التصوير فائق الدقة لدراسة التعريب المشترك للبروتينات وعلامات متشابك في الخلايا العصبية الأولية

Summary

هذا البروتوكول يوضح كيفية استخدام المجهر فائقة الدقة لدراسة البروتين التعريب المشترك في الثقافات العصبية الأولية.

Abstract

نقاط الاشتباك العصبي هي العناصر الوظيفية للخلايا العصبية وعيوبها أو خسائرها هي في أساس العديد من الاضطرابات العصبية والعصبية. وتستخدم على نطاق واسع دراسات التصوير للتحقيق في وظيفتها واللدونية في الظروف الفسيولوجية والمرضية. بسبب حجمها وهيكلها، تتطلب دراسات توطين البروتينات تقنيات تصوير عالية الدقة. في هذا البروتوكول، نحن وصف إجراء لدراسة في الخلايا العصبية الأولية التعريب المشترك للبروتينات المستهدفة مع علامات متشابك على مستوى فائقة الدقة باستخدام المجهر الإضاءة منظم (SIM). SIM هي تقنية إضاءة منقوشة تعمل على مضاعفة الدقة المكانية للمجهر الواسع، لتصل إلى تفاصيل تبلغ حوالي 100 نانومتر. يشير البروتوكول إلى عناصر التحكم والإعدادات المطلوبة لإجراء دراسات قوية للترجمة المشتركة ونظرة عامة على الأساليب الإحصائية لتحليل بيانات التصوير بشكل صحيح.

Introduction

وقد تغير فهم وعرض المشبك بشكل كبير منذ وصفه الأول من قبل فوستر وشيرينغتون في 1897¹. ومنذ ذلك الحين، معرفتنا الاتصالات العصبية والعمليات الجزيئية وراء ذلك نمت أضعافا^{مضاعفة 2}. أصبح من الواضح أنه يمكن التفكير في نقاط الاشتباك العصبي كنظام حجرتين: حجرة ما قبل متشابك تحتوي على حويصلات للافراج عن الناقلات العصبية وحجرة ما بعد متشابك مع مستقبلات³. وقد تطورت هذه النظرة التبسيطية، في السنوات العشرين الماضية، إلى شبكة معقدة من البروتينات المطلوبة لتحويل الإرسال إلى إشارة⁴.

المكاسب في فهم جزئيا بسبب تقنيات فائقة الدقة التي تغلبت على الحد الأقصى للحجم المجهري الضوئي التقليدي لتتناسب مع البعد من نقاط الاشتباك العصبي أفضل^{5،6،7،8،9،10}. بسبب الحد من الانعراج ، لا يمكن للمجهر البصري أن يصل إلى قرار فوق 200 نانومتر^11،12. لتجاوز هذا الحد، تم إنشاء تقنيات فائقة الدقة، وذلك باستخدام نهج مختلفة والوصول إلى مختلف القرارات الحد من الحيود الفرعي: SIM، STED (المجهر استنفاد الانبعاثات المحفزة)، النخيل (PhotoActivated التعريب المجهري) و STORM (المجهر إعادة الإعمار البصرية العشوائية)^13،14. تُضاعف SIM الدقة المكانية لأنظمة المجهر واسعة النطاق القائمة على الليزر عن طريق إدخال صرّار حيود في مسار شعاع الإثارة¹⁵. diffracts صر المنقولة أشعة الليزر لخلق نمط الإضاءة المعروفة، وعادة المشارب. يتم فرض هذا النمط من الضوء المنظم عن قصد إلى التوزيع المكاني غير معروف للصبغة الفلورية (من العينة). هامش التداخل التي شكلتها نمطين ترميز لتفاصيل دقيقة لا يمكن تحديدها خلاف ذلك مع المجهر العادي واسعة المجال. يتم الحصول على الصورة النهائية الفائقة من خلال الجمع بين وفك مع الأساليب الرياضية عدة صور خام من نفس العينة التي تم الحصول عليها من خلال ترجمات وتناوب الصريف الحيود. قرار فائقة حل الصور تصل إلى 100 نانومتر في الجانبي و 500 نانومتر في الاتجاهات المحورية ل2D-SIM¹⁵ أو 100 نانومتر في الجانبي و 250 نانومتر في الاتجاهات المحورية ل3D-SIM¹⁶.

الفهم الجديد للمشابك هو أكثر أهمية في ضوء العديد من الاضطرابات العصبية حيث خلل متشابك يلعب دورا رئيسيا في بداية وتقدم^17,18. مرض الزهايمر، متلازمة داون، مرض باركنسون، أمراض البريون، الصرع، اضطرابات طيف التوحد ومتلازمة X الهشة من بين أمور أخرى قد تم ربطها بتشوهات في التركيب متشابك، مورفولوجيا وظيفة^{19،20،21،22}.

في الآونة الأخيرة، وذلك باستخدام مجموعة من الأجسام المضادة سومو محددة، استخدمنا سيم لإظهار التعريب المشترك في الخلايا العصبية فرس النهر الأولية من البروتينات سومو مع علامات ما قبل وما بعد متشابك سينابتوفيسين و PSD95 على مستوى فائقة الدقة²³. هذا مكننا من تأكيد الأدلة المجهرية الحيوية والمجهرية الميكولوجية لتوطين سومو في الخلايا العصبية.

هنا، ونحن وصف بروتوكول لدراسة توطين البروتينات في الخلايا العصبية الأولية فرس النهر الماوس. في الوقت نفسه، قد يتم تكييف هذا البروتوكول مع أنواع مختلفة من الثقافات العصبية الأولية.

Protocol

1- الثقافات الأساسية

1. الثقافة الماوس فرس النهر الخلايا العصبية الأولية في أغطية الغرف (مثل ibidi μ-الشريحة 8 Well أو Nunc Lab-Tek Coverglass) التي تتطابق مع الشرط الموضوعي لسمك الغطاء #1.5 (0.17 مم).
2. يغطي معطف مع 100 ميكرولتر من بولي-L-ليسين (100 ميكروغرام/مل).
3. في اليوم التالي، غسل الأغطية الغرف مرتين مع المالحة المعقمة الفوسفات المخزنة (PBS).
4. للحصول على الخلايا العصبية الأساسية الماوس، عزل فرس النهر من الجراء P1-P4²³.
5. مكان تشريح فرس النهر في 10 مل من وسائل الإعلام تشريح (الجدول 1) والسماح لهم إيداع في الجزء السفلي من الأنبوب.
6. باستخدام ماصة معقمة، وإزالة بعناية وسائل الإعلام تشريح، وترك فرس النهر دون عائق في الجزء السفلي من الأنبوب.
7. إضافة 10 مل من وسائل الإعلام 1 (الجدول 1) إلى فرس النهر واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
8. باستخدام ماصة معقمة، وإزالة بعناية وسائل الإعلام 1، وترك فرس النهر دون عائق في الجزء السفلي من الأنبوب.
9. إضافة 10 مل من وسائل الإعلام 2(الجدول 1) وترك أنبوب (توج) الطرد المركزي تحت غطاء محرك السيارة أفقيا لمدة 45 دقيقة.
10. دع أنبوب الطرد المركزي يقف عموديًا للسماح للأنسجة بالاستقرار في الجزء السفلي من الأنبوب.
11. باستخدام ماصة معقمة، وإزالة بعناية وسائل الإعلام 2، وترك فرس النهر دون عائق في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي.
12. إضافة 2 مل من وسائل الإعلام 3 (الجدول 1).
13. باستخدام ماصة p1000 مع طرف مصفى، ميكانيكيا فصل الخلايا من الأنسجة.
14. نقل فائقة, التي تقع في الخلايا العصبية المعزولة, إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 15 مل.
15. الطرد المركزي تعليق الخلية لمدة 2 دقيقة في 300 × ز في درجة حرارة الغرفة (RT).
16. بعد الطرد المركزي، تقع الخلايا في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي. باستخدام ماصة معقمة تجاهل المابس.
17. خلايا إعادة الإنفاق في 1 مل من وسائل الإعلام 4.
18. استخدم فلتر 70 ميكرومتر للقضاء على الخلايا غير المُزَوّسة.
19. عد الخلايا القابلة للحياة في غرفة Bürker بإضافة 1 ميكرولتر من 0.4 ٪ Trypan حل أزرق إلى 19 ميكرولتر من تعليق الخلية.
20. خلايا لوحة في 70،000 خلايا / جيدا في حجم 200 ميكرولتر في البئر.
21. السماح للخلايا لإرفاق لمدة 2 ساعة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO_2.
22. أخرج الأغطية المُغطّاة من الحاضنة واستبدلها بعناية مع 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام الثقافية.
23. اترك الغطاءات المُغطّاة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و5% CO_2.
24. استبدال ثلث الوسط مع وسائل الإعلام ثقافة جديدة كل 5-7 أيام.
25. انتظر حتى تنضج الخلايا العصبية الأساسية في فرس النهر (12-14 يومًا بعد الطلاء) لإجراء دراسات التعريب المشترك.

2. تلطّخ المناعة

1. خذ الأغطية المُغطّية من الحاضنة.
2. إزالة الوسيطة.
3. اغسل الآبار بسرعة بـ 200 ميكرولتر من برنامج PBS.
4. إضافة 4٪ شبهformaldehyde (PFA) في برنامج تلفزيوني (200 ميكرولتر / جيدا) إلى الخلايا العصبية لإصلاحها بسرعة.
5. احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة في RT.
6. إزالة حل PFA.
7. Permeabilize الخلايا عن طريق إضافة برنامج تلفزيوني مع 0.2٪ تريتون X-100 (200 ميكرولتر / بئر).
8. احتضان لمدة 1 دقيقة في RT.
9. إزالة الحل واحتضان العينات مع 1٪ البوم مصل البقر (BSA) في برنامج تلفزيوني (200 ميكرولتر / جيدا) لمدة 1 ساعة في RT لتغطية بشكل سلبي جميع الأسطح ملزمة الحرة من لوحة مع بروتين غير ذي صلة للتحليل. يقلل المخزن المؤقت القائم على BSA بدون Triton X-100 من خلفية الأجسام المضادة بكفاءة أكبر من نفس المخزن المؤقت مع 0.2٪ Triton X-100.
10. إزالة الحل.
11. إضافة الأجسام المضادة الأولية من اختيار المخفف في محلول PBS التي تحتوي على 1٪ BSA و 0.2٪ تريتون X-100 (120-200 μL / جيدا، اعتمادا على تخفيف الجسم المضاد وتوافر). احتضان العينات لمدة 2 ساعة.
    1. كتحكم سلبي، لا تضيف أي جسم مضاد أساسي إلى أحد الآبار. ويمكن استخدام أجسام مضادة متعددة من أنواع مختلفة ضد أهداف مختلفة في نفس الوقت. استخدام جسم مضاد ضد MAP2 (علامة الخلايا العصبية) التي أثيرت في الدجاج، وهو جسم مضاد ضد إما PSD95 أو synaptophysin التي أثيرت في الماوس، والأجسام المضادة ضد البروتين الهدف التي أثيرت في أرنب. يسمح هذا بتحليلات SIM ثلاثية الألوان.
12. سرعان ما يغسل الآبار ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني (200 ميكرولتر / جيدا).
13. إضافة الأجسام المضادة الثانوية (dyLight و Alexa الأجسام المضادة الثانوية على حد سواء يمكن استخدامها) المخفف في حل PBS التي تحتوي على 1٪ BSA و 0.2٪ تريتون X-100 (200 ميكرولتر / بئر). احتضان العينات لمدة 1 ساعة في RT.
14. سرعان ما يغسل الآبار ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني (200 ميكرولتر / جيدا).
15. أضف صبغة Hoechst بتركيز 1 ميكروغرام/مل مخفف في PBS (200 ميكرولتر/بئر) لنوى وصمة عار. احتضان العينات لمدة 10 دقائق في RT.
16. سرعان ما غسلت الآبار مرتين مع برنامج تلفزيوني.
17. قم بتحميل الخلايا باستخدام محمول متوافق مع SIM. استخدام 10 μL / بئر من ProLong زجاج Antifade Mountant.
18. تغطية وحماية الخلايا مع غطاء (على سبيل المثال، غلاف دائري بقطر 8 مم). ويمكن أيضا أن تكون تلك المربعة المستخدمة.
19. تخزين الأغطية الغرف في RT والانتظار على الأقل 48 ساعة قبل الحصول على الصور. يتطلب الماس زجاج ما لا يقل عن يومين من العلاج قبل الاستحواذ فائقة القرار.

3. التحكم في خصوصية الأجسام المضادة

ملاحظة: استخدم استراتيجيتين لضمان خصوصية الأجسام المضادة. الاستراتيجية الأولى هي استخدام ما لا يقل عن اثنين من الأجسام المضادة المختلفة التي تستهدف الركيزة نفسها. الاستراتيجية الثانية هي تحييد الأجسام المضادة عن طريق الحضانة مع هدف البروتين النقي أو epitope المستخدمة لرفع الأجسام المضادة.

1. احتضان الأجسام المضادة من اختيار مع خمس مرات زائدة من الهدف المؤتلف أو epitope ل 1 ساعة في RT في 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني.
2. بعد الحضانة، واستخدام الأجسام المضادة تحييد في التركيز المعتاد للتلوين كما هو موضح أعلاه من 2.11.

4. معايرة المجهر

ملاحظة: نحن نستخدم بشكل روتيني نظام المجهر فائق الدقة من قبل نيكون من قبل نيكون من أجل دراسات فائقة الدقة. ومع ذلك، تقدم العديد من الشركات الأخرى أيضاً مجاهر فائقة الدقة في كتالوجاتها. على الرغم من أن يتم وصف مؤشرات محددة لنظام N-SIM من نيكون، يمكن تعميم التعليمات التالية على أنظمة أخرى. قبل الحصول على صور SIM ، يتطلب النظام معايرة مناسبة مع حبات فلورية ذات حجم دون دقة محددة. ومن الأمثلة على ذلك مصغرة TetraSpeck. هذه الخرز ملطخة بأصباغ فلورية مختلفة للسماح بمعايرة أشعة الليزر المختلفة مع عينة واحدة.

1. في حمام مائي سونيكات حول 1.8 × 10⁸ الفلورسنت microspheres لمدة 10 دقيقة. يتطلب نظام N-SIM من نيكون عينة من الخرز متعدد الألوان قليلة السكان للمعايرة. قد يختلف هذا بالنسبة للأنظمة الأخرى التي تتطلب طبقة واحدة كثيفة من الخرز الفلورسنت بحجم دون دقة. ضبط عدد الجزيئات الفلورية وفقا لذلك.
2. تمييع الفلورسنت microspheres 1:500 في الماء المقطر مزدوجة.
3. سونيكات للمرة الثانية لمدة 10 دقائق إضافية.
4. بايبت 15 ميكرولتر من الخرز المخفف إلى بئر من غطاء الغرف.
5. اترك المحلّف جافًا لمدة 5 دقائق في RT.
6. أضف 10 ميكرولتر من محلول التركيب ووضع غطاء 8 مم على القمة.
7. انتظر 48 ساعة على الأقل للسماح بالمعالجة المناسبة.
8. بدوره على المجهر وأشعة الليزر.
9. دع النظام يسخّن للوصول إلى التوازن الحراري لجميع مكونات المجهر. N-SIM سوبر القرار المجهر نظام يتطلب 3 ساعات على الأقل.
10. حدد الهدف 100x.
11. بدء المعايرة عن طريق محاذاة أشعة الليزر إلى مركز كتلة صرع الحيود. في نظام N-SIM، يسمح مقبض ميكرومتر وكاميرا مخصصة بتمركز الحزم الضوئية إلى الهدف.
12. أدخل غطاء الأغطية المُغطّى في المجهر للعرض. تعيين النظام إلى سمك الأغطية الغرف عن طريق ضبط طوق التصحيح الموضوعي. برنامج NIS، والبرمجيات الملكية المقدمة مع نظم المجهر N-SIM فائقة الدقة، لديه وظيفة تلقائية لتنظيم الياقات التصحيح.
13. ضبط تركيز كتلة الصريف لكل قناة لضمان تركيز الإضاءة نمط منظم على العينة. يوفر برنامج NIS دالة تلقائية لهذه المهمة.
14. بعد ذلك، احصل على صور 3D-SIM الخام من microspheres متعددة الألوان. إعادة بناء الصور الخام للحصول على صورة فائقة حل باستخدام برنامج المجهر أو منصة البرمجيات مفتوحة المصدر لتحليل الصور البيولوجية ImageJ²⁴ وspersIM المساعد²⁵.
15. حساب، لكل طول موجي منفصل، تحويل فورييه للصورة فائقة الحل التي تم الحصول عليها في 4.14. إذا فشلت الصورة المحولة في الحصول على نمط مثل الزهور الصحيحة، إعادة تشغيل المعايرة من 4.11 منذ لم يتم تحقيق فائقة الدقة.
16. في الصورة فائقة الحل، حدد ميكروسير واحد وحساب ملفه الشخصي كثافة لكل قناة لقياس دقة التي تحققت. وينبغي أن يكون الآن على مقربة من 100 نانومتر بشكل مؤقت.
17. بعد ذلك، تنفيذ تسجيل القناة عن طريق تراكب اقتناء متعددة القنوات من microspheres. والهدف هو أن collimate جميع إشارات القناة بشكلٍ مُشَرَق وبديهي. هذا سوف القضاء على الانحرافات لوني بسبب عدم محاذاة القنوات المختلفة ويساعد على تحليل التعريب المشترك.
18. تأكيد جودة المعايرة باستخدام وظائف "خطوات مرحلة الإضاءة" و "تركيز نمط الإضاءة" من SIMcheck²⁶، مجموعة من الإضافات للتطبيق مفتوح المصدر ImageJ. وتحقيقاً لهذه الغاية، قم بإعداد غطاء مكسو بحجر للحصول على طبقة واحدة كثيفة من مجهر TetraSpeck والحصول على صورة 3D-SIM للعينة. تحليل الصورة في ImageJ، وإذا تم الكشف عن انحرافات، إعادة تشغيل معايرة المجهر من الخطوة 4.11.

5 - الاقتناء

1. ابدأ في تحليل العينة باستخدام هدف 40x في وضع confocal أو widefield. وهذا يسمح الملاحة إلى العينة، والحفاظ على التفاصيل الجيدة ومجال كبير من الرؤية.
2. استخدم إشارة الأجسام المضادة MAP2 لتحديد منطقة تمثل العمليات العصبية.
3. الحصول على صور للعينة في وضع confocal لتحديد نوعية تلطيخ. وسوف تعكس نوعية confocal الفقراء في نوعية SIM الفقراء، وبالتالي تتطلب العينات التي يجب التخلص منها.
4. إذا كانت المنطقة وجودة الصور مرضية، قم بتبديل الهدف إلى 100x.
5. تطبيق النفط على الهدف 100x.
6. الحصول على صورة واسعة أو confocal التي سيتم استخدامها في وقت لاحق لتقييم نوعية الصورة فائقة حل (الشكل 1A, B).
7. التبديل إلى وضع SIM 3D.
8. باستخدام إطارات الحوار لتعيين معلمات للحصول على، حدد أعلى إعداد عمق بت متوفر لزيادة معلومات اللون إلى أقصى حد. عادةً ما يكون 16-بت هو الخيار القياسي. وعلاوة على ذلك، ولتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء، حدد قيمة تردد منخفض للاستحواذ، مثل MHz 1.
9. باستخدام النوافذ المدرج التكراري، تعيين الليزر السلطة للحصول على استجابة خطية من إشارة. لتجنب فقدان المعلومات، حد من البيكسلات المشبعة في الصور. يستخدم نظام N-SIM كاميرا أندور iXon3. عند العمل عند 16 بت، اختر كثافة الهدف 16,000 لضمان الاستجابة الخطية للكاميرا. وبدلاً من ذلك، اختر نطاقًا يتراوح بين 30,000-45,000 لزيادة النطاق الديناميكي لعملية الاستحواذ إلى أقصى حد.
10. تعيين قوة الليزر بين 0.1٪ و 50٪ عند تصوير العينات وأوقات التعرض بين 50 مللي ثانية و2 ثانية. قد القوى الليزر فوق 50% يسبب photobleaching سريع من الفلوروفوريس في الاستخدام.
11. ابدأ في الحصول على الصور في وضع SIM 3D.
12. استخدم SIMcheck ، وهو عبارة عن مجموعة من الإضافات المجانية لـ ImageJ ، لتقييم جودة الحصول على الصور الخام.
13. إذا لم يكشف SIMCheck عن أي آثار أو مشكلات تتعلق بالجودة ، فاقتناء ما لا يقل عن 10 صور من 4 نسخ فنية للسماح بالتحليل الإحصائي.

6- ما بعد الإنتاج: إعادة بناء الصورة

ملاحظة: الصور التي تم الحصول عليها من 3D-SIM هي صور خام تحتاج إلى المعالجة للحصول على صور تم إعادة تشكيلها فائقة الحل. إعادة بناء غير صحيحة من الصور الخام يمكن أن يؤدي إلى القطع الأثرية التي من شأنها أن تؤثر على تحليل العينات. ولذلك ينبغي إيلاء اهتمام كبير لاختيار معايير إعادة الإعمار على النحو الصحيح.

1. معالجة الصور الخام باستخدام برنامج تحليل إعادة بناء المجهر للحصول على صورة فائقة الحل(الشكل 1C). بدلا من ذلك ، استخدم البرنامج المساعد ImageJ المتاح مجانا fairSIM لإعادة بناء الصور الخام.
2. حساب تحويل فورييه من الصور فائقة حل باستخدام برنامج إعادة بناء المجهر أو برنامج إيمج البرنامج المساعد SIMCheck. يجب أن تعود صورة جيدة أعيد بناؤها ، لكل قناة ، صورة تشبه الزهرة. إذا فشلت الصور المعاد بناؤها في إعادة إنشاء شكل يشبه الزهور ، فعاود تشغيل الصور الخام وإعادة بنائها عن طريق تعديل معلمات إعادة الإعمار مثل تصفية Wiener و apodization وقمع النظام^{الصفري 27}. في برنامج NIS ، باستخدام المعاينة لمراقبة كيفية تأثير تغيير المعلمات على الصورة النهائية التي تم حلها ، قم بتعديل المعلمات i) الإضاءة Contrast تعديل ، ii) عالية الدقة منع الضوضاء و3) خارج التركيز قمع.
3. بعد ذلك ، قم بتحليل الصورة المعاد بناؤها للكشف عن القطع الأثرية بشكل غير متحيز باستخدام NanoJ-SQUIRREL²⁸، وهو مكون إضافي يستند إلى ImageJ لتقييم جودة الصور فائقة الحل.
4. إذا NanoJ سنجاب يكشف التحف ، وإعادة تشغيل من الصور الخام وإعادة بنائها عن طريق تعديل المعلمات إعادة الإعمار مثل Wiener تصفية ، apodization وقمع الصفر من أجل. في برنامج NIS، باستخدام المعاينة لمراقبة كيفية تأثير تغيير المعلمات على الصورة النهائية التي تم حلها، قم بتعديل المعلمات تباين تعديل الإضاءة، و منع الضوضاء عالية الدقة، و إلغاء التركيز.
5. استخدم الصور فائقة الحل لحساب ملف تعريف الترجمة المشتركة و/أو معاملات Pearson و Mander.

7. التعريب المشترك مع تحليل الملف الشخصي

ملاحظة: كخطوة أولى لدراسة التعريب المشترك بين علامات متشابكة والبروتين من الفائدة، واتخاذ صورة فائقة حل وتحليل مكان واحد لتحديد تداخل إشارة.

1. تحديد موضع واحد على الصورة فائقة الحل.
2. الحصول على ملامح كثافة الإشارات الفلورية من موضع الفائدة.
3. تصدير البيانات.
4. استخدم GraphPad Prism، أو برنامج تحليل مشابه، لتطبيع جميع قمم الإشارة والحصول على كثافة إشارة مماثلة لكل قناة مع الهدف النهائي المتمثل في تحديد مكان محدد للتعريب المشترك.

8. القياس الكمي لمعاملات بيرسون وماندر

ملاحظة: إذا اقترح تحليل ملف تعريف واحد موضع المشاركة التعريب، يمكن إجراء تحليل أكثر عمومية للصورة بأكملها من خلال حساب معاملات بيرسون وماندر^29،30.

1. استخدم JACoP³¹، وهو مكون إضافي من ImageJ ، لتحديد المعلمتين للتعريب المشترك: Pearson's و Mander.

9 - التحليل الإحصائي

1. استخدم برنامج GraphPad Prism، أو برنامج مماثل للتحليل والرسوم البيانية، لمعالجة البيانات التي تم جمعها باستخدام JACoP.
2. استخدم على الأقل 40 صورة SIM لكل حالة تم تحليلها للحصول على الرسوم البيانية وللحصول على صلة إحصائية.

النتائج

نحن نقدم هنا سير العمل القياسية لدراسة البروتينات العصبية شارك في التعريب. قمنا أولاً بمعايرة المجهر وبعد ذلك قمنا بإجراء تحليل SIM للعينات. لمعايرة النظام، استخدمنا الفلورسنت microspheres من 0.1 ميكرومتر القطر. عند الحصول على صور 3D-SIM فائقة الحل من الخرز ، فإن بيانات الصورة الأساسية هي فورييه - تح?...

Discussion

إن توضيح بنية وتكوين المشبك أمر بالغ الأهمية لفهم العمليات الفسيولوجية والمرضية التي تنظم الذاكرة والإدراك. بينما في الحالة الطبيعية، نقاط الاشتباك العصبي هي لبنات بناء الذاكرة، كما أنها تكمن وراء الاضطرابات العصبية المعقدة مثل مرض الزهايمر³². البروتوكول الموصوف هنا يعمل ع?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue solution	Thermo Fisher Scientific	15250061	Chemical
70 µm filter	Corning	352350	Equiment
Alexa	Thermo Fisher Scientific	-	Antibody
Antibody SENP1	Santa Cruz	sc-271360	Antibody
B27 Supplement	Life Technologies	17504044	Chemical
Bovine serum albumin	Merck	5470	Chemical
CaCl2	Merck Life Science	21115	Chemical
Chambered coverslips	Ibidi	80826	Equiment
DyLight	Thermo Fisher Scientific	-	Antibody
FBS (Hyclone)	GIBCO	SH3007002 (CHA1111L)	Serum
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent	Thermo Fisher Scientific	F8803	Equiment
Glucose	Merck Life Science	G8769	Chemical
Glutamax	GIBCO	35050061	Chemical
HEPES	Merck Life Science	H3537	Chemical
L-Cystein	Merck Life Science	C6852-25g	Chemical
MAP2	Merck	AB15452	Antibody
MEM	Life Technologies	21575022	Medium
MgCl	Merck Life Science	M8266	Chemical
NaOH	VWR International	1,091,371,000	Chemical
Neurobasal A	Life Technologies	10888022	Medium
N-SIM Super Resolution Microscope	Nikon	-	Instrument
Papain	Merck Life Science	P-3125	Chemical
paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific	28908	Chemical
Pen/Strep 10x	Life Technologies	15140122	Chemical
phosphate-buffered saline	Gibco	10010023	Chemical
Poly-L lysine	Sigma	P2636	Chemical
ProLong Diamond Glass Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36970	Chemical
PSD95	NeuroMab	K28/43	Antibody
Round coverglass	Thermo	12052712	Equiment
SUMO1	Abcam	ab32058	Antibody
Synaptophysin	Merck	S5768	Antibody
Triton X-100	Merck	T8787	Chemical
Trypsin inhibitor	Merck Life Science	T9003-500MG	Chemical