Plasmodium falciparum Cultivo de gametocitos e infección por mosquitos a través de la alimentación artificial por membrana

Resumen

Las investigaciones detalladas sobre las etapas de los mosquitos de los parásitos de la malaria son fundamentales para diseñar estrategias efectivas de bloqueo de la transmisión. Este protocolo demuestra cómo cultivar eficazmente gametocitos infecciosos y luego alimentar a estos gametocitos a los mosquitos para generar etapas de mosquito de P. falciparum.

Resumen

El paludismo sigue siendo uno de los problemas de salud pública más importantes, causando una morbilidad y mortalidad significativas. La malaria es una enfermedad transmitida por mosquitos transmitida a través de una picadura infecciosa del mosquito Anopheles hembra. El control de la malaria eventualmente se basará en una multitud de enfoques, que incluyen formas de bloquear la transmisión hacia, a través y desde los mosquitos. Para estudiar las etapas de los mosquitos de los parásitos de la malaria en el laboratorio, hemos optimizado un protocolo para cultivar gametocitos Plasmodium falciparum altamente infecciosos, una etapa del parásito requerida para la transmisión del huésped humano al mosquito vector. Los gametocitos de P. falciparum maduran a través de cinco pasos morfológicamente distintos, lo que toma aproximadamente 1-2 semanas. El cultivo de gametocitos descrito en este protocolo se completa en 15 días y son infecciosos para los mosquitos desde los días 15-18. Estos protocolos fueron desarrollados para mantener un ciclo continuo de infección de gametocitos competentes y para mantener el suministro ininterrumpido de las etapas del mosquito del parásito. Aquí, describimos la metodología del cultivo de gametocitos y cómo infectar a los mosquitos con estos parásitos utilizando alimentadores de membrana de vidrio.

Introducción

La malaria es causada por parásitos Plasmodium y se transmite a sus huéspedes vertebrados a través de la picadura infecciosa de mosquitos Anopheles hembra. Según el informe de la Organización Mundial de la Salud (OMS) de 2019, se estima que hubo 405.000 muertes, de un total de 228 millones de casos de malaria¹. La mayoría de las muertes relacionadas con el paludismo se concentraron en la región de África, especialmente entre los niños menores de cinco años. Si bien la tasa general de incidencia de la malaria ha disminuido a nivel mundial desde 2010, en los últimos años la disminución se ha estancado y se necesitan urgentemente estrategias de control adicionales para eliminar la enfermedad.

Las etapas sanguíneas asexuales cíclicas de los parásitos de la malaria causan patogénesis de la enfermedad y un pequeño subconjunto de estos se diferencian en gametocitos femeninos y masculinos. Los gametocitos de Plasmodium falciparum son únicos en la naturaleza, ya que tardan de 7 a 10 días en desarrollarse a través de cinco etapas morfológicamente distintas. Los gametocitos inmaduros de los estadios I a IV se secuestran en el parénquima de la médula ósea y permanecen en gran medida ausentes de la circulación periférica^2,3,4,5. Los eritrocitos infectados con gametocitos maduros en estadio V se liberan en el torrente sanguíneo y circulan libremente para ser absorbidos por los mosquitos. Una vez dentro del intestino medio del mosquito, los gametocitos se activan, a través de un cambio de temperatura y exposición al ambiente del intestino medio, se transforman en gametos femeninos y masculinos y comienzan el desarrollo de las etapas del mosquito, que culmina con las etapas infecciosas de los esporozoítos en las glándulas salivales del mosquito^6,7.

Desde que Trager y Jenson⁸ describieron un método estandarizado para cultivar P. falciparum,los estudios sobre las etapas sanguíneas asexuales han avanzado mucho. Sin embargo, la falta de un sistema de cultivo confiable para las etapas sexuales ha dificultado el estudio de los gametocitos de P. falciparum, la biología de la transmisión y las etapas de los mosquitos. En los últimos años, se han publicado varios métodos que han ayudado a los laboratorios a establecer cultivos de gametocitos^9,10,11,12. Este manuscrito describe un protocolo estandarizado y confiable para cultivar gametocitos de P. falciparum que puede representar un recurso valioso para la comunidad de investigación de la malaria. Este método permite la producción robusta de gametocitos maduros e infecciosos que, junto con un protocolo estandarizado de alimentación de mosquitos, da como resultado una infectividad de mosquitos altamente confiable. Estos métodos se establecieron para mantener el suministro ininterrumpido de gametocitos y parásitos en etapa de mosquito. En este manuscrito, describimos un protocolo exhaustivo de cultivo de gametocitos(Figura 1),preparación de comederos de membrana de vidrio e infección de mosquitos utilizando estos alimentadores de membrana(Figura 2),disección del intestino medio(Figura 3)y glándula salival de mosquitos(Figura 4),y cuantificación de la infección en mosquito después de la disección de intestino medio y glándula salival.

Protocolo

Las colecciones de sangre que se describen a continuación han sido aprobadas por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Johns Hopkins. P. falciparum se cultiva en glóbulos rojos frescos en condiciones estériles en una instalación de nivel de bioseguridad 2 (BSL2) y se utiliza precaución para manipular materiales biológicos. Después de cada paso que involucra sangre o productos sanguíneos, cada vajilla de plástico o cristalería se enjuaga con lejía al 10% dentro de la capucha antes de su eliminación adecuada.

1. Reactivos y preparación

1. Se utilizó el aislado de parásito P. falciparum NF54 (ver Tabla de Materiales),que puede producir gametocitos infecciosos hasta por dos meses mientras está en cultivo continuo.
   NOTA: No todas las líneas de parásitos adaptadas al cultivo producen gametocitos, y los aislados de NF54 de paso bajo son los más consistentes.
2. O⁺ Eritrocitos: Diluir la sangre entera agregando el mismo volumen de medios RPMI 1640 y centrifugar a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente en un rotor oscilante con desaceleración establecida en 0. Retire cuidadosamente la capa sobrenadante y buffy (una banda blanca entre el plasma y los eritrocitos empaquetados, que contiene la mayoría de los glóbulos blancos y plaquetas) y agregue el mismo volumen de RPMI. Repita el paso de lavado dos veces y después del lavado final agregue un volumen de pellet de RPMI para obtener un 50% de hematocrito para el almacenamiento a 4 ° C.
   NOTA: Los gametocitos maduran durante un período de dos semanas, lo que hace que sea fundamental comenzar los cultivos con eritrocitos frescos, generalmente los eritrocitos extraídos dentro de una semana funcionan bien.
3. O⁺ Suero Humano: Agrupa al menos 6 unidades de suero para minimizar el efecto de la variación normal en el suero de diferentes individuos. Esterilizar el suero humano agrupado utilizando matraces de filtración de 0,2 μm. Alícuota en porciones de 50 ml o menos según la necesidad y almacenar a -20 °C.
   NOTA: Los eritrocitos y el suero deben ser de un tipo de sangre compatible para los cultivos de P. falciparum.
4. Solución de hipoxantina 500x (100 ml): Disolver 0,5 g de hipoxantina en 100 ml de 1 m de NaOH. Esterilizar el filtro y hacer alícuotas de 5-10 ml para el almacenamiento. Las existencias se pueden almacenar hasta un año a -20 °C y hasta 2 semanas a 4 °C.
5. Bicarbonato de sodio (opcional): Disolver 7,5 g de bicarbonato de sodio en 100 ml de agua desionizada de grado de cultivo de tejidos y esterilizar con filtro de 0,2 μm.
   NOTA: Este protocolo utiliza el método del frasco de velas para proporcionar condiciones microaerofílicas para el cultivo in vitro de P. falciparum y no requiere bicarbonato de sodio. Sin embargo, si los parásitos se cultivan utilizando una mezcla de gases contra la malaria (5% O_2,5% CO₂ y 90% N_2),es importante complementar los medios de cultivo con bicarbonato de sodio al 0,2%.
6. Medios completos: Para preparar 500 ml de medios completos, agregue 1 ml de solución de hipoxantina y 50 ml de suero humano agrupado a 500 ml de RPMI 1640. Agregue 15 ml de bicarbonato de sodio al 7.5% si usa una mezcla de gases contra la malaria. Guarde los soportes completos a 4 °C y deséchelos si el color de los medios completos cambia de naranja a rosa. Para evitar el desperdicio, haga suficientes medios completos para ser utilizados dentro de los tres días.
7. Medios de exflagelación (Opcional): Realizar medios de exflagelación u ookinete disolviendo 200 mg de NaHCO₃, 5 mg de hipoxantina y 100 μL de ácido xanturénico (de 100 mM de caldo en agua) a 100 mL de medios incompletos (RPMI 1640 con glutamina y HEPES).
   NOTA: La exflagelación es el proceso de formación de gametos masculinos dentro del intestino medio del mosquito Anopheles hembra pocos minutos después de que toma harina de sangre infectada con gametocitos. Los gametocitos masculinos de Plasmodium dan lugar a 8 gametos masculinos después de un evento de exflagelación. In vitro, este proceso ocurre espontáneamente cuando la temperatura de cultivo se reduce a temperatura ambiente (RT) y se puede observar en gametocitos maduros cultivados.
8. N-acetilglucosamina (opcional): Hacer 500 mM de solución de N-acetilglucosamina en agua o medios incompletos, alícuota y almacenar a -20 °C.
9. Soluciones de NaCl: Disolver 0,9 g, 1,6 g y 12 g de NaCl en 100 ml de agua desionizada de grado de cultivo de tejidos para hacer soluciones de NaCl al 0,9%, 1,6% y 12%. Esterilizar el filtro con un filtro de 0,22 μm y conservar a 4 °C.

2. Cultura de la etapa asexual de P. falciparum

1. Para comenzar el cultivo del parásito, retire un vial congelado de paso bajo de P. falciparum NF54, del tanque de nitrógeno líquido y descongele rápidamente en el baño de agua a 37 ° C.
2. Transfiera el contenido (~ 1 ml) a un tubo de centrífuga estéril de 50 ml y agregue gota a gota 0.2 de NaCl al 12% precalentado, mientras agita suavemente el tubo para garantizar una mezcla uniforme. Incubar durante 5 min en RT con agitación suave intermitente.
3. Agregue 9 volúmenes de NaCl al 1.6% en forma de gota, mientras continúa con una mezcla suave. Centrifugar el contenido a 500 x g durante 5 min en RT, desechar cuidadosamente el sobrenadante. Agregue 9 volúmenes de NaCl al 0.9% en forma de gota, mientras se asegura de mezclar constantemente el pellet de parásito. Centrifugar de nuevo a 500 x g durante 5 min en RT. Retire el sobrenadante y resuspenda los parásitos en 5 ml de medios completos.
4. Transfiera el contenido a un pozo de una placa de cultivo de tejido de 6 pozos y agregue 100-200 μL de glóbulos rojos empaquetados.
5. Incubar el cultivo de parásitos a 37 °C en un frasco de vela o en una cámara de incubación modular purgada con una mezcla especial de gases de 5% O_2,5% CO₂ y 90% N_2.
6. Reemplace los medios todos los días y controle el crecimiento haciendo un frotis de sangre delgado extrayendo algunos microlitros de la capa de glóbulos rojos asentada después de que el sobrenadante de cultivo se haya aspirado durante el cambio de medios regular.
7. Use pipeta Pasteur de vidrio estéril para dibujar y luego toque en el centro del portaobjetos de vidrio para transferir una gota de cultivo al portaobjetos. Coloque otro portaobjetos de vidrio frente a la gota y vuelva a dibujarla para que entre en contacto con los glóbulos rojos, empujándolo rápidamente hacia adelante en un solo movimiento para hacer un frotis delgado de monocapa de glóbulos rojos.
8. Coloque la corredera horizontalmente sobre una rejilla de secado y déjela secar al aire. Arregle el frotis de sangre dejando caer metanol absoluto sobre el frotis. Deje que el frotis fijo se seque completamente y luego vierta cuidadosamente el 10% de la mancha de Geimsa recién diluida en agua, hasta que el frotis de sangre esté completamente cubierto. Permita que las células se manchen durante aproximadamente 15 min.
9. Lave el exceso de manchas enjuagando el portaobjetos con agua limpia del grifo y deje que los toboganes se sequen en posición vertical.
10. Determine la parasitemia viendo un frotis de sangre delgada en un microscopio utilizando el objetivo de inmersión en aceite 100x. Cuente el número de eritrocitos infectados entre un total de al menos 500 glóbulos rojos para determinar el porcentaje de parasitemia.

3. Cultivo de gametocitos de P. falciparum

NOTA: Los cultivos de gametocitos tardan dos semanas en producir gametocitos maduros infecciosos a los mosquitos. Los pasos de la cultura de los gametocitos se describen en la Figura 1. Los aislados de P. falciparum suelen perder la capacidad de producir gametocitos después de un cultivo in vitro a largo plazo¹³. Para garantizar la calidad de los gametocitos, el cultivo debe iniciarse a partir de un cultivo alimentador de paso bajo, de no más de 2 meses de edad desde la descongelación. Precalenta el medio a 37 °C y realice todos los procedimientos en un conjunto de calentadores deslizantes a 38 °C. Asegúrese de que los cultivos de gametocitos no estén fuera de la incubadora durante un período prolongado para minimizar las fluctuaciones de temperatura.

1. Sembrar el cultivo de gametocitos (día 0) utilizando cultivo alimentador mixto de etapa asexual al 0.3-1% de parasitemia al 4% de hematocrito.
2. Para establecer un cultivo de gametocitos de seis pozos, centrífuga 5 ml de cultivo alimentador a 500 x g durante 5 minutos en RT. Deseche el sobrenadante y vuelva a colocar el pellet en 30 ml de soporte completo.
3. Agregue 1.2 ml de glóbulos rojos empacados, mezcle y dispense 5 ml a cada pozo del plato de 6 pozos e incube en un frasco de velas a 37 ° C.
   NOTA: El cultivo de gametocitos establecido anteriormente se basa en un cultivo alimentador de etapa asexual mixta con un 5% de parasitemia.
4. Cambie los medios diariamente durante 15-18 días, sin la adición de sangre fresca, aspirando cuidadosamente alrededor del 70-80% de sobrenadante de cultivo para evitar la eliminación de células sanguíneas.
5. Agregue 5 ml de medios completos frescos a cada pozo. Mientras cambia de medio, agregue lentamente el medio usando una pipeta serológica contra la pared del pozo para evitar perturbar la capa de glóbulos rojos asentada.
   NOTA: Debido a que se dejarán 1-2 ml del medio de cultivo durante el cambio de medio, el volumen total de cultivo estará entre 6-7 ml, después del día 1 de cultivo de gametocitos. Al adaptar este protocolo, es recomendable hacer frotis de sangre todos los días alternos para asegurarse de que los parásitos estén sanos. Hacer un frotis de sangre a menudo puede agotar el número de células en cultivo. Para evitar esto, dibuja un volumen muy pequeño.
6. Para cuantificar la gametocitemia madura, hacer frotis de sangre entre los días 15-18 y contar el número de gametocitos maduros entre el número total de células.
   NOTA: Los gametocitos maduros se pueden identificar fácilmente con su clásica forma de media luna con extremos redondeados lisos(Figura 5B).
7. Cuente un mínimo de 1.000 glóbulos rojos y calcule el porcentaje de glóbulos rojos infectados con gametocitos maduros.
8. Para cuantificar los eventos de exflagelación, tome 200 μL de cultivo de gametocitos y centrífuga a 500 x g durante 5 min a RT en un tubo precalentado. Vuelva a colocar el pellet en 20 μL de medio de exflagelación y transfiéralo a un portaobjetos de vidrio con deslizamiento de cubierta.
9. Después de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, comience a contar los centros de exflagelación en modo de contraste de fase utilizando el objetivo 10x. Cuente los centros de exflagelación en al menos cuatro campos para calcular los eventos de exflagelación.
   NOTA: Una metodología detallada del ensayo de exflagelación ha sido descrita anteriormente por Delves et al¹⁰. Más de 20 eventos de exflagelación por campo se consideran adecuados para el ensayo de alimentación por membrana.
10. Los cultivos de gametocitos suelen tener bajos niveles de etapas asexuales residuales. Si el experimento requiere gametocitos puros, trate el cultivo con 50 mM de N-acetilglucosamina.
11. Agregue 0.5 ml de N-acetilglucosamina de 10 veces la solución de caldo por pozo (5 ml) durante un mínimo de 3 días mientras cambia de medio para eliminar las etapas asexuales residuales.
    NOTA: La N-acetilglucosamina también puede bloquear la invasión de merozoitos sexualmente comprometidos, el tratamiento debe iniciarse solo después del día 7 del cultivo de gametocitos.

4. Infección por mosquitos utilizando el ensayo estándar de alimentación por membrana (SMFA)

NOTA: Los gametocitos cultivados in vitro se pueden alimentar a los mosquitos utilizando alimentadores de membrana de vidrio. La configuración del aparato de alimentación sanguínea se muestra en la Figura 2. Como se describió anteriormente, siempre mantenga los gametocitos a 37 ° C para evitar la activación antes de que sean ingeridos por los mosquitos. Artículos de plástico, reactivos y equipos precalentados utilizados con cultivo de gametocitos a 37 °C.

1. Matar de hambre a los mosquitos Anopheles hembra de 3-7 días de edad eliminando su agua azucarado durante 6.5 h o durante la noche antes de la alimentación por membrana.
2. Transfiéralos utilizando aspiradores motorizados o operados por la boca a vasos de papel cubiertos con doble capa de tela de malla fina. Alternativamente, derribe a los mosquitos en una cámara frigorífica o refrigerador para transferirlos a los vasos de papel.
   NOTA: La taza del tamaño de una pinta se puede usar para alimentar hasta 100 mosquitos.
3. Centrifugar la sangre lavada a 500 x g durante 5 min en RT y desechar sobrenadante. Agregue un volumen igual de suero humano recién descongelado para reconstituir la sangre entera. Transfiera la mezcla de sangre y suero al baño de agua a 37 °C durante 30 min.
4. Transfiera el cultivo de gametocitos a un tubo de plástico precalentado de 15 ml y centrífuga a 600 x g durante 5 min a 37 °C. Aspire cuidadosamente el sobrenadante de cultivo y haga un frotis de sangre delgado para determinar la gametocitemia madura como se describió anteriormente.
5. Para hacer la alimentación sanguínea final, diluya el pellet de gametocitos a la concentración deseada utilizando sangre total reconstituida. Mantenga la alimentación de sangre a 37 ° C hasta que los mosquitos y los comederos de vidrio estén listos.
   NOTA: Las concentraciones de gametocitos maduros entre 0.02 a 0.3% proporcionarán una infectividad constante de mosquitos. Sin embargo, es aconsejable optimizar la gametocitemia alimentando varias concentraciones a diferentes tazas de mosquitos.
6. Asegúrese de que los alimentadores de membrana de vidrio tengan dos aberturas, una abertura superior estrecha para pipetear la sangre infectada y una abertura inferior para la fijación de la membrana. Corte una película de parafina en cuadrados, estírela a un grosor uniforme y péguese a la abertura del comedero para crear un compartimento sellado para la alimentación de sangre.
7. Conecte los alimentadores de membrana a un baño de agua circulatorio conectando tubos a cada lado para permitir el paso de agua tibia a través de la camisa alrededor de los alimentadores de membrana.
   NOTA: Se pueden conectar varios alimentadores de vidrio en serie para adaptarse a múltiples condiciones de alimentación.
8. Después de que todos los comederos estén conectados al baño de agua, encendíelo e inspeccione si hay fugas.
9. Coloque los comederos en el centro de la red en las tazas de mosquitos con el lado de la membrana hacia abajo y asegure los comederos con abrazaderas o cinta adhesiva. Asegúrese de que los alimentadores de membrana no estén inclinados hacia ningún lado para permitir una distribución uniforme de la alimentación sanguínea y el contacto cercano de todo el comedero con la red en las tazas, para permitir el acceso de los mosquitos desde el interior de la taza.
10. Pipetee alrededor de 200-1000 μL de alimentación sanguínea en los alimentadores de membrana.
    NOTA: El volumen de la alimentación sanguínea variará según el número de mosquitos y el tamaño del alimentador de membrana. Para el comedero de vidrio de 14 mm y 50 mosquitos use 200 μL de alimento sanguíneo.
11. Asegúrese de que la carga se realizó correctamente y que la alimentación con sangre se superpuso en la película de parafina.
12. Permita que los mosquitos se alimenten durante unos 30 minutos con monitoreo intermitente.
    NOTA: Sople suavemente los mosquitos con la boca para proporcionar CO₂ que inducirá una mejor alimentación de la sangre.
13. Elimine los mosquitos no amamantados derribándolos en una habitación fría. Inspeccione visiblemente los mosquitos en busca de protuberancias y enrojecimiento en el abdomen como un signo de comida de sangre fresca. Alternativamente, use un aspirador operado por la boca para eliminar selectivamente los mosquitos no amamantados.
14. Deseche los mosquitos no alimentados, después de remojarlos en etanol al 70% y vuelva a poner los mosquitos alimentados en la taza del mosquito.
15. Tazas de mosquitos de jaula doble y transfiéralas a una incubadora de alta contención especificada para mosquitos infectados con el parásito de la malaria humana P. falciparum.
16. Coloque almohadillas de algodón empapadas en sacarosa al 10% en las tazas de mosquitos para proporcionarles harina de azúcar. Reemplace las almohadillas de algodón cada dos días, hasta que los mosquitos sean diseccionados.

5. Disección del intestino medio del mosquito y cuantificación de la carga de ooquistes

NOTA: En la Figura 3se muestra un esquema de disección del intestino medio.

1. 7-8 días después de la alimentación con sangre, transfiera las tazas de mosquitos a 4 ° C durante 10 minutos para derribar mosquitos.
2. Transfiera los mosquitos para ser diseccionados a una placa de Petri en hielo usando forrórceps de punta fina.
3. Remoje los mosquitos en etanol al 70% durante 1-2 minutos para sacrificarlos. Agregue PBS a la placa de Petri para lavar el etanol después de que todos los mosquitos sean sacrificados.
   NOTA: Antes de agregar PBS, asegúrese de que todos los mosquitos estén muertos.
4. Monte un portaobjetos de vidrio en el microscopio de disección y pipetee 100 μL de PBS en el centro. Transfiera cuidadosamente un mosquito usando forrceps al PBS y deje el resto de los mosquitos en la placa de Petri sobre hielo.
5. Usando forrceps de punta fina, sostenga el tercer segmento del abdomen desde el extremo posterior del mosquito y con segundos forrórceps sostenga la unión entre el tórax y el abdomen. Tire suavemente del abdomen hasta que el intestino medio esté completamente expuesto.
6. Deseche el resto del tejido del mosquito y transfiera el intestino medio a un portaobjetos limpio que contenga unas gotas de PBS.
7. Cuando se haya diseccionado el número deseado de mosquitos, retire cuidadosamente el PBS con una pipeta y manche el intestino medio con 0.2% de mercurocromo durante 2-5 min.
8. Elimine el exceso de mercurocromo y alinee los intestinos medios en la diapositiva para que puedan visualizarse fácilmente bajo el microscopio de luz.
9. Coloque un resbalón de cobertura y cuente los ooquistes en cada intestino medio bajo el objetivo 10x. Los ooquistes se tiñen de rosa y son de forma circular(Figura 6C).

6. Disección de las glándulas salivales de mosquitos y cuantificación de la carga de esporozoitos

NOTA: Un esquema de disección de las glándulas salivales se muestra en la Figura 4.

1. 14-18 días después de la alimentación con sangre, coloque las tazas de mosquitos a 4 ° C durante 10 min.
   NOTA: Es importante esperar hasta que los mosquitos dejen de moverse.
2. Mientras espera que los mosquitos dejen de moverse, prepare herramientas para la disección.
3. Coloque una placa de vidrio en una etapa de microscopio de disección. Prepare 2 juegos de agujas de 25 G en jeringas de 1 ml y una pipeta Pasteur de 9"y una bombilla de goma. Coloque el 70% de EtOH y el medio de disección (HBSS, L-15 o PBS) en una placa de 6 pozos.
4. En la cámara frigorífica, transfiera los mosquitos anestesiados en una placa de 6 pozos que contenga 70% de EtOH. Mueva suavemente los mosquitos con forzapas para asegurarse de que todos los mosquitos estén empapados, luego transfiera los mosquitos al medio de disección usando forzapas para lavar el 70% de EtOH.
5. Muévase a la sala de disección y coloque a los mosquitos en una etapa de microscopio de disección.
6. Retire el exceso de medio de los mosquitos, agregue un nuevo medio según sea necesario durante la disección. Evite que los mosquitos se sequen, pero demasiado líquido hace que la disección sea más difícil.
7. Usando 2 jeringas con agujas de 25 G, sostenga el tórax y la cabeza del mosquito, y tire suavemente de la cabeza hacia arriba para extraer las glándulas salivales del tórax.
8. Desconecte las glándulas salivales de la cabeza y el tórax con una aguja.
9. Coloque temporalmente las glándulas salivales en una gota separada de medio en la placa de vidrio.
10. Después de diseccionar 15-20 glándulas salivales, recójalas en un tubo de baja retención utilizando la pipeta Pasteur.
    NOTA: Una vez que las glándulas salivales entran en la parte ancha de la pipeta Pasteur, se pegarán al vaso y es difícil sacarlas.
11. Glándulas salivales de pellets por espín de pulso corto en una centrífuga de mesa. Retire el medio de disección sin interrumpir el gránulo y agregue 100 μL de nuevo medio de disección.
12. Moler las glándulas salivales con un pequeño homogeneizador durante 1 min para obtener esporozoítos.
13. Coloque 10 μL de medio de disección que contenga esporozoítos en un hemocitómetro.
    NOTA: Dependiendo del número de glándulas salivales, es posible que sea necesario diluir la solución de esporozoito a 1:10 a 1:50 con medio antes de contar.
14. Cuente el número de esporozoítos en dos de los cuatro cuadrantes y calcule el número de esporozoítos/mosquitos:

Resultados

Aquí presentamos los resultados de una serie de alimentaciones de membrana utilizando cultivos de gametocitos de P. falciparum NF54 generados utilizando el protocolo anterior (ver (Figura 5). El cultivo de gametocitos se inició con aproximadamente un 0,5% de cultivo asexual de etapa mixta en el Día 0, que creció a un pico de parasitemia de aproximadamente el 15% en el Día 4 y el Día 5. Como se muestra en la Figura 5A en esta alta parasitemia, los ...

Discusión

Los métodos descritos aquí se han utilizado con éxito en el Instituto de Investigación de la Malaria Johns Hopkins durante más de^{10 años 15,16,17,18,19,20,21,22.} Los gametocitos producidos mediante este protocolo se han utilizado para ensayos gametoci...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Sugar solution
10ml serological pipet	Falcon	357551
15 ml conical tube	Falcon	352096
1ml serological pipet	Falcon	357521
25 ml serological pipet	Falcon	357535
37°C Incubator
50 ml conical tube	Falcon	352070
5ml serological pipet	Falcon	357543
6 well tissue culture plates	Falcon	353046
70% Ethanol
9" glass pipet	Fisherbrand	13-678-6B
Anopheles Mosquitoes	JHMRI, Insectary core		We use A. stephensi or A. gambiae (keele)
cell counter
Circulating water bath
fine tip forceps	Fisherbrand	12-000-122
Geimsa stain	Sigma	GS1L
Glass desiccator
Glass membrane feeder	Chemglass Life Sciences	CG183570
Glass slides	Fisherbrand	12-552-3
HBSS	Sigma	H6648
Human Blood O+	JHU		Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit
Human Serum O+	Interstate blood bank		Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C.
Hypoxanthine	Sigma	H9337	Make 500x stock in 1M NaOH
Mercurochrome	Sigma	M7011	Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed
Micro Pipette
Microscope	Olympus		Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work.
Mosquito cups	Neptune cups
N-acetylglucosamine	Sigma	A3286	Optional and needed only when pure gametocytes are required.
Netting			Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding
Parafilm
PBS
Petri dish	Thermo Scientific	249964
Pipet tips
Pipetman
Plasmodium falciparum NF54	BEI Resources	MRA-1000	Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply
RPMI 1640	Corning	CV-041-CV	Media contains glutamine and HEPES
Slide warmer
Sodium bicarbonate	Sigma	S6297	Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation
water bath
Xanthurenic Acid	Sigma	D120804	For flagellation media