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Method Article
对疟疾寄生虫的蚊子阶段进行详细调查对于设计有效的传播阻断策略至关重要。该协议展示了如何有效地培养传染性配子体,然后将这些配子体喂给蚊子以产生 恶性疟原虫的蚊子阶段。
疟疾仍然是最重要的公共卫生问题之一,导致严重的发病率和死亡率。疟疾是一种蚊子传播的疾病,通过雌性 按蚊 的传染性叮咬传播。疟疾控制最终将取决于多种方法,其中包括阻断与蚊子之间、通过蚊子传播和传播的方法。为了在实验室中研究疟疾寄生虫的蚊子阶段,我们优化了培养高传染性 恶性疟原 虫配子体的方案,这是从人类宿主传播到蚊子媒介所需的寄生虫阶段。 恶性疟原虫 配子体通过五个形态学上不同的步骤成熟,大约需要1-2周。该协议中描述的配子细胞培养在15天内完成,并且从第15-18天对蚊子具有传染性。这些方案的制定是为了维持感染合格配子体的连续循环,并维持寄生虫蚊子阶段的不间断供应。在这里,我们描述了配子体培养的方法,以及如何使用玻璃膜喂食器用这些寄生虫感染蚊子。
疟疾是由 疟原虫 寄生虫引起的,并通过雌性 按 蚊的传染性叮咬传播给脊椎动物宿主。根据2019年世界卫生组织(WHO)的报告,估计有405,000人死亡,而疟疾病例总数为2.28亿例1。大多数与疟疾有关的死亡集中在非洲区域,特别是五岁以下儿童。虽然全球疟疾的总体发病率从2010年开始下降,但近年来下降已趋于平稳,迫切需要采取额外的控制战略来消除这种疾病。
疟疾寄生虫的循环无性血液阶段引起疾病发病机制,其中一小部分分化为雌性和雄性配子体。恶性疟原虫配子体本质上是独一无二的,因为它们需要7-10天才能通过五个形态学上不同的阶段发育。从I期到IV期的未成熟配子体被隔离在骨髓实质中,并且在外周循环中基本上不存在2,3,4,5。感染成熟V期配子体的红细胞在血液中释放并自由循环,被蚊子吸收。一旦进入蚊子中肠,配子体就会被激活,通过温度的变化和暴露于中肠环境,转变为雌性和雄性配子并开始蚊子阶段的发展,其最终达到蚊子唾液腺中孢子体的感染阶段6,7。
由于Trager和Jenson8描述了一种培养恶性疟原虫的标准化方法,对无性血阶段的研究有了很大的进展。然而,由于缺乏可靠的性阶段培养系统,使得研究恶性疟原虫配子体,传播生物学和蚊子阶段变得困难。近年来,已经发表了几种方法,这些方法帮助实验室建立了配子体培养物9,10,11,12。本手稿描述了标准化和可靠的恶性疟原虫配子体培养方案,该协议可以代表疟疾研究界的宝贵资源。这种方法能够稳健地产生成熟和传染性的配子体,再加上标准化的蚊子喂养方案,导致高度可靠的蚊子传染性。建立这些方法是为了维持配子体和蚊子期寄生虫的不间断供应。在这份手稿中,我们描述了一个彻底的配子体培养方案(图1),使用这些膜饲养器制备玻璃膜饲养器和蚊子感染(图2),解剖中肠(图3)和蚊子的唾液腺(图4),以及中肠和唾液腺解剖后蚊子感染的定量。
下面描述的血液收集已获得约翰霍普金斯大学机构审查委员会的批准。 恶性疟原虫 在生物安全2级(BSL2)设施的无菌条件下在新鲜红细胞中培养,并谨慎处理生物材料。在涉及血液或血液制品的每个步骤之后,每个塑料器皿或玻璃器皿在正确处理之前,都要在罩内用10%的漂白剂冲洗。
1. 试剂和制备
2. 恶性疟原虫无性期培养
3. 恶性疟原虫配子细胞培养
注意:配子体培养物需要两周时间才能产生对蚊子具有传染性的成熟配子体。配子体培养的步骤如图 1所示。 恶性疟原虫 分离株在长期体外培养后通常失去产生配子体的能力13。为确保配子体的质量,培养应从低通道饲养层培养物开始,自解冻后不超过2个月。将培养基预热至37°C,并在设置为38°C的玻片加热器上执行所有程序。 确保配子体培养物不会长时间离开培养箱,以尽量减少温度波动。
4. 使用标准膜喂养测定法(SMFA)的蚊子感染
注意:体外生长的配子体可以使用玻璃膜喂食器喂给蚊子。采血装置的设置 如图2所示。如上所述,始终将配子体保持在37°C,以避免在蚊子摄入之前激活。预热塑料器皿,试剂和设备与配子体培养物一起使用至37°C。
5. 蚊子中肠道解剖和卵囊负荷定量
注:中肠解剖示意图 如图3所示。
6. 蚊唾液腺解剖和孢子体负荷定量
注:唾液腺解剖示意图如图 4所示。
在这里,我们展示了使用使用上述方案生成的 恶性疟原虫 NF54配子体培养物的一系列膜进料的结果(见(图5)。配子体培养在第0天以约0.5%的混合期无性培养开始,到第4天和第5天生长至约15%的寄生虫血症高峰。如图 5A 所示,在这种高度寄生虫血症下,寄生虫受到压力,无性阶段培养崩溃。然而,这种压力同时导致配子细胞生成的诱导。早期配?...
这里描述的方法已在约翰霍普金斯疟疾研究所成功使用超过10年15、16、17、18、19、20、21、22。使用该协议产生的配子体已被用于高通量配子细胞杀灭测定22,蛋白质组学
作者无需透露任何信息。
作者感谢彭博慈善基金会对约翰霍普金斯疟疾研究所(JHMRI)的财政支持。如果没有JHMRI昆虫和寄生虫学核心设施提供的专业知识,这项工作是不可能的。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10% Sugar solution | |||
10ml serological pipet | Falcon | 357551 | |
15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
1ml serological pipet | Falcon | 357521 | |
25 ml serological pipet | Falcon | 357535 | |
37°C Incubator | |||
50 ml conical tube | Falcon | 352070 | |
5ml serological pipet | Falcon | 357543 | |
6 well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
70% Ethanol | |||
9" glass pipet | Fisherbrand | 13-678-6B | |
Anopheles Mosquitoes | JHMRI, Insectary core | We use A. stephensi or A. gambiae (keele) | |
cell counter | |||
Circulating water bath | |||
fine tip forceps | Fisherbrand | 12-000-122 | |
Geimsa stain | Sigma | GS1L | |
Glass desiccator | |||
Glass membrane feeder | Chemglass Life Sciences | CG183570 | |
Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
HBSS | Sigma | H6648 | |
Human Blood O+ | JHU | Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit | |
Human Serum O+ | Interstate blood bank | Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C. | |
Hypoxanthine | Sigma | H9337 | Make 500x stock in 1M NaOH |
Mercurochrome | Sigma | M7011 | Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed |
Micro Pipette | |||
Microscope | Olympus | Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work. | |
Mosquito cups | Neptune cups | ||
N-acetylglucosamine | Sigma | A3286 | Optional and needed only when pure gametocytes are required. |
Netting | Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding | ||
Parafilm | |||
PBS | |||
Petri dish | Thermo Scientific | 249964 | |
Pipet tips | |||
Pipetman | |||
Plasmodium falciparum NF54 | BEI Resources | MRA-1000 | Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply |
RPMI 1640 | Corning | CV-041-CV | Media contains glutamine and HEPES |
Slide warmer | |||
Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation |
water bath | |||
Xanthurenic Acid | Sigma | D120804 | For flagellation media |
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