A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
חקירות מפורטות על שלבי יתושים של טפילי מלריה הם קריטיים לתכנון אסטרטגיות חסימת שידור יעילות. פרוטוקול זה מדגים כיצד לתרבות ביעילות gametocytes זיהומיות ולאחר מכן להאכיל את המשחקים האלה יתושים כדי ליצור שלבי יתושים של P. falciparum.
מלריה נותרה אחת הבעיות החשובות ביותר לבריאות הציבור, הגורמת לתחלואה ותמותה משמעותיות. מלריה היא מחלה המועברת על ידי יתושים המועברת באמצעות עקיצה מדבקת מיתוש אנופלס הנקבה. בקרת מלריה בסופו של דבר תיסתמך על מספר רב של גישות, הכוללות דרכים לחסום את ההעברה אל יתושים, דרך וממנה. כדי לחקור את שלבי היתושים של טפילי מלריה במעבדה, מיטבנו פרוטוקול לתרבות פלסמודיום פאלציפרום גמטוציטים מדבקים מאוד, שלב טפיל הנדרש להעברת הפונדקאי האנושי לווקטור היתושים. P. falciparum gametocytes בוגרים באמצעות חמישה שלבים שונים מבחינה מורפולוגית, אשר לוקח בערך 1-2 שבועות. תרבות Gametocyte המתוארת בפרוטוקול זה הושלמה ב 15 ימים והם זיהומיות יתושים מימים 15-18. פרוטוקולים אלה פותחו כדי לשמור על מחזור מתמשך של gametocytes מוסמך זיהום ולשמור על אספקה רציפה של שלבי יתושים של הטפיל. כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה של תרבות gametocyte וכיצד להדביק יתושים עם טפילים אלה באמצעות מזינים קרום זכוכית.
מלריה נגרמת על ידי טפילים פלסמודיום והוא מועבר המארחים החולייתיים שלהם באמצעות נשיכה זיהומית של יתושים אנופלס נקבה. על פי דו"ח ארגון הבריאות העולמי לשנת 2019( WHO), היו כ -405,000 מקרי מוות, מתוך סך של 228 מיליון מקרים של מלריה1. רוב מקרי המוות הקשורים למלריה התרכזו באזור אפריקה, במיוחד בקרב ילדים מתחת לגיל חמש. בעוד ששיעור השכיחות הכולל של מלריה ירד ברחבי העולם משנת 2010, בשנים האחרונות חלה ירידה ואסטרטגיות בקרה נוספות נחוצות בדחיפות כדי לחסל את המחלה.
שלבי דם א-מיניים מחזוריים של טפילים מלריה גורמים לפתוגנזה של מחלות ותת-קבוצה קטנה של אלה מתבדלים לגמטוציטים נשיים וזכריים. פלסמודיום פאלציפרום gametocytes הם ייחודיים בטבע כפי שהם לוקחים 7-10 ימים לפתח דרך חמישה שלבים שונים מבחינה מורפולוגית. גמטוציטים לא בוגרים משלב I ועד IV מופרדים בפרנצ'ימה של מח עצם ונשארים ברובם נעדרים מהמחזור ההיקפי2,3,4,5. אריתרוציטים נגועים ב gametocytes שלב בוגרים משתחררים במחזור הדם ומסתובבים בחופשיות כדי להילקח על ידי יתושים. ברגע שבתוך היתושים, הגמטוציטים מופעלים, באמצעות שינוי בטמפרטורה ובחשיפה לסביבת midgut, הופכים לגמטים נקביים וזכרים ומתחילים בפיתוח שלבי היתושים, אשר מגיע לשיאו עם השלבים ההדבקים של ספורוזויטים בבלוטות הרוק של היתושים6,7.
מאז טרייגרוג'נסון 8 תיאר שיטה סטנדרטית לתרבות P. falciparum, מחקרים על שלבי הדם הא-מיניים התקדמו מאוד. עם זאת, היעדר מערכת תרבות אמינה לשלבים מיניים הקשה על לימוד משחקי P. falciparum, ביולוגיה של שידור ושלבי יתושים. בשנים האחרונות פורסמו מספר שיטות אשר סייעו למעבדות בהקמת תרבויות gametocyte9,10,11,12. כתב יד זה מתאר פרוטוקול סטנדרטי ואמין לתרבות P. falciparum gametocytes שיכולים לייצג משאב בעל ערך לקהילת המחקר במלריה. שיטה זו מאפשרת ייצור חזק של gametocytes בוגר ומדבק אשר יחד עם פרוטוקול האכלת יתושים סטנדרטי, תוצאות זיהום יתושים אמין מאוד. שיטות אלה הוקמו כדי לשמור על אספקה רציפה של gametocytes, וטפילים בשלב יתושים. בכתב יד זה, אנו מתארים פרוטוקול תרבות gametocyte יסודי (איור 1),הכנת מאכילי קרום זכוכית וזיהום של יתושים באמצעות מאכילי ממברנות אלה (איור 2),ניתוח של midgut (איור 3) ובלוטת הרוק של יתושים (איור 4), וכימות זיהום יתושים לאחר אמצע וניתוח בלוטת הבריח.
אוספי הדם המתוארים להלן אושרו על ידי ועדת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס. P. falciparum הוא תרביתות RBCs טרי בתנאים סטריליים במתקן ברמה בטיחות ביולוגית 2 (BSL2) וזהירות משמשת לטיפול בחומרים ביולוגיים. לאחר כל שלב הכולל דם או מוצרי דם, כל כלי פלסטיק או כלי זכוכית נשטפים עם 10% אקונומיקה בתוך מכסה המנוע לפני סילוק נאות.
1. ריאגנטים והכנה
2. תרבות במה א-מינית P. falciparum
3. תרבות הגמטוציטים P. falciparum
הערה: תרבויות Gametocyte לקחת שבועיים כדי לייצר gametocytes בוגר מדבק יתושים. השלבים של תרבות הגמטוציטים מפורטים באיור 1. P. falciparum מבודד בדרך כלל לאבד את היכולת לייצר gametocyte לאחר לטווח ארוך בתרבות במבחנה13. כדי להבטיח את איכות הגמטוציטים, יש ליזום את התרבות מתרבות מאכיל המעבר הנמוכה, לא יותר מחודשיים מאז ההפשרה. מדיה חמה מראש ל 37 °C (50 °F) ולבצע את כל ההליכים על מחמם שקופיות להגדיר ב 38 °C (50 °F). ודא שתרביות gametocyte אינן מחוץ לאינקובטור לתקופה ממושכת כדי למזער את תנודות הטמפרטורה.
4. זיהום יתושים באמצעות בדיקת האכלה סטנדרטית של ממברנה (SMFA)
הערה: Gametocytes גדל במבחנה ניתן להאכיל יתושים באמצעות מאכילי קרום זכוכית. הגדרת מנגנון האכלת הדם מוצגת באיור 2. כפי שתואר לעיל, תמיד לשמור gametocytes ב 37 °C (50 °F) כדי למנוע הפעלה לפני שהם נבלעים על ידי יתושים. כלי פלסטיק לפני המלחמה, ריאגנטים וציוד משמשים עם תרבות gametocyte עד 37 °C (50 °F).
5. ניתוח יתושים באמצע המעי וכימות עומס הביצה
הערה: תרשים של ניתוח אמצע-קטגוריה מוצג באיור 3.
6. ניתוח בלוטת הרוק של יתושים וכימות עומס ספורוזויט
הערה: תרשים של ניתוח בלוטת הרוק מוצג באיור 4.
כאן אנו מציגים תוצאות מסדרה של הזנות ממברנה באמצעות תרבויות P. falciparum NF54 gametocyte שנוצרו באמצעות הפרוטוקול לעיל (ראה איור5). תרבות הגמטוציטים החלה עם כ-0.5% תרבות א-מינית מעורבת ביום 0, שגדלה לשיא של כ-15% ביום 4 וביום החמישי. כפי שניתן לראות באיור 5A בטפילים הגבוה?...
שיטות המתוארות כאן שימשו בהצלחה במכון לחקר המלריה של ג'ונס הופקינס במשך יותר מ -10 שנים15,16,17,18,19,20,21,22. Gametocytes המיוצר באמצעות פרוטוקול זה שימשו עב...
למחברים אין מה לחשוף.
המחברים מודים לפילנתרופיה של בלומברג על התמיכה הכספית במכון ג'ונס הופקינס לחקר המלריה (JHMRI). עבודה זו לא הייתה מתאפשרת ללא המומחיות שמספקים מתקני הליבה של חרקים ופרזיטולוגיה של JHMRI.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10% Sugar solution | |||
10ml serological pipet | Falcon | 357551 | |
15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
1ml serological pipet | Falcon | 357521 | |
25 ml serological pipet | Falcon | 357535 | |
37°C Incubator | |||
50 ml conical tube | Falcon | 352070 | |
5ml serological pipet | Falcon | 357543 | |
6 well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
70% Ethanol | |||
9" glass pipet | Fisherbrand | 13-678-6B | |
Anopheles Mosquitoes | JHMRI, Insectary core | We use A. stephensi or A. gambiae (keele) | |
cell counter | |||
Circulating water bath | |||
fine tip forceps | Fisherbrand | 12-000-122 | |
Geimsa stain | Sigma | GS1L | |
Glass desiccator | |||
Glass membrane feeder | Chemglass Life Sciences | CG183570 | |
Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
HBSS | Sigma | H6648 | |
Human Blood O+ | JHU | Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit | |
Human Serum O+ | Interstate blood bank | Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C. | |
Hypoxanthine | Sigma | H9337 | Make 500x stock in 1M NaOH |
Mercurochrome | Sigma | M7011 | Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed |
Micro Pipette | |||
Microscope | Olympus | Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work. | |
Mosquito cups | Neptune cups | ||
N-acetylglucosamine | Sigma | A3286 | Optional and needed only when pure gametocytes are required. |
Netting | Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding | ||
Parafilm | |||
PBS | |||
Petri dish | Thermo Scientific | 249964 | |
Pipet tips | |||
Pipetman | |||
Plasmodium falciparum NF54 | BEI Resources | MRA-1000 | Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply |
RPMI 1640 | Corning | CV-041-CV | Media contains glutamine and HEPES |
Slide warmer | |||
Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation |
water bath | |||
Xanthurenic Acid | Sigma | D120804 | For flagellation media |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved