Plasmodium falciparum Gametozytenkultur und Mückeninfektion durch künstliche Membranfütterung

Zusammenfassung

Detaillierte Untersuchungen an Mückenstadien von Malariaparasiten sind entscheidend, um wirksame Strategien zur Blockierung der Übertragung zu entwickeln. Dieses Protokoll zeigt, wie man infektiöse Gametozyten effektiv kultiviert und diese Gametozyten dann an Moskitos verfüttert, um Mückenstadien von P. falciparumzu erzeugen.

Zusammenfassung

Malaria ist nach wie vor eines der wichtigsten Probleme der öffentlichen Gesundheit und verursacht eine erhebliche Morbidität und Mortalität. Malaria ist eine durch Mücken übertragene Krankheit, die durch einen infektiösen Stich von der weiblichen Anopheles-Mücke übertragen wird. Die Malariabekämpfung wird sich schließlich auf eine Vielzahl von Ansätzen stützen, darunter Möglichkeiten, die Übertragung zu, durch und von Moskitos zu blockieren. Um Mückenstadien von Malariaparasiten im Labor zu untersuchen, haben wir ein Protokoll zur Kultivierung hochinfektiöser Plasmodium falciparum-Gametozyten optimiert, einem Parasitenstadium, das für die Übertragung vom menschlichen Wirt auf den Mückenvektor erforderlich ist. P. falciparum Gametozyten reifen durch fünf morphologisch unterschiedliche Schritte, was etwa 1-2 Wochen dauert. Die in diesem Protokoll beschriebene Gametozytenkultur wird in 15 Tagen abgeschlossen und ist ab den Tagen 15-18 für Moskitos infektiös. Diese Protokolle wurden entwickelt, um einen kontinuierlichen Zyklus von infektionskompetenten Gametozyten aufrechtzuerhalten und eine ununterbrochene Versorgung mit Mückenstadien des Parasiten aufrechtzuerhalten. Hier beschreiben wir die Methodik der Gametozytenkultur und wie man Moskitos mit diesen Parasiten mit Glasmembran-Feedern infiziert.

Einleitung

Malaria wird durch Plasmodium-Parasiten verursacht und durch infektiösen Stich weiblicher Anopheles-Mücken auf ihre Wirbeltierwirte übertragen. Laut dem Bericht der Weltgesundheitsorganisation (WHO) von 2019 gab es schätzungsweise 405.000 Todesfälle von insgesamt 228 Millionen Malariafällen^1. Die meisten Todesfälle im Zusammenhang mit Malaria konzentrierten sich auf die afrikanische Region, insbesondere auf Kinder unter fünf Jahren. Während die Gesamtinzidenzrate von Malaria seit 2010 weltweit zurückgegangen ist, hat sich der Rückgang in den letzten Jahren stabilisiert und zusätzliche Bekämpfungsstrategien sind dringend erforderlich, um die Krankheit zu eliminieren.

Zyklische asexuelle Blutstadien von Malariaparasiten verursachen Krankheitspathogenese und eine kleine Untergruppe davon differenziert sich in weibliche und männliche Gametozyten. Plasmodium falciparum Gametozyten sind einzigartig in der Natur, da sie 7-10 Tage brauchen, um sich durch fünf morphologisch unterschiedliche Stadien zu entwickeln. Unreife Gametozyten vom Stadium I bis IV werden im Knochenmarkparenchym sequestriert und bleiben im peripheren Kreislauf weitgehend abwesend^2,3,4,5. Erythrozyten, die mit Gametozyten im reifen Stadium V infiziert sind, werden im Blutkreislauf freigesetzt und zirkulieren frei, um von Moskitos aufgenommen zu werden. Sobald sie sich im Mückenmitteldarm befinden, werden Gametozyten durch eine Temperaturänderung und Exposition gegenüber der Mitteldarmumgebung aktiviert, verwandeln sich in weibliche und männliche Gameten und beginnen mit der Entwicklung der Mückenstadien, die mit den infektiösen Stadien der Sporozoiten in den Mückenspeicheldrüsen^6,7gipfelt .

Da Trager und Jenson⁸ eine standardisierte Methode zur Kultivierung von P. falciparumbeschrieben haben, sind Studien zu den asexuellen Blutstadien stark fortgeschritten. Das Fehlen eines zuverlässigen Kultursystems für sexuelle Stadien hat es jedoch schwierig gemacht, P. falciparum Gametozyten, Übertragungsbiologie und Mückenstadien zu untersuchen. In den letzten Jahren wurden mehrere Methoden veröffentlicht, die Laboratorien bei der Etablierung von Gametozytenkulturen geholfen haben^9,10,11,12. Dieses Manuskript beschreibt ein standardisiertes und zuverlässiges Protokoll zur Kultivierung von P. falciparum-Gametozyten, das eine wertvolle Ressource für die Malaria-Forschungsgemeinschaft darstellen kann. Diese Methode ermöglicht die robuste Produktion von reifen und infektiösen Gametozyten, was zusammen mit einem standardisierten Mückenfütterungsprotokoll zu einer hochzuverlässigen Mückeninfektiosität führt. Diese Methoden wurden etabliert, um eine ununterbrochene Versorgung mit Gametozyten und Parasiten im Mückenstadium aufrechtzuerhalten. In diesem Manuskript beschreiben wir ein gründliches Gametozytenkulturprotokoll (Abbildung 1), die Vorbereitung von Glasmembranfütterern und die Infektion von Moskitos mit diesen Membranfressern (Abbildung 2), die Dissektion des Mitteldarms (Abbildung 3) und der Speicheldrüse von Moskitos (Abbildung 4) und die Quantifizierung der Infektion bei Mücken nach Mitteldarm- und Speicheldrüsendissektion.

Protokoll

Die unten beschriebenen Blutentnahmen wurden vom Institutional Review Board der Johns Hopkins University genehmigt. P. falciparum wird in frischen Erythrozyten unter sterilen Bedingungen in einer Anlage der Biosicherheitsstufe 2 (BSL2) kultiviert, und beim Umgang mit biologischen Materialien wird Vorsicht walten gelassen. Nach jedem Schritt mit Blut oder Blutprodukten wird jedes Plastik- oder Glasgeschirr vor der ordnungsgemäßen Entsorgung mit 10% Bleichmittel in der Haube gespült.

1. Reagenzien und Zubereitung

1. Es wurde das Parasitenisolat P. falciparum NF54 (siehe Materialtabelle)verwendet, das in der kontinuierlichen Kultur bis zu zwei Monate lang infektiöse Gametozyten produzieren kann.
   HINWEIS: Nicht alle kulturangepassten Parasitenlinien produzieren Gametozyten, und NF54-Isolate mit geringer Passage sind am konsistentesten.
2. O⁺ Erythrozyten: Verdünnen Sie Vollblut durch Zugabe des gleichen Volumens von RPMI 1640-Medien und zentrifugieren Sie es bei 500 x g für 5 min bei Raumtemperatur in einem ausschwenkbaren Rotor mit Derentschleunigung auf 0 eingestellt. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und das Buffy-Fell (ein weißes Band zwischen Plasma und gepackten Erythrozyten, das die meisten weißen Blutkörperchen und Blutplättchen enthält) und fügen Sie das gleiche Volumen an RPMI hinzu. Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal und fügen Sie nach der letzten Wäsche ein Pelletvolumen RPMI hinzu, um 50% Hämatokrit für die Lagerung bei 4 ° C zu erhalten.
   HINWEIS: Gametozyten reifen über einen Zeitraum von zwei Wochen, was es wichtig macht, Kulturen mit frischen Erythrozyten zu beginnen, typischerweise Erythrozyten, die innerhalb einer Woche gezogen werden, funktioniert gut.
3. O⁺ Human Serum: Poolen Sie mindestens 6 Serumeinheiten zusammen, um die Wirkung normaler Variationen im Serum von verschiedenen Personen zu minimieren. Sterilisieren Sie gepooltes humanes Serum mit 0,2 μm Filtrationskolben. Aliquot in Portionen von 50 ml oder weniger je nach Bedarf und bei -20 °C lagern.
   HINWEIS: Erythrozyten und Serum müssen aus einer kompatiblen Blutgruppe für P. falciparum-Kulturen stammen.
4. 500x Hypoxanthin (100 ml) Lösung: 0,5 g Hypoxanthin in 100 ml 1 M NaOH auflösen. Filter sterilisieren und 5-10 ml Aliquots für die Lagerung herstellen. Bestände können bis zu einem Jahr bei -20 °C und bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
5. Natriumbicarbonat (optional): 7,5 g Natriumbicarbonat in 100 ml entionisiertem Wasser in Gewebekulturqualität auflösen und mit einem 0,2 μm-Filter filtern.
   HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet die Kerzenglasmethode, um mikroaerophile Bedingungen für die In-vitro-Kultur von P. falciparum bereitzustellen, und benötigt kein Natriumbicarbonat. Werden Parasiten jedoch mit einem Malariagasgemisch (5%_{O2, 5%CO2} und 90%_N2)kultiviert, ist es wichtig, Kulturmedien mit 0,2% Natriumbicarbonat zu ergänzen.
6. Komplettes Medium: Um 500 ml vollständiges Medium herzustellen, fügen Sie 1 ml Hypoxanthinlösung und 50 ml gepooltes humanes Serum zu 500 ml RPMI 1640 hinzu. Fügen Sie 15 ml 7,5% Natriumbicarbonat hinzu, wenn Sie ein Malaria-Gasgemisch verwenden. Lagern Sie die vollständigen Medien bei 4 °C und verwerfen Sie sie, wenn sich die Farbe der gesamten Medien von Orange zu Rosa ändert. Um Abfall zu vermeiden, stellen Sie innerhalb von drei Tagen genügend vollständige Medien her, die verwendet werden können.
7. Exflagelierungsmedien (optional): Herstellung von Exflagellations- oder Ookinetmedien durch Lösen von 200 mg NaHCO₃, 5 mg Hypoxanthin und 100 μL Xanthurensäure (ab 100 mM Vorrat in Wasser) auf 100 ml unvollständiger Medien (RPMI 1640 mit Glutamin und HEPES).
   HINWEIS: Exflagellation ist der Prozess der männlichen Gametenbildung im Mitteldarm der weiblichen Anopheles-Mücke wenige Minuten nach der Einnahme von Blutmahlzeiten, die mit Gametozyten infiziert sind. Männliche Gametozyten von Plasmodium führen nach einem Exflagellationsereignis zu 8 männlichen Gameten. In vitro tritt dieser Prozess spontan auf, wenn die Kulturtemperatur auf Raumtemperatur (RT) gesenkt wird und kann in kultivierten reifen Gametozyten beobachtet werden.
8. N-Acetylglucosamin (optional): 500 mM Stammlösung von N-Acetylglucosamin in Wasser oder unvollständigen Medien herstellen, aliquotieren und bei -20 °C lagern.
9. NaCl-Lösungen: Lösen Sie 0,9 g, 1,6 g und 12 g NaCl in 100 ml deionisiertem Gewebekulturwasser auf, um 0,9%, 1,6% und 12% NaCl-Lösungen herzustellen. Mit 0,22 μm Filter filtrieren und bei 4 °C lagern.

2. P. falciparum asexuelle Bühnenkultur

1. Um mit der Parasitenkultur zu beginnen, entfernen Sie eine gefrorene Durchstechflasche mit P. falciparum NF54 aus dem Flüssigstickstofftank und tauen Sie schnell im Wasserbad bei 37 °C auf.
2. Geben Sie den Inhalt (~ 1 ml) in ein 50 ml steriles Zentrifugenröhrchen und geben Sie tropfenweise 0,2 Volumen vorgewärmtes 12% NaCl hinzu, während Sie das Röhrchen vorsichtig schütteln, um ein gleichmäßiges Mischen zu gewährleisten. Inkubieren Sie für 5 min bei RT mit intermittierendem sanftem Schütteln.
3. Fügen Sie 9 Volumen von 1,6% NaCl tropfenweise hinzu, während Sie das sanfte Mischen fortsetzen. Zentrifugieren Sie den Inhalt bei 500 x g für 5 min bei RT, verwerfen Sie vorsichtig den Überstand. Fügen Sie 9 Volumina von 0,9% NaCl tropfenweise hinzu, während Sie sicherstellen, dass das Parasitenpellet konsistent gemischt wird. Zentrifugieren Sie erneut bei 500 x g für 5 min bei RT. Entfernen Sie den Überstand und resuspenieren Sie Parasiten in 5 mL vollständiges Medium.
4. Übertragen Sie den Inhalt in eine Vertiefung einer 6-Well-Gewebekulturplatte und fügen Sie 100-200 μL verpackte Erythrozyten hinzu.
5. Parasitenkultur bei 37 °C in einem Kerzenglas oder in einer modularen Inkubatorkammer mit speziellem Gasgemisch aus 5%_{O2, 5%CO2} und 90% N2_gespült.
6. Ersetzen Sie die Medien jeden Tag und überwachen Sie das Wachstum, indem Sie einen dünnen Blutausstrich machen, indem Sie ein paar Mikroliter aus der abgesetzten RBC-Schicht ziehen, nachdem der Kulturüberstand während des regelmäßigen Medienwechsels abgesaugt wurde.
7. Verwenden Sie eine sterile Pasteurpipette aus Glas, um zu zeichnen, und tippen Sie dann in die Mitte des Glasobjektträgers, um einen Tropfen Kultur auf den Objektträger zu übertragen. Legen Sie einen weiteren Glasschieber vor den Tropfen und ziehen Sie ihn zurück, um die Erythrozyten zu kontaktieren, und schieben Sie ihn schnell in einer Bewegung nach vorne, um einen dünnen Abstrich der RBC-Monoschicht zu machen.
8. Legen Sie den Schieber horizontal auf einen Wäscheständer und lassen Sie ihn an der Luft trocknen. Fixieren Sie den Blutausstrich, indem Sie absolutes Methanol auf den Abstrich fallen lassen. Lassen Sie den festen Abstrich vollständig trocknen und gießen Sie dann vorsichtig 10% Geimsa-Fleck frisch verdünnt in Wasser, bis der Blutausstrich vollständig bedeckt ist. Lassen Sie die Zellen ca. 15 Min färben.
9. Waschen Sie den überschüssigen Fleck ab, indem Sie den Objektträger unter sauberem Leitungswasser abspülen und die Objektträger in vertikaler Position trocknen lassen.
10. Bestimmen Sie Parasitemie, indem Sie einen dünnen Blutausstrich auf einem Mikroskop mit Ölimmersion 100x Objektiv betrachten. Zählen Sie die Anzahl der infizierten Erythrozyten unter insgesamt mindestens 500 Erythrozyten, um den Prozentsatz der Parasitemie zu bestimmen.

3. P. falciparum Gametozytenkultur

HINWEIS: Gametozytenkulturen benötigen zwei Wochen, um reife Gametozyten zu produzieren, die für Moskitos infektiös sind. Die Schritte der Gametozytenkultur sind in Abbildung 1 dargestellt. P. falciparum-Isolate verlieren in der Regel die Fähigkeit, Gametozyten zu produzieren, nach einer langfristigen In-vitro-Kultur¹³. Um die Qualität der Gametozyten zu gewährleisten, sollte die Kultur aus einer Feederkultur mit niedriger Passage begonnen werden, die seit dem Auftauen nicht älter als 2 Monate ist. Medien auf 37 °C vorwärmen und alle Eingriffe an einem auf 38 °C eingestellten Gleitwärmer durchführen. Stellen Sie sicher, dass Gametozytenkulturen nicht für längere Zeit aus dem Inkubator sind, um Temperaturschwankungen zu minimieren.

1. Säen Sie die Gametozytenkultur (Tag 0) mit gemischter asexueller Feederkultur bei 0,3-1% Parasitemie bei 4% Hämatokrit.
2. Um eine Sechs-Well-Gametozytenkultur aufzubauen, zentrifugieren Sie 5 ml Feederkultur bei 500 x g für 5 min bei RT. Entsorgen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Pellet in 30 ml vollständigem Medium.
3. 1,2 ml verpackte Erythrozyten hinzufügen, mischen und 5 ml in jede Vertiefung der 6-Well-Platte geben und in einem Kerzenglas bei 37 ° C inkubieren.
   HINWEIS: Die oben beschriebene Gametozytenkultur basiert auf einer gemischten asexuellen Feederkultur mit 5% Parasitemie.
4. Wechseln Sie die Medien täglich für 15-18 Tage, ohne zuzüglich frischem Blut, indem Sie vorsichtig etwa 70-80% Kulturüberstand absaugen, um die Entfernung von Blutzellen zu vermeiden.
5. Fügen Sie jedem Bohrloch 5 ml frisches komplettes Medium hinzu. Fügen Sie beim Medienwechsel langsam Medien mit einer serologischen Pipette an der Wand des Brunnens hinzu, um die abgesetzte RBC-Schicht nicht zu stören.
   HINWEIS: Da während des Medienwechsels 1-2 ml des Kulturmediums verbleiben, liegt das Gesamtkulturvolumen nach Tag 1 der Gametozytenkultur zwischen 6-7 ml. Bei der Anpassung dieses Protokolls ist es ratsam, jeden zweiten Tag Blutausstriche zu machen, um sicherzustellen, dass Parasiten gesund sind. Die Herstellung eines Blutausstrichs kann oft die Anzahl der Zellen in Kultur erschöpfen. Um dies zu vermeiden, zeichnen Sie ein sehr kleines Volumen.
6. Um die reife Gametozytämie zu quantifizieren, machen Sie den Blutabstrich zwischen den Tagen 15-18 und zählen Sie die Anzahl der reifen Gametozyten unter der Gesamtzahl der Zellen.
   HINWEIS: Reife Gametozyten können leicht mit ihrer klassischen Halbmondform mit glatten abgerundeten Enden identifiziert werden (Abbildung 5B).
7. Zählen Sie mindestens 1.000 Erythrozyten und berechnen Sie den Prozentsatz der Erythrozyten, die mit reifen Gametozyten infiziert sind.
8. Um Exflagellationsereignisse zu quantifizieren, nehmen Sie 200 μL Gametozytenkultur und zentrifugieren Sie bei 500 x g für 5 min bei RT in einem vorgewärmten Röhrchen. Resuspendieren Sie das Pellet in 20 μL Exflagellationsmedien und übertragen Sie es auf einen Glasobjektträger mit Abdeckschein.
9. Beginnen Sie nach 15-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur mit der Zählung der Exflagellationszentren im Phasenkontrastmodus mit dem 10-fachen Objektiv. Zählen Sie Exflagellationszentren in mindestens vier Feldern, um Exflagellationsereignisse zu berechnen.
   ANMERKUNG: Eine detaillierte Methodik des Exflagellationsassays wurde zuvor von Delves et al¹⁰beschrieben. Mehr als 20 Exflagellationsereignisse pro Feld gelten als geeignet für den Membranfütterungsassay.
10. Gametozytenkulturen haben typischerweise ein niedriges Maß an asexuellen Reststadien. Wenn das Experiment reine Gametozyten erfordert, behandeln Sie die Kultur mit 50 mM N-Acetylglucosamin.
11. Fügen Sie 0,5 ml N-Acetylglucosamin aus 10x Stammlösung pro Vertiefung (5 ml) für mindestens 3 Tage hinzu, während Sie die Medien wechseln, um die verbleibenden asexuellen Stadien zu klären.
    HINWEIS: N-Acetylglucosamin kann auch die Invasion sexuell begangener Merozoiten blockieren, die Behandlung sollte erst nach Tag 7 der Gametozytenkultur eingeleitet werden.

4. Mückeninfektion mit Standard-Membranfütterungsassay (SMFA)

HINWEIS: In vitro gezüchtete Gametozyten können mit Glasmembranfütterern an Moskitos verfüttert werden. Der Aufbau des Blutfütterungsapparates ist in Abbildung 2 dargestellt. Wie oben beschrieben, halten Sie die Gametozyten immer bei 37 °C, um eine Aktivierung zu vermeiden, bevor sie von Moskitos aufgenommen werden. Vorwärmung von Kunststoffwaren, Reagenzien und Geräten mit Gametozytenkultur auf 37 °C.

1. Verhungern Sie 3-7 Tage alte weibliche Anopheles-Moskitos, indem Sie ihr Zuckerwasser für 6,5 h oder über Nacht vor der Membranfütterung entfernen.
2. Übertragen Sie sie mit motorisierten oder mundbetriebenen Aspiratoren auf Pappbecher, die mit einer doppelten Schicht feinmaschigen Gewebes bedeckt sind. Alternativ können Sie Moskitos in einem kalten Raum oder Kühlschrank niederschlagen, um sie in die Pappbecher zu übertragen.
   HINWEIS: Ein Pint-Körbchen kann verwendet werden, um bis zu 100 Moskitos zu füttern.
3. Zentrifuge gewaschen Blut bei 500 x g für 5 min bei RT und entsorgt Überstand. Fügen Sie eine gleiche Menge frisch aufgetautes menschliches Serum hinzu, um das Vollblut zu rekonstituieren. Die Blut-Serum-Mischung für 30 min in das bei 37 °C eingestellte Wasserbad geben.
4. Die Gametozytenkultur in ein vorgewärmtes 15-ml-Kunststoffröhrchen geben und bei 600 x g für 5 min bei 37 °C zentrifugieren. Aspirieren Sie vorsichtig den Kulturüberstand und machen Sie einen dünnen Blutausstrich, um die reife Gametozytämie wie oben beschrieben zu bestimmen.
5. Um die endgültige Blutfütterung herzustellen, verdünnen Sie das Gametozytenpellet auf eine gewünschte Konzentration unter Verwendung von rekonstituiertem Vollblut. Halten Sie die Blutfütterung bei 37 ° C, bis Moskitos und Glasfütterer bereit sind.
   HINWEIS: Reife Gametozytenkonzentrationen zwischen 0,02 und 0,3% sorgen für eine konsistente Mückeninfektiosität. Es ist jedoch ratsam, die Gametozytämie zu optimieren, indem verschiedene Konzentrationen an verschiedene Becher von Moskitos verfüttert werden.
6. Stellen Sie sicher, dass die Glasmembrandosierer zwei Öffnungen haben, eine schmale obere Öffnung, um das infizierte Blut zu pipettieren, und eine untere Öffnung für die Membranbefestigung. Schneiden Sie einen Paraffinfilm in Quadrate, dehnen Sie ihn auf eine gleichmäßige Dicke und kleben Sie ihn an die Öffnung des Feeders, um ein versiegeltes Fach für die Blutzufuhr zu schaffen.
7. Befestigen Sie Membrandosierer an einem zirkulierenden Wasserbad, indem Sie auf jeder Seite Schläuche anschließen, um den Durchgang von warmem Wasser durch den Mantel um die Membranzuführungen zu ermöglichen.
   HINWEIS: Mehrere Glasdosierer können in Reihe geschaltet werden, um mehreren Fütterungsbedingungen gerecht zu werden.
8. Nachdem alle Feeder an das Wasserbad angeschlossen sind, schalten Sie es ein und untersuchen Sie es auf Lecks.
9. Platzieren Sie Feeder in der Mitte des Netzes auf Mückenbechern mit Membranseite nach unten und sichern Sie Feeder mit Klemmen oder Klebeband. Stellen Sie sicher, dass die Membrandosierer nicht zur Seite geneigt sind, um eine gleichmäßige Verteilung des Blutfutters und einen engen Kontakt des gesamten Futters mit dem Netz an den Bechern zu ermöglichen, damit Moskitos aus dem Inneren des Bechers gelangen können.
10. Etwa 200–1000 μL Blutzufuhr werden in Membrandosierer pipettiert.
    HINWEIS: Das Volumen des Blutfutters variiert je nach Anzahl der Moskitos und Größe des Membranfutters. Für 14 mm Glasfutter und 50 Mücken verwenden Sie 200 μL Blutfutter.
11. Stellen Sie sicher, dass das Laden ordnungsgemäß durchgeführt wurde und die Blutzufuhr auf die Paraffinfolie gelegt wurde.
12. Lassen Sie Moskitos etwa 30 Minuten lang mit intermittierender Überwachung füttern.
    HINWEIS: Blasen Sie Moskitos vorsichtig mit dem Mund, um CO₂ bereitzustellen, das eine verbesserte Bluternährung induziert.
13. Entfernen Sie nicht gefütterte Moskitos, indem Sie sie in einem kalten Raum niederschlagen. Untersuchen Sie Moskitos sichtbar auf Ausbuchtung und Rötung im Bauch als Zeichen für frische Blutmahlzeit. Alternativ können Sie einen mundbetriebenen Sauger verwenden, um ungefütterte Moskitos selektiv zu entfernen.
14. Entsorgen Sie nicht gefütterte Moskitos, nachdem Sie sie in 70% Ethanol eingeweicht haben, und legen Sie gefütterte Moskitos zurück in den Mückenbecher.
15. Doppelkäfig-Mückenbecher und übertragen Sie sie in einen Inkubator mit hohem Containment, der für Moskitos bestimmt ist, die mit dem menschlichen Malariaparasiten P. falciparuminfiziert sind.
16. Legen Sie Wattepads, die mit 10% Saccharose getränkt sind, auf die Moskitobecher, um sie mit Zuckermehl zu versorgen. Ersetzen Sie die Wattepads jeden zweiten Tag, bis die Moskitos seziert sind.

5. Mücken-Mitteldarmdissektion und Oozystenlastquantifizierung

HINWEIS: Ein Schema der Mitteldarmdissektion ist in Abbildung 3 dargestellt.

1. 7-8 Tage nach der Blutfütterung Mückenbecher für 10 min auf 4 ° C übertragen, um Moskitos niederzuschlagen.
2. Übertragen Sie Moskitos, die mit einer feinen Pinzette seziert werden sollen, in eine Petrischale auf Eis.
3. Weichen Sie Moskitos in 70% Ethanol für 1-2 min ein, um sie einzuschläfern. Fügen Sie PBS in die Petrischale hinzu, um das Ethanol abzuwaschen, nachdem alle Moskitos eingeschläfert wurden.
   HINWEIS: Stellen Sie vor dem Hinzufügen von PBS sicher, dass alle Moskitos tot sind.
4. Montieren Sie einen Glasobjektträger auf dem Seziermikroskop und pipettieren Sie 100 μL PBS in der Mitte. Übertragen Sie vorsichtig eine Mücke mit einer Pinzette in das PBS und lassen Sie den Rest der Mücken in der Petrischale auf Eis.
5. Halten Sie mit einer feinspitzigen Pinzette das dritte Segment des Abdomens vom hinteren Ende der Mücke und halten Sie mit der zweiten Pinzette die Verbindung zwischen Thorax und Abdomen. Ziehen Sie den Bauch vorsichtig, bis der Mitteldarm vollständig freigelegt ist.
6. Entsorgen Sie den Rest des Mückengewebes und übertragen Sie den Mitteldarm auf einen sauberen Objektträger, der ein paar Tropfen PBS enthält.
7. Wenn die gewünschte Anzahl von Moskitos seziert wurde, entfernen Sie das PBS vorsichtig mit einer Pipette und färben Sie den Mitteldarm mit 0,2% Mercurochrom für 2-5 min.
8. Entfernen Sie überschüssiges Mercurochrom und richten Sie die Mitteldärme auf dem Objektträger aus, damit sie leicht unter dem Lichtmikroskop sichtbar gemacht werden können.
9. Legen Sie einen Deckzettel und zählen Sie Oozysten auf jedem Mitteldarm unter 10x Objektiv. Oozysten färben sich rosa und sind kreisförmig(Abbildung 6C).

6. Mücken-Speicheldrüsen-Dissektion und Sporozoiten-Belastungsquantifizierung

ANMERKUNG: Ein Schema der Speicheldrüsendissektion ist in Abbildung 4 dargestellt.

1. 14-18 Tage nach der Blutfütterung die Mückenbecher für 10 minuten bei 4 ° C platzieren.
   HINWEIS: Es ist wichtig zu warten, bis sich die Moskitos nicht mehr bewegen.
2. Während Sie darauf warten, dass sich moskitos nicht mehr bewegen, bereiten Sie Werkzeuge für die Dissektion vor.
3. Legen Sie eine Glasplatte auf einen Dissektionsmikroskoptisch. Bereiten Sie 2 Sätze 25 G Nadeln auf 1 ml Spritzen und einer 9 " Pasteur Pipette und Gummibirne vor. Legen Sie 70% EtOH und Dissektionsmedium (HBSS, L-15 oder PBS) in eine 6-Well-Platte.
4. Im Kühlraum anästhesierte Moskitos in eine 6-Well-Platte mit 70% EtOH übertragen. Bewegen Sie Moskitos vorsichtig mit einer Pinzette, um sicherzustellen, dass alle Moskitos durchnässt sind, und übertragen Sie die Moskitos dann mit einer Pinzette auf das Seziermedium, um 70% EtOH abzuwaschen.
5. Gehen Sie in den Sezierraum und legen Sie Moskitos auf eine Seziermikroskopbühne.
6. Entfernen Sie überschüssiges Medium von Moskitos, fügen Sie während der Dissektion nach Bedarf neues Medium hinzu. Vermeiden Sie, dass Moskitos austrocknen, aber zu viel Flüssigkeit erschwert die Dissektion.
7. Halten Sie mit 2 Spritzen mit 25 G-Nadeln den Thorax und den Kopf der Mücke und ziehen Sie den Kopf vorsichtig nach oben, um die Speicheldrüsen aus dem Thorax zu ziehen.
8. Trennen Sie die Speicheldrüsen von Kopf und Thorax mit einer Nadel.
9. Legen Sie vorübergehend speicheldrüsen in einem separaten Mediumtröpfchen auf der Glasplatte.
10. Nachdem Sie 15-20 Speicheldrüsen seziert haben, sammeln Sie sie mit der Pasteurpipette in einem Schlauch mit niedrigem Rückhaltevermögen.
    HINWEIS: Sobald die Speicheldrüsen in den breiten Teil der Pasteurpipette gelangen, haften sie am Glas und es ist schwierig, sie herauszubekommen.
11. Pellet-Speicheldrüsen durch kurze Pulsdrehung in einer Tischzentrifuge. Entfernen Sie das Dissektionsmedium, ohne das Pellet zu stören, und fügen Sie 100 μL neues Dissektionsmedium hinzu.
12. Mahlen Sie Speicheldrüsen mit einem kleinen Homogenisator für 1 min, um Sporozoiten zu erhalten.
13. Legen Sie 10 μL Dissektionsmedium, das Sporozoiten enthält, auf ein Hämozytometer.
    HINWEIS: Abhängig von der Anzahl der Speicheldrüsen muss man die Sporozoitlösung vor dem Zählen möglicherweise mit Medium auf 1:10 bis 1:50 verdünnen.
14. Zählen Sie die Anzahl der Sporozoiten in zwei der vier Quadranten und berechnen Sie die Anzahl der Sporozoiten / Mücken:

Ergebnisse

Hier präsentieren wir Ergebnisse aus einer Reihe von Membranfuttermitteln unter Verwendung von P. falciparum NF54-Gametozytenkulturen, die mit dem obigen Protokoll erzeugt wurden (siehe Abbildung5). Die Gametozytenkultur wurde mit etwa 0,5% asexueller Kultur im Mischstadium an Tag 0 begonnen, die bis Tag 4 und Tag 5 zu einer maximalen Parasitemie von etwa 15% anwuchs. Wie in Abbildung 5A bei dieser hohen Parasitämie gezeigt, werden die Parasiten gestr...

Diskussion

Die hier beschriebenen Methoden werden am Johns Hopkins Malaria Research Institute seit mehr als 10 Jahren erfolgreich eingesetzt^{15,16,17,18,19,20,21,22}. Gametozyten, die unter Verwendung dieses Protokolls hergestellt wurden, wurden für Gametozytocidal-Ass...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Sugar solution
10ml serological pipet	Falcon	357551
15 ml conical tube	Falcon	352096
1ml serological pipet	Falcon	357521
25 ml serological pipet	Falcon	357535
37°C Incubator
50 ml conical tube	Falcon	352070
5ml serological pipet	Falcon	357543
6 well tissue culture plates	Falcon	353046
70% Ethanol
9" glass pipet	Fisherbrand	13-678-6B
Anopheles Mosquitoes	JHMRI, Insectary core		We use A. stephensi or A. gambiae (keele)
cell counter
Circulating water bath
fine tip forceps	Fisherbrand	12-000-122
Geimsa stain	Sigma	GS1L
Glass desiccator
Glass membrane feeder	Chemglass Life Sciences	CG183570
Glass slides	Fisherbrand	12-552-3
HBSS	Sigma	H6648
Human Blood O+	JHU		Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit
Human Serum O+	Interstate blood bank		Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C.
Hypoxanthine	Sigma	H9337	Make 500x stock in 1M NaOH
Mercurochrome	Sigma	M7011	Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed
Micro Pipette
Microscope	Olympus		Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work.
Mosquito cups	Neptune cups
N-acetylglucosamine	Sigma	A3286	Optional and needed only when pure gametocytes are required.
Netting			Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding
Parafilm
PBS
Petri dish	Thermo Scientific	249964
Pipet tips
Pipetman
Plasmodium falciparum NF54	BEI Resources	MRA-1000	Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply
RPMI 1640	Corning	CV-041-CV	Media contains glutamine and HEPES
Slide warmer
Sodium bicarbonate	Sigma	S6297	Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation
water bath
Xanthurenic Acid	Sigma	D120804	For flagellation media