2) ويستخدم الحذر للتعامل مع المواد البيولوجية. بعد كل خطوة تنطوي على الدم أو منتجات الدم، يتم شطف كل الأواني البلاستيكية أو الأواني الزجاجية مع تبييض 10٪ داخل غطاء محرك السيارة قبل التخلص السليم.

1. الكواشف وإعداد

1. الطفيلي عزل P. falciparum NF54 (انظر جدول المواد)تم استخدامه، والتي يمكن أن تنتج gametocytes المعدية لمدة تصل إلى شهرين بينما في الثقافة المستمرة.
   ملاحظة: ليست كل خطوط الطفيليات المكيفة الثقافة تنتج خلايا اللعبة، وعزلات NF54 مرور منخفض هي الأكثر اتساقا.
2. O⁺ Erythrocytes: تمييع الدم كله عن طريق إضافة حجم متساو من وسائط RPMI 1640 والطرد المركزي في 500 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الدوار سوينغ مع إلغاء التسارع تعيين في 0. إزالة بعناية معطف supernatant ومهرج (شريط أبيض بين البلازما وخلايا الدم الحمراء معبأة، والذي يحتوي على معظم خلايا الدم البيضاء والصفائح الدموية) وإضافة حجم متساو من RPMI. كرر خطوة الغسيل مرتين وبعد الغسيل النهائي أضف حجم بيليه واحد من RPMI للحصول على 50٪ من الدم للتخزين عند 4 درجة مئوية.
   ملاحظة: تنضج الخلايا اللعبة على مدى أسبوعين مما يجعل من الأهمية بمكان أن تبدأ الثقافات مع كرات الدم الحمراء الطازجة ، وعادة ما تعمل كرات الدم الحمراء المرسومة في غضون أسبوع بشكل جيد.
3. O⁺ مصل الإنسان: تجمع ما لا يقل عن 6 وحدات من المصل معا لتقليل تأثير الاختلاف الطبيعي في المصل من مختلف الأفراد. تعقيم المصل البشري المجمع باستخدام قارورة الترشيح 0.2 ميكرومتر. Aliquot في أجزاء من 50 مل أو أقل على أساس الحاجة وتخزينها في -20 درجة مئوية.
   ملاحظة: يجب أن تكون الكريات الحمراء والمصل من فصيلة دم متوافقة لثقافات P. falciparum.
4. 500x حل نقص الأكزانثين (100 مل): حل 0.5 غرام من نقص الأكزانثين في 100 مل من 1 M NaOH. تصفية تعقيم وجعل 5-10 مل aliquots للتخزين. يمكن تخزين المخزونات حتى سنة عند -20 درجة مئوية وإلى أسبوعين عند 4 درجات مئوية.
5. بيكربونات الصوديوم (اختياري): حل بيكربونات الصوديوم 7.5 غرام في 100 مل من الماء المتأين، ودرجة زراعة الأنسجة وتعقيم الفلتر بتصفية 0.2 ميكرومتر.
   ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول طريقة جرة الشمعة لتوفير ظروف ميكرويروفيلية ل P. falciparum في ثقافة المختبر ولا يتطلب بيكربونات الصوديوم. ومع ذلك ، إذا تم استزراع الطفيليات باستخدام مزيج غاز الملاريا (5٪ O₂و 5٪ CO₂ و 90٪ N₂₎، فمن المهم تكملة الوسائط الثقافية ببيكربونات الصوديوم بنسبة 0.2٪.
6. الوسائط الكاملة: لإعداد 500 مل من الوسائط الكاملة، أضف 1 مل من محلول نقص الأكزانتين و50 مل من المصل البشري المجمع إلى 500 مل من RPMI 1640. أضف 15 مل من بيكربونات الصوديوم بنسبة 7.5٪ إذا كنت تستخدم خليط غاز الملاريا. تخزين الوسائط كاملة في 4 °C وتجاهل إذا تغير لون الوسائط كاملة من البرتقالي إلى الوردي. لتجنب الهدر، قم بإجراء ما يكفي من الوسائط الكاملة لاستخدامها في غضون ثلاثة أيام.
7. وسائط النفخ (اختياري): جعل النفخ أو وسائط ookinete عن طريق حل 200 ملغ NaHCO₃، 5 ملغ Hypoxanthine و 100 ميكرولتر من حمض زانتورينيك (من مخزون 100 mM في الماء) إلى 100 مل من الوسائط غير المكتملة (RPMI 1640 مع الجلوتامين وHPES).
   ملاحظة: Exflagellation هو عملية تشكيل gamete الذكور داخل midgut من البعوض Anopheles الإناث بعد دقائق قليلة من أن يأخذ وجبة الدم المصابة gametocytes. الخلايا الجامتية الذكور من البلازموديوم تؤدي إلى 8 من الأمشاج الذكور بعد حدث النفخ. في المختبر ، تحدث هذه العملية تلقائيا عندما يتم خفض درجة حرارة الثقافة إلى درجة حرارة الغرفة (RT) ويمكن ملاحظتها في خلايا اللعب الناضجة المستزرعة.
8. N-أسيتيلغلوكوسامين (اختياري): جعل 500 mM الأسهم حل N-أسيتيل غلوكوسامين في الماء أو وسائل الإعلام غير مكتملة، aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية.
9. حلول NaCl: حل 0.9 غرام، 1.6 غرام و 12 غرام NaCl في 100 مل من المياه deionized درجة زراعة الأنسجة لجعل 0.9٪، 1.6٪ و 12٪ حلول NaCl. تصفية تعقيم مع مرشح 0.22 μm وتخزينها في 4 درجة مئوية.

2. P. falciparum ثقافة المرحلة اللاجنسية

1. لبدء ثقافة الطفيليات ، قم بإزالة قارورة مجمدة منخفضة من P. falciparum NF54 ، من خزان النيتروجين السائل وتذوب بسرعة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
2. نقل محتويات (~ 1 مل) إلى أنبوب الطرد المركزي المعقم 50 مل وd dropwise إضافة 0.2 حجم NaCl 12٪ prewarmed، في حين يهز بلطف أنبوب لضمان خلط حتى. احتضان لمدة 5 دقائق في RT مع اهتزاز لطيف متقطعة.
3. إضافة 9 وحدات تخزين من 1.6٪ NaCl دروبوايز، مع الاستمرار في خلط لطيف. طرد محتويات في 500 × ز لمدة 5 دقائق في RT، تجاهل بعناية supernatant. إضافة 9 وحدات تخزين من 0.9٪ NaCl دروبوايز، مع التأكد من مزيج باستمرار بيليه الطفيلي. الطرد المركزي مرة أخرى في 500 × ز لمدة 5 دقائق في RT. إزالة الطفيليات العملاقة وإعادة الإنفاق في 5 مل من وسائل الإعلام الكاملة.
4. نقل محتويات إلى بئر واحد من لوحة 6 زراعة الأنسجة جيدا وإضافة 100-200 ميكرولتر من RBCs معبأة.
5. احتضان ثقافة الطفيليات عند 37 درجة مئوية في جرة شمعة أو في غرفة حاضنة وحدات تطهيرها مع مزيج غاز خاص من 5٪ O_2،5٪ CO₂ و 90٪ N₂.
6. استبدال وسائل الإعلام كل يوم ورصد النمو عن طريق إجراء مسحة دم رقيقة عن طريق رسم عدد قليل من microliters من طبقة RBC استقر بعد أن تم يستنشق الثقافة الخارقة خلال تغيير وسائل الإعلام العادية.
7. استخدام زجاج معقم باستور ماصة لرسم ثم اضغط في وسط الشريحة الزجاجية لنقل قطرة من الثقافة إلى الشريحة. ضع شريحة زجاجية أخرى أمام قطرة ورسمها مرة أخرى للاتصال RBCs، ودفع بسرعة إلى الأمام في حركة واحدة لجعل تشويه رقيقة من طبقة أحادية RBC.
8. ضع الشريحة أفقيا على رف التجفيف ودعها تجف. إصلاح مسحة الدم عن طريق إسقاط الميثانول المطلق على تشويه. السماح للطاخة الثابتة لتجف تماما ومن ثم صب بعناية 10٪ Geimsa-وصمة عار مخففة حديثا في الماء، حتى يتم تغطية مسحة الدم تماما. السماح للخلايا بقعة لمدة 15 دقيقة تقريبا.
9. اغسل البقعة الزائدة عن طريق شطف الشريحة تحت مياه الصنبور النظيفة والسماح للشرائح بالجفاف في وضع عمودي.
10. تحديد parasitemia من خلال عرض مسحة دم رقيقة على المجهر باستخدام النفط الغمر 100x الهدف. عد عدد الكريات الحمراء المصابة بين ما مجموعه ما لا يقل عن 500 RBCs لتحديد الطفيليات في المئة.

3. P. falciparum ثقافة الخلايا اللعبة

ملاحظة: تستغرق ثقافات Gametocyte أسبوعين لإنتاج خلايا اللعب الناضجة المعدية للبعوض. وترد الخطوات من ثقافة gametocyte في الشكل 1. P. falciparum يعزل عادة ما تفقد القدرة على إنتاج gametocyte بعد فترة طويلة في الثقافة المختبر¹³. لضمان جودة الخلايا اللعبة، ينبغي أن تبدأ الثقافة من ثقافة التغذية مرور منخفضة، وليس أكثر من 2 أشهر من العمر منذ ذوبان الجليد. وسائط دافئة مسبقا إلى 37 درجة مئوية، وتنفيذ جميع الإجراءات على مجموعة أكثر دفئا الشريحة في 38 درجة مئوية. تأكد من أن ثقافات الخلايا الغامية ليست خارج الحاضنة لفترة طويلة لتقليل تقلبات درجة الحرارة.

1. بذور ثقافة gametocyte (اليوم 0) باستخدام ثقافة التغذية المرحلة اللاجنسي مختلطة في 0.3-1٪ parasitemia في 4٪ hematocrit.
2. لإعداد ثقافة الستة gametocyte جيدا، الطرد المركزي 5 مل من الثقافة المغذية في 500 × ز لمدة 5 دقائق في RT. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه في 30 مل من وسائل الإعلام الكاملة.
3. إضافة 1.2 مل من RBCs معبأة، مزيج، والاستغناء عن 5 مل إلى كل بئر من لوحة بئر 6 واحتضان في جرة شمعة في 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: تستند ثقافة Gametocyte التي تم إعدادها الموضحة أعلاه إلى ثقافة تغذية المرحلة اللاجنسية المختلطة بنسبة 5٪ من الطفيليات.
4. تغيير وسائل الإعلام يوميا لمدة 15-18 يوما، دون إضافة الدم الطازج، عن طريق التجسس بعناية حول 70-80٪ ثقافة فائقة لتجنب إزالة خلايا الدم.
5. إضافة 5 مل من الوسائط الكاملة الطازجة إلى كل بئر. أثناء تغيير الوسائط ، أضف ببطء الوسائط باستخدام ماصة مصلية ضد جدار البئر لتجنب إزعاج طبقة RBC المستقرة.
   ملاحظة: لأن 1-2 مل من وسيط الثقافة سيتم ترك أثناء تغيير الوسائط، سيكون إجمالي حجم الثقافة بين 6-7 مل، بعد اليوم الأول من ثقافة الخلايا اللعبة. أثناء تكييف هذا البروتوكول ، من المستحسن إجراء مسحات الدم كل يوم بديل للتأكد من صحة الطفيليات. جعل مسحة الدم يمكن أن تستنفد في كثير من الأحيان عدد الخلايا في الثقافة. لتجنب هذا، رسم حجم صغير جدا.
6. لقياس كريات الدم الناضجة، قم بإجراء مسحة دموية بين الأيام 15-18 واحص عدد خلايا اللعب الناضجة بين العدد الإجمالي للخلايا.
   ملاحظة: يمكن بسهولة التعرف على gametocytes ناضجة مع شكل الهلال الكلاسيكية مع نهايات مدورة على نحو سلس(الشكل 5B).
7. عد ما لا يقل عن 1000 RBCs وحساب النسبة المئوية للخلايا الارتلحمية المصابة gametocytes ناضجة.
8. لقياس أحداث النفخ، خذ 200 ميكرولتر من زراعة الخلايا الغامية والطرد المركزي عند 500 × ز لمدة 5 دقائق في RT في أنبوب مسبق الإحماء. Resuspend بيليه في 20 ميكرولتر من وسائل الإعلام النفخ ونقلها إلى شريحة زجاجية مع زلة الغطاء.
9. بعد 15 دقيقة حضانة في درجة حرارة الغرفة، والبدء في عد مراكز النفخ في وضع التباين المرحلة باستخدام الهدف 10x. عد مراكز النفخ في أربعة حقول على الأقل لحساب أحداث النفخ.
   ملاحظة: تم وصف منهجية مفصلة من مقايسة النفخ في وقت سابق Delves وآخرون¹⁰. يعتبر أكثر من 20 حدثا للنفخ في كل حقل مناسبة لإجراء فحص تغذية الأغشية.
10. عادة ما يكون لدى ثقافات الخلايا اللعبة مستويات منخفضة من المراحل اللاجنسية المتبقية. إذا كانت التجربة تتطلب gametocytes نقية، علاج الثقافة مع 50 mM N-أسيتيل غلوكوسامين.
11. إضافة 0.5 مل من N-أسيتيلغلوكوسامين من محلول الأسهم 10x لكل بئر (5 مل) لمدة لا تقل عن 3 أيام مع تغيير الوسائط لمسح المراحل اللاجنسية المتبقية.
    ملاحظة: N-أسيتيلغلوكوسامين يمكن منع غزو merozoites ارتكبت جنسيا جدا, وينبغي أن يبدأ العلاج إلا بعد يوم 7 من ثقافة gametocyte.

4. عدوى البعوض باستخدام معيار فحص تغذية الأغشية (SMFA)

ملاحظة: يمكن تغذية الخلايا المغموسة المزروعة في المختبر للبعوض باستخدام مغذيات الأغشية الزجاجية. يظهر إعداد جهاز تغذية الدم في الشكل 2. كما هو موضح أعلاه ، حافظ دائما على خلايا اللعب عند 37 درجة مئوية لتجنب التنشيط قبل تناولها بواسطة البعوض. قبل الحرب من البلاستيك، والكواشف والمعدات المستخدمة مع ثقافة gametocyte إلى 37 درجة مئوية.

1. تجويع البعوض Anopheles الإناث 3-7 أيام من العمر عن طريق إزالة مياه السكر لمدة 6.5 ساعة أو بين عشية وضحاها قبل تغذية الغشاء.
2. نقلها باستخدام الآلية أو الفم تعمل aspirators إلى أكواب الورق مغطاة طبقة مزدوجة من نسيج شبكة غرامة. بدلا من ذلك، قم بهدم البعوض في غرفة باردة أو ثلاجة لنقله إلى أكواب الورق.
   ملاحظة: يمكن استخدام كوب بحجم نصف لتر لإطعام ما يصل إلى 100 بعوضة.
3. غسل الطرد المركزي الدم عند 500 × غرام لمدة 5 دقائق في RT وتخلص من الناطور. إضافة حجم متساو من مصل الإنسان المذاب حديثا لإعادة تشكيل الدم كله. نقل الدم ومصل مزيج إلى حمام الماء تعيين في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
4. نقل ثقافة gametocyte إلى أنبوب بلاستيكي 15 مل مسبقا والطرد المركزي في 600 × ز لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية. يستنشق بعناية الثقافة supernatant وجعل مسحة الدم رقيقة لتحديد gametocytemia ناضجة كما هو موضح أعلاه.
5. لجعل تغذية الدم النهائية، تمييع بيليه الخلايا البدينة إلى التركيز المطلوب باستخدام الدم الكامل المعاد تشكيله. حافظ على تغذية الدم عند 37 درجة مئوية حتى يصبح البعوض ومغذيات الزجاج جاهزة.
   ملاحظة: تركيزات gametocyte ناضجة بين 0.02 إلى 0.3٪ سوف توفر العدوى البعوض متسقة. ومع ذلك ، فمن المستحسن تحسين gametocytemia عن طريق تغذية تركيزات مختلفة لأكواب مختلفة من البعوض.
6. تأكد من أن مغذيات الغشاء الزجاجي لها فتحتان ، فتحة علوية ضيقة لمواصة الدم المصاب وفتحة أسفل لمرفق الغشاء. قطع فيلم البارافين إلى مربعات، وتمتد إلى سمك حتى والتمسك بفتح وحدة التغذية لإنشاء مقصورة مختومة لتغذية الدم.
7. إرفاق مغذيات الأغشية إلى حمام المياه الدورة الدموية عن طريق ربط أنابيب على كل جانب للسماح بمرور المياه الدافئة من خلال سترة حول مغذيات الغشاء.
   ملاحظة: يمكن توصيل عدة مغذيات زجاجية في سلسلة لاستيعاب ظروف التغذية المتعددة.
8. بعد توصيل جميع مغذيات لحمام الماء، تشغيله والتفتيش على أي تسرب.
9. ضع مغذيات في وسط المعاوضة على أكواب البعوض مع مغذيات من جانب الغشاء لأسفل وآمنة باستخدام المشابك أو الأشرطة. تأكد من عدم ميل مغذيات الأغشية إلى أي جانب للسماح حتى بتوزيع تغذية الدم والاتصال الوثيق للتغذية بأكملها بالمعاوضة على الأكواب ، للسماح للبعوض بالوصول من داخل الكأس.
10. ماصة حوالي 200-1000 ميكرولتر من تغذية الدم في مغذيات الأغشية.
    ملاحظة: يختلف حجم تغذية الدم استنادا إلى عدد البعوض وحجم وحدة تغذية الأغشية. لتغذية الزجاج 14 ملم و 50 البعوض استخدام 200 ميكرولتر من تغذية الدم.
11. تأكد من التحميل تم بشكل صحيح وتغذية الدم كانت مضافة على فيلم البارافين.
12. السماح للبعوض بالتغذية لمدة 30 دقيقة تقريبا مع مراقبة متقطعة.
    ملاحظة: ضرب البعوض بلطف مع الفم لتوفير_ثاني أكسيد الكربون الذي سوف تحفز تحسين تغذية الدم.
13. إزالة البعوض غير المنزعج عن طريق إسقاطها في غرفة باردة. فحص البعوض بشكل واضح للانتفاخ والاحمرار في البطن كعلامة على وجبة الدم الطازجة. بدلا من ذلك ، استخدم جهاز التنفس الذي يعمل بالفم لإزالة البعوض غير المغسول بشكل انتقائي.
14. التخلص من البعوض غير المغموس ، بعد نقعها في الإيثانول بنسبة 70٪ ووضع البعوض المغذ مرة أخرى في كوب البعوض.
15. أكواب البعوض قفص مزدوج ونقلها إلى حاضنة احتواء عالية محددة للبعوض المصابة بطفيلي الملاريا البشري P. falciparum.
16. ضع منصات القطن المنقوعة في السكروز بنسبة 10٪ على أكواب البعوض لتزويدها بوجبة سكر. استبدل منصات القطن كل يومين، حتى يتم تشريح البعوض.

5. البعوض تشريح منتصف القناة الهضمية وoocyst تحميل quantification

ملاحظة: يظهر تخطيطي لتشريح منتصف الغوت في الشكل 3.

1. 7-8 أيام بعد تغذية الدم، ونقل أكواب البعوض إلى 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لهدم البعوض.
2. نقل البعوض ليتم تشريحها إلى طبق بيتري على الجليد باستخدام ملقط غرامة يميل.
3. نقع البعوض في الإيثانول 70٪ لمدة 1-2 دقيقة للقتل الرحيم لهم. إضافة برنامج تلفزيوني إلى طبق بيتري لغسل الإيثانول بعد قتل جميع البعوض.
   ملاحظة: قبل إضافة برنامج تلفزيوني تأكد من أن جميع البعوض ميت.
4. جبل شريحة زجاجية على تشريح المجهر وماصة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في المركز. نقل بعوضة واحدة بعناية باستخدام ملقط في برنامج تلفزيوني وترك بقية البعوض في طبق بيتري على الجليد.
5. باستخدام ملقط ذو رؤوس دقيقة ، أمسك الجزء الثالث من البطن من الطرف الخلفي للبعوضة ومع ملقط ثان أمسك التقاطع بين الصدر والبطن. سحب البطن بلطف حتى يتعرض تماما midgut.
6. تجاهل بقية أنسجة البعوض ونقل midgut إلى شريحة نظيفة تحتوي على بضع قطرات من برنامج تلفزيوني.
7. عندما يتم تشريح العدد المطلوب من البعوض ، قم بإزالة PBS بعناية باستخدام ماصة ولطخة منتصف الطريق مع 0.2٪ mercurochrome لمدة 2-5 دقائق.
8. إزالة mercurochrome الزائدة وmidguts خط المتابعة على الشريحة بحيث يمكن تصورها بسهولة تحت المجهر الخفيف.
9. وضع زلة غطاء والعد oocysts على كل midgut تحت الهدف 10x. Oocysts وصمة عار وردية ودائرية في الشكل (الشكل 6C).

6. تشريح الغدة اللعابية البعوض وsporozoite تحميل quantification

ملاحظة: يظهر تخطيطي لتشريح الغدة اللعابية في الشكل 4.

1. 14-18 يوما بعد تغذية الدم، ضع أكواب البعوض في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   ملاحظة: من المهم الانتظار حتى يتوقف البعوض عن الحركة.
2. في انتظار البعوض لوقف التحرك، وإعداد أدوات لتشريح.
3. ضع لوحة زجاجية على مرحلة مجهر تشريح. إعداد 2 مجموعات من الإبر 25 G على 1 مل المحاقن و9 "باستور ماصة ومصباح مطاطي. ضع 70٪ EtOH وتشريح المتوسطة (HBSS، L-15 أو PBS) في لوحة بئر 6.
4. في الغرفة الباردة ، نقل البعوض المخدر في لوحة بئر 6 تحتوي على 70٪ EtOH. تحرك البعوض بلطف مع ملقط للتأكد من أن جميع البعوض غارق ، ثم نقل البعوض إلى وسيط التشريح باستخدام ملقط لغسل 70٪ EtOH.
5. الانتقال إلى غرفة التشريح ووضع البعوض على مرحلة المجهر تشريح.
6. إزالة المتوسطة الزائدة من البعوض، إضافة وسيطة جديدة حسب الضرورة أثناء تشريح. تجنب البعوض من الجفاف بعد الكثير من السائل يجعل تشريح أكثر صعوبة.
7. باستخدام حقنتين مع إبر 25 G، عقد الصدر البعوض والرأس، وسحب بلطف الرأس إلى أعلى لسحب الغدد اللعابية من الصدر.
8. فصل الغدد اللعابية من الرأس والصدر بإبرة.
9. وضع مؤقت الغدد اللعابية في قطرة منفصلة من المتوسط على لوحة زجاجية.
10. بعد تشريح 15-20 الغدد اللعابية، وجمعها في أنبوب الاحتفاظ منخفضة باستخدام ماصة باستور.
    ملاحظة: بمجرد دخول الغدد اللعابية إلى الجزء الواسع من ماصة باستور ، فإنها ستلتصق بالزجاج ومن الصعب إخراجها.
11. تدور الغدد اللعابية بيليه عن طريق نبض قصير في جهاز طرد مركزي أعلى الطاولة. إزالة وسيط تشريح دون تعطيل بيليه وإضافة 100 ميكرولتر من وسيط تشريح جديدة.
12. طحن الغدد اللعابية مع متجانس صغير لمدة 1 دقيقة للحصول على sporozoites.
13. ضع 10 ميكرولتر من وسيطة التشريح التي تحتوي على سبروزويت على مقياس الدم.
    ملاحظة: اعتمادا على عدد الغدد اللعابية، قد يحتاج المرء إلى تخفيف محلول سبروزويت إلى 1:10 إلى 1:50 مع المتوسطة قبل العد.
14. عد عدد sporozoites في اثنين من أربعة أرباع وحساب عدد sporozoites / البعوض :

النتائج

هنا نقدم نتائج من سلسلة من يغذي الأغشية باستخدام P. falciparum NF54 ثقافات gametocyte ولدت باستخدام البروتوكول أعلاه (انظر (الشكل 5). بدأت ثقافة Gametocyte مع ما يقرب من 0.5٪ ثقافة المرحلة المختلطة اللاجنسية في اليوم 0 ، والتي نمت إلى ذروة parasitemia من حوالي 15٪ بحلول اليوم 4 واليوم 5. كما هو موضح...

Discussion

وقد استخدمت الأساليب الموصوفة هنا بنجاح في معهد جونز هوبكنز لأبحاث الملاريا لأكثر من 10 سنوات^{15،16،17،18،19،20،21،22}. وقد استخدمت Gametocytes المنتجة باس?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Sugar solution
10ml serological pipet	Falcon	357551
15 ml conical tube	Falcon	352096
1ml serological pipet	Falcon	357521
25 ml serological pipet	Falcon	357535
37°C Incubator
50 ml conical tube	Falcon	352070
5ml serological pipet	Falcon	357543
6 well tissue culture plates	Falcon	353046
70% Ethanol
9" glass pipet	Fisherbrand	13-678-6B
Anopheles Mosquitoes	JHMRI, Insectary core		We use A. stephensi or A. gambiae (keele)
cell counter
Circulating water bath
fine tip forceps	Fisherbrand	12-000-122
Geimsa stain	Sigma	GS1L
Glass desiccator
Glass membrane feeder	Chemglass Life Sciences	CG183570
Glass slides	Fisherbrand	12-552-3
HBSS	Sigma	H6648
Human Blood O+	JHU		Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit
Human Serum O+	Interstate blood bank		Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C.
Hypoxanthine	Sigma	H9337	Make 500x stock in 1M NaOH
Mercurochrome	Sigma	M7011	Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed
Micro Pipette
Microscope	Olympus		Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work.
Mosquito cups	Neptune cups
N-acetylglucosamine	Sigma	A3286	Optional and needed only when pure gametocytes are required.
Netting			Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding
Parafilm
PBS
Petri dish	Thermo Scientific	249964
Pipet tips
Pipetman
Plasmodium falciparum NF54	BEI Resources	MRA-1000	Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply
RPMI 1640	Corning	CV-041-CV	Media contains glutamine and HEPES
Slide warmer
Sodium bicarbonate	Sigma	S6297	Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation
water bath
Xanthurenic Acid	Sigma	D120804	For flagellation media