1차 뉴런에서 단백질과 시냅스 마커의 공동 국소화를 연구하는 초해상도 이미징

요약

이 프로토콜은 1 차적인 신경 배양에서 단백질 공동 국소화를 공부하기 위하여 초해상도 현미경 검사를 채택하는 방법을 보여줍니다.

초록

시냅스는 뉴런의 기능적 요소이며 결함이나 손실은 여러 신경 퇴행성 및 신경 장애의 기초입니다. 이미징 연구는 생리학적 및 병리학 적 조건에서 자신의 기능과 가소성을 조사하는 데 널리 사용됩니다. 단백질의 크기와 구조 때문에 고해상도 이미징 기술이 필요합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 구조화 된 조명 현미경 검사 (SIM)를 사용하여 초해상도 수준에서 시냅스 마커와 대상 단백질의 공동 국소화를 1 차 뉴런에서 연구하는 절차를 설명합니다. SIM은 광야 현미경 검사법의 공간 해상도를 두 배로 늘려 약 100nm의 세부 사항에 도달하는 패턴 조명 기술입니다. 이 프로토콜은 강력한 공동 지역화 연구에 필요한 제어 및 설정과 이미징 데이터를 제대로 분석하는 통계 방법에 대한 개요를 나타냅니다.

서문

시냅스의 이해와 견해는 1897년 포스터와 셔링턴의 첫 번째 설명 이후¹엄청나게 변했다. 그 이후로, 신경 통신및 그 뒤에 분자 프로세스에 대한 우리의 지식은 기하 급수적으로 성장했다^2. 시냅스는 신경 전달 물질의 방출을위한 소포를 포함하는 사전 시냅스 구획과^{수용체3를}가진 시냅스 후 구획으로 생각할 수 있다는 것이 분명해졌습니다. 이 단순한 보기는, 지난 20 년 에서, 신호^4로송신기 결합을 변환하는 데 필요한 단백질의 복잡한 네트워크로 진화했다.

이해의 이득은 부분적으로 시냅스의 치수에 맞게 종래의 광 현미경 검사법의 회절 한계를 극복슈퍼 해상도 기술로 인해^{5,,6,,7,,8,,9,,10.} 회절 제한으로 인해 광학 현미경은 200 nm 측면^11,,12이상의 해상도에 도달할 수 없습니다. 이 한계를 우회하기 위해, 초해상도 기술은 다른 접근 방식을 사용하여 다른 부회절 제한 해상도에 도달했다 : SIM, STED (자극 방출 고갈 현미경 검사), PALM (사진 활성화 국소화 현미경 검사법) 및 STORM (스토세스 광학 재건 현미경)^13,,14. SIM은 흥분 빔^{경로(15)에}회절 격자를 삽입하여 레이저 기반 광시야 현미경 시스템의 공간 해상도를 두 배로 합니다. 이동식 격자 는 레이저 빔을 분산시켜 알려진 조명 패턴, 일반적으로 줄무늬를 만듭니다. 이러한 의도적으로 구조화된 광 패턴은 형광염(시료)의 알 수 없는 공간 분포에 중첩된다. 두 패턴에 의해 형성된 간섭 프린지는 일반 광시야 현미경 검사법과 구별할 수 없는 미세한 세부 사항에 대해 인코딩합니다. 최종 슈퍼 해결 된 이미지는 회절 격자의 번역 및 회전에 의해 얻은 동일한 샘플의 여러 원시 이미지를 수학 방법과 결합하고 디코딩하여 얻을 수 있습니다. 수퍼-리졸브 된 이미지의 해상도는 측면 방향에서 100 nm, 측면 방향에서 2D-SIM¹⁵ 또는 100 nm및 3D-SIM^16에대한 축 방향에서 250 nm에 도달한다.

시냅스의 새로운 이해는 시냅스 기능 장애가 발병 및 진행^17,,18에서중요한 역할을 하는 많은 신경 장애에 비추어 더욱 중요합니다. 알츠하이머병, 다운증후군, 파킨슨병, 프리온질환, 간질, 자폐스펙트럼장애 및 연약한 X증후군등은 시냅스 조성, 형태학 및^{기능(19,,20,,21,,22)의}이상과 관련이 있다.

최근에는 SUMO 특이적 항체 세트를 사용하여 SIM을 사용하여 수모 단백질의 1차 해마 뉴런에서 시냅틱 마커 시냅토피신 및 PSD95를 초해상도 레벨^23에서공동 국소화를 보여주었다. 이것은 우리가 뉴런에 있는 SUMO 현지화의 생화학그리고 공초점 현미경 검사약 증거를 확인하는 것을 가능하게 했습니다.

여기에서, 우리는 마우스 해마 1 차적인 뉴런에 있는 단백질의 현지화를 연구하기 위하여 프로토콜을 기술합니다. 동시에, 이 프로토콜은 1 차적인 신경 문화의 다른 모형에 적응될 수 있습니다.

프로토콜

1. 1차 문화

1. #1.5 (0.17 mm) 커버 슬립 두께에 대한 객관적인 요구 사항과 일치하는 챔버 커버립 (예 : Ibidi μ-Slide 8 Well 또는 Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)의 배양 마우스 해마 1 차 뉴런.
2. 폴리 L-리신 (100 μg/mL)의 100 μL코팅 챔버 커버립.
3. 다음 날, 멸균 인산염 완충식식염(PBS)으로 챔버 커버립을 두 번 씻는다.
4. 마우스 기본 뉴런을 얻으려면 P1-P4 새끼^23에서해마를 분리하십시오.
5. 해부 된 해마를 해부 10 mL(표 1)에놓고 튜브 의 바닥에 입금하십시오.
6. 멸균 파이펫을 사용하여 해부 매체를 조심스럽게 제거하고 해마가 튜브 바닥에 방해받지 않도록 합니다.
7. 10mL의 미디어1(표 1)을해마에 넣고 37°C에서 30분간 배양합니다.
8. 멸균 파이펫을 사용하여 미디어 1을 조심스럽게 제거하고 해마가 튜브 바닥에 방해받지 않도록 하십시오.
9. 미디어2(표 1)의10mL를 넣고 후드 아래에 원심분리기 튜브를 수평으로 45분간 둡니다.
10. 원심분리기 튜브가 수직으로 서서 조직이 튜브 의 바닥에 정착할 수 있도록 하십시오.
11. 멸균 파이펫을 사용하여 Media 2를 조심스럽게 제거하고 해마를 원심분리기 튜브 바닥에 방해받지 않도록 하십시오.
12. 미디어 3(표 1)의2 mL을 추가합니다.
13. 여과 된 팁이있는 p1000 파이펫을 사용하여 조직에서 기계적으로 세포를 분리합니다.
14. 격리된 뉴런에 위치한 상체를 15mL 원심분리기 튜브로 옮기다.
15. 실온(RT)에서 300 x g에서 2분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.
16. 원심분리 후 세포는 원심분리기 튜브의 바닥에 위치합니다. 멸균 파이펫을 사용하여 상체를 폐기하십시오.
17. 미디어 4의 1 mL에서 세포를 다시 중단합니다.
18. 70 μm 필터를 사용하여 비소화 된 세포를 제거하십시오.
19. 0.4% Trypan blue 용액의 1μL을 세포 현탁액의 19 μL에 추가하여 Bürker 챔버에서 실행 가능한 세포를 계산합니다.
20. 70,000 개의 세포 /우물 당 200 μL의 부피에서 플레이트 셀.
21. 세포가 37°C 및 5% CO_2에서가습 된 인큐베이터에서 2 h를 부착할 수 있도록 한다.
22. 인큐베이터에서 챔버 커버립을 꺼내 배지를 문화 미디어의 200 μL로 조심스럽게 교체하십시오.
23. 챔버 커버립을 가습된 인큐베이터에 37°C 및 5% CO_2로둡니다.
24. 배지의 3분의 1을 5-7일마다 신선한 문화 매체로 교체하십시오.
25. 해마 1 차 신경이 완전히 성숙 될 때까지 기다립니다 (도금 후 12-14 일) 공동 국소화 연구를 수행.

2. 면역 형광 염색

1. 인큐베이터에서 챔버 커버립을 가져 가라.
2. 매체를 제거합니다.
3. PBS의 200 μL로 우물을 신속하게 세척하십시오.
4. PBS(200 μL/웰)에 4%의 파라포름알데히드(PFA)를 추가하여 신속하게 수정합니다.
5. RT에서 15분 동안 세포를 배양합니다.
6. PFA 솔루션을 제거합니다.
7. 0.2% 트리톤 X-100(200 μL/웰)로 PBS를 추가하여 세포를 페메아빌화한다.
8. RT에서 1분 동안 인큐베이션을 합니다.
9. PBS(200 μL/well)에서 1%의 소 세럼 알부민(BSA)으로 샘플을 배양하여 RT에서 1시간 동안 플레이트의 모든 자유 결합 표면을 분석용 과무관 단백질로 수동적으로 커버한다. Triton X-100이 없는 BSA 기반 차단 버퍼는 0.2% Triton X-100을 가진 동일한 버퍼보다 항체 배경을 보다 효율적으로 감소시킵니다.
10. 솔루션을 제거합니다.
11. 1% BSA 및 0.2% Triton X-100(항체 희석 및 가용성에 따라 120-200 μL/well)을 포함하는 PBS 용액에서 희석된 1차 항체를 추가합니다. 샘플을 2시간 동안 배양합니다.
    1. 부정적인 대조군으로서, 우물 중 하나에 어떤 1 차적인 항체를 추가하지 마십시오. 상이한 표적에 대하여 상이한 종의 다중 항체는 동시에 사용될 수 있다. 닭에서 자란 MAP2(뉴런 마커)에 대한 항체, 마우스에서 자란 PSD95 또는 시냅토피신에 대한 항체, 토끼에서 자란 표적 단백질에 대한 항체를 사용한다. 이렇게 하면 3색 SIM 분석을 수행할 수 있습니다.
12. PBS(200 μL/웰)로 우물을 세 번 빠르게 씻으실 수 있습니다.
13. 1% BSA 및 0.2% Triton X-100 (200 μL/웰)을 포함하는 PBS 용액에서 희석된 이차 항체(dyLight 및 Alexa 이차 항체모두 사용할 수 있음)를 추가합니다. RT에서 1h의 샘플을 배양합니다.
14. PBS(200 μL/웰)로 우물을 세 번 빠르게 씻으실 수 있습니다.
15. PBS(200 μL/웰)에서 희석된 1μg/mL 농도에서 Hoechst 염료를 첨가하여 핵을 더합니다. RT에서 샘플을 10분 동안 배양합니다.
16. PBS로 우물을 두 번 빠르게 씻으시면 됩니다.
17. SIM 호환 마운트제를 사용하여 셀을 마운트합니다. 프로롱 글래스 안티페이드 마운트제10 μL/웰을 사용하십시오.
18. 커버 와 커버 유리로 세포를 보호 (예를 들어, 직경 8mm의 둥근 커버 유리). 정사각형 을 사용할 수도 있습니다.
19. 챔버 커버립을 RT에 저장하고 이미지를 획득하기 전에 적어도 48 h를 기다립니다. 다이아몬드 글래스는 슈퍼 해상도 획득 전에 최소 2일 의 경화가 필요합니다.

3. 항체 특이성 제어

참고: 항체 특이성을 보장하기 위해 두 가지 전략을 사용합니다. 첫 번째 전략은 동일한 기판을 대상으로 적어도 두 개의 상이한 항체를 사용하는 것입니다. 두 번째 전략은 항체를 올리는 데 사용되는 정제된 단백질 표적 또는 에피토프를 이용한 배큐비에 의한 항체 중화이다.

1. PBS에서 1% BSA에서 RT에서 1h에 대한 재조합 표적 또는 에피토프를 5배 초과하여 선택된 항체를 배양한다.
2. 인큐베이션 후, 상술한 바와 같이 염색에 대한 통상농도에서 중화항체를 사용한다.

4. 현미경 교정

참고: 우리는 정기적으로 슈퍼 해상도 연구를 위해 Nikon에서 제조한 N-SIM 슈퍼 해상도 현미경 시스템을 사용합니다. 그러나, 몇몇 다른 회사는 또한 그들의 카탈로그에 초해상도 현미경을 제공합니다. Nikon의 N-SIM 시스템에 대한 구체적인 징후가 설명되어 있지만 다음 지침은 다른 시스템으로 일반화될 수 있습니다. SIM 이미지를 획득하기 전에 시스템은 특정 하위 해상도 크기의 형광 구슬을 적절히 보정해야 합니다. 예를 들어 테트라스펙 마이크로스피어입니다. 이 구슬은 하나의 샘플로 다른 레이저의 보정을 허용하기 위해 다른 형광 염료로 얼룩져 있습니다.

1. 수조에서 약 1.8 x 10⁸ 형광 마이크로 스피어를 10 분 동안 초음파 처리합니다. Nikon의 N-SIM 시스템은 교정을 위해 인구밀도가 낮은 다색 구슬 샘플이 필요합니다. 이는 하위 해상도 크기의 형광 구슬의 조밀한 단일 레이어가 필요한 다른 시스템에 다를 수 있습니다. 그에 따라 형광 입자의 수를 조정합니다.
2. 이중 증류수에서 형광 마이크로스피어 1:500을 희석합니다.
3. 추가 10 분 동안 두 번째 를 음속.
4. 희석된 구슬의 파이프 15 μL을 챔버 커버슬립의 우물로 넣습니다.
5. RT에서 5분 동안 용액을 건조시키십시오.
6. 장착 용액의 10μL을 추가하고 8mm 커버슬립을 위에 놓습니다.
7. 적절한 경화를 허용하려면 적어도 48 시간을 기다립니다.
8. 현미경과 레이저를 켭니다.
9. 모든 현미경 구성 요소의 열 평형에 도달하기 위해 시스템을 따뜻하게하십시오. N-SIM 슈퍼 해상도 현미경 시스템은 적어도 3 시간이 필요합니다.
10. 100x 목표를 선택합니다.
11. 레이저를 회절 격자 블록의 중심에 정렬하여 교정을 시작합니다. N-SIM 시스템에서는 마이크로미터 노브와 전용 카메라를 사용하여 광선을 대상에 중앙을 구성할 수 있습니다.
12. 챔버 커버슬립을 현미경으로 삽입하여 볼 수 있습니다. 객관적인 보정 칼라를 조정하여 챔버 커버슬립 두께로 시스템을 설정합니다. Nis 소프트웨어는 N-SIM 슈퍼 해상도 현미경 시스템과 함께 제공되는 독점 소프트웨어로 보정 칼라를 조절하는 자동 기능을 갖추고 있습니다.
13. 각 채널에 대한 격자 블록 포커스를 조정하여 샘플에 초점을 맞춘 구조화 패턴 조명을 보장합니다. NIS 소프트웨어는 이 작업에 대한 자동 기능을 제공합니다.
14. 다음으로, 다색 마이크로스피어의 원시 3D-SIM 이미지를 획득한다. 생물학적 이미지 ImageJ 24 및 플러그인^{fairSIM(25)의}분석을 위한 현미경 소프트웨어 또는 오픈²⁴ 소스 소프트웨어 플랫폼을 사용하여 원시 이미지를 재구성하여 초고리 이미지를 얻을 수 있다.
15. 각 분리된 파장에 대해 4.14에서 얻은 슈퍼 해결 된 이미지의 Fourier 변환을 계산합니다. 변형된 이미지가 올바른 꽃 모양 패턴을 얻지 못하면 슈퍼 해상도가 달성되지 않았기 때문에 4.11에서 교정을 다시 시작합니다.
16. 수퍼 해결 된 이미지에서 단일 마이크로 스피어를 선택하고 각 채널에 대한 강도 프로파일을 계산하여 달성 된 해상도를 측정합니다. 이제 100nm에 가깝습니다.
17. 다음으로, 마이크로스피어의 멀티채널 인수를 오버레이하여 채널 등록을 수행합니다. 목표는 모든 채널 신호를 측면및 축으로 정렬하는 것입니다. 이렇게 하면 서로 다른 채널의 정렬 불량으로 인해 색수차를 제거하고 공동 지역화 분석을 지원합니다.
18. 오픈 소스 응용 프로그램 ImageJ에 대한 플러그인 제품군인 SIMcheck^26의기능 "일루미네이션 단계"와 "조명 패턴 포커스"를 사용하여 교정의 품질을 확인합니다. 이를 위해 챔버 커버슬립을 준비하여 테트라스펙 마이크로스피어의 조밀한 단일 층을 확보하고 시료의 3D-SIM 이미지를 획득한다. ImageJ에서 이미지를 분석하고 수차가 감지되면 4.11 단계에서 현미경 보정을 다시 시작합니다.

5. 취득

1. 공초점 또는 와이드필드 모드에서 40배 의 목표를 사용하여 샘플을 분석하기 시작합니다. 이렇게 하면 샘플에 대한 탐색을 통해 좋은 세부 정보와 넓은 시야를 유지할 수 있습니다.
2. MAP2 항체 신호를 사용하여 신경 과정을 나타내는 영역을 식별합니다.
3. 공초점 모드에서 샘플의 이미지를 획득하여 염색의 품질을 결정합니다. 열악한 공초점 품질은 SIM 품질이 좋지 않으므로 샘플을 폐기해야 합니다.
4. 이미지와 이미지의 품질이 만족스레면 목표를 100배로 전환합니다.
5. 100x 목표에 오일을 적용합니다.
6. 나중에 슈퍼 해결 된 이미지의 품질을 평가하는 데 사용되는 넓은 필드 또는 공초점 이미지를 획득(그림 1A, B).
7. 3D-SIM 모드로 전환합니다.
8. 대화 상자 창을 사용하여 수집을 위한 매개 변수를 설정하려면 색상 정보를 최대화하기 위해 사용할 수 있는 가장 높은 비트 깊이 설정을 선택합니다. 일반적으로 16비트는 표준 선택입니다. 또한 신호 대 잡음 비율을 개선하기 위해 1MHz와 같은 획득을 위한 저주파 값을 선택합니다.
9. 히스토그램 창을 사용하여 레이저 전원을 설정하여 신호의 선형 응답을 얻습니다. 정보 손실을 방지하려면 이미지의 포화 픽셀을 제한합니다. N-SIM 시스템은 Andor iXon3 카메라를 사용합니다. 16비트로 작업할 때 는 카메라의 선형 응답을 보장하기 위해 16,000의 목표 강도를 선택합니다. 또는 30,000-45,000 사이의 범위를 선택하여 인수의 동적 범위를 최대화합니다.
10. 50ms와 2s 사이의 샘플 및 노출 시간을 이미징 할 때 0.1 %와 50 % 사이의 레이저 전력을 설정합니다. 50% 이상의 레이저 파워는 사용 중형 형광의 신속한 광표백을 일으킬 수 있습니다.
11. 3D-SIM 모드에서 이미지 수집을 시작합니다.
12. ImageJ용 무료 플러그인 제품군인 SIMcheck를 사용하여 원시 이미지 의 획득 품질을 평가합니다.
13. SIMCheck에서 아티팩트 또는 품질 문제를 감지하지 못하는 경우 통계 분석을 허용하기 위해 4개의 기술 복제에서 최소 10개의 이미지를 수집합니다.

6. 포스트 프로덕션: 이미지 재구성

참고: 3D-SIM 획득 이미지는 재구성된 초해결 이미지를 얻기 위해 처리해야 하는 원시 이미지입니다. 원시 이미지를 잘못 재구성하면 샘플 분석에 영향을 주는 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 따라서 재건 매개 변수를 올바르게 선택하려면 큰 주의를 기울여야 합니다.

1. 현미경 재구성 분석 소프트웨어를 사용하여 원시 이미지를 처리하여 초해결영상(도 1C)을얻습니다. 또는 자유롭게 사용할 수 있는 ImageJ 플러그인 페어SIM을 사용하여 원시 이미지를 재구성합니다.
2. 현미경 재구성 소프트웨어 또는 ImageJ 플러그인 SIMCheck를 사용하여 슈퍼 해결 된 이미지의 Fourier 변환을 계산합니다. 좋은 재구성 된 이미지는 각 채널, 꽃과 같은 이미지에 대해 반환해야합니다. 재구성된 이미지가 꽃모양모양을 다시 만들지 못하면 원시 이미지에서 다시 시작하여 Wiener 필터링, 아포디제이션 및 제로 오더^{억제(27)와}같은 재구성 매개변수를 수정하여 재구성합니다. NIS 소프트웨어에서 미리 보기를 사용하여 매개 변수변경이 최종 해결된 이미지에 미치는 영향을 모니터링하고 매개 변수 i) 조명 변조 콘트라스트, ii) 고해상도 노이즈 억제 및 iii) 포커스 억제 를 해제합니다.
3. 다음으로, 재구성된 이미지를 분석하여 ImageJ 기반 플러그인인 NanoJ-SQUIRREL^28을사용하여 아티팩트를 바이어스방식으로 감지하여 수퍼리해결 이미지의 품질을 평가합니다.
4. NanoJ-SQUIRREL이 아티팩트를 감지하면 원시 이미지에서 다시 시작하고 Wiener 필터링, 아포지케이화 및 제로 오더 억제와 같은 재구성 매개 변수를 수정하여 재구성합니다. NIS 소프트웨어에서 미리 보기를 사용하여 매개 변수변경이 최종 해결된 이미지에 미치는 영향을 모니터링하고 매개 변수 조명 변조 콘트라스트, 고해상도 노이즈 억제 및 초점 사용 중지 를 수정합니다.
5. 슈퍼 해결된 이미지를 사용하여 공동 지역화 프로필 및/또는 Pearson 및 Mander의 계수를 계산합니다.

7. 프로파일 분석을 통해 공동 지역화

참고: 시냅스 마커와 관심 있는 단백질 간의 공동 지역화를 연구하는 첫 번째 단계로, 매우 해결된 이미지를 취하고 단일 궤적을 분석하여 신호 중첩을 결정합니다.

1. 슈퍼 해결 된 이미지에서 단일 궤적을 식별합니다.
2. 관심 있는 궤적의 형광 신호의 강도 프로파일을 가져옵니다.
3. 데이터를 내보냅니다.
4. 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 또는 유사한 분석 소프트웨어를 사용하여 모든 신호 피크를 정규화하고 각 채널에 대해 유사한 신호 강도를 얻을 수 있으며, 메뚜기 별 공동 지역화를 결정하는 최종 목표를 달성합니다.

8. 피어슨과 맨더의 계수의 정량화

참고: 프로파일 분석이 단일 궤적 공동 지역화를 제안한 경우 Pearson 및 Mander의 계수를^29,,30으로계산하여 전체 이미지에 대한 보다 일반적인 분석을 수행할 수 있습니다.

1. ImageJ 플러그인인 JACoP^31을사용하여 공동 지역화의 두 매개 변수인 Pearson's와 Mander's를 결정합니다.

9. 통계 분석

1. 그래프패드 프리즘 또는 유사한 분석 및 그래프 소프트웨어를 사용하여 JACoP로 수집된 데이터를 처리합니다.
2. 분석된 각 조건에 대해 최소 40개의 SIM 이미지를 사용하여 그래프를 얻고 통계적 관련성을 얻을 수 있습니다.

결과

우리는 여기에 신경 단백질 을 공동 국소화를 연구하는 표준 워크 플로우를 제시합니다. 우리는 먼저 현미경을 보정하고 다음 우리는 샘플의 SIM 분석을 수행했다. 시스템을 보정하기 위해 직경 0.1 μm의 형광 마이크로스피어를 사용했습니다. 구슬의 매우 해결된 3D-SIM 이미지를 얻으면 기본 이미지 데이터는 포리에 변환되어 공간 주파수 표현으로 다시 변환됩니다. 도 2A에서?...

토론

시냅스의 구조와 구성을 해명하는 것은 기억과 인식을 조절하는 생리학적 및 병리학적 과정을 이해하는 데 매우 중요합니다. 정상 상태에서 시냅스는 기억의 구성 요소이며, 알츠하이머^병(32)과같은 복잡한 신경 장애의 기초이기도 합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 SIM에게 불린 초해상도 현미경 기술으로 신경 단백질의 공동 현지화를 공부하는 역할을 합니다. SIM은 특정 조명 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue solution	Thermo Fisher Scientific	15250061	Chemical
70 µm filter	Corning	352350	Equiment
Alexa	Thermo Fisher Scientific	-	Antibody
Antibody SENP1	Santa Cruz	sc-271360	Antibody
B27 Supplement	Life Technologies	17504044	Chemical
Bovine serum albumin	Merck	5470	Chemical
CaCl2	Merck Life Science	21115	Chemical
Chambered coverslips	Ibidi	80826	Equiment
DyLight	Thermo Fisher Scientific	-	Antibody
FBS (Hyclone)	GIBCO	SH3007002 (CHA1111L)	Serum
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent	Thermo Fisher Scientific	F8803	Equiment
Glucose	Merck Life Science	G8769	Chemical
Glutamax	GIBCO	35050061	Chemical
HEPES	Merck Life Science	H3537	Chemical
L-Cystein	Merck Life Science	C6852-25g	Chemical
MAP2	Merck	AB15452	Antibody
MEM	Life Technologies	21575022	Medium
MgCl	Merck Life Science	M8266	Chemical
NaOH	VWR International	1,091,371,000	Chemical
Neurobasal A	Life Technologies	10888022	Medium
N-SIM Super Resolution Microscope	Nikon	-	Instrument
Papain	Merck Life Science	P-3125	Chemical
paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific	28908	Chemical
Pen/Strep 10x	Life Technologies	15140122	Chemical
phosphate-buffered saline	Gibco	10010023	Chemical
Poly-L lysine	Sigma	P2636	Chemical
ProLong Diamond Glass Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36970	Chemical
PSD95	NeuroMab	K28/43	Antibody
Round coverglass	Thermo	12052712	Equiment
SUMO1	Abcam	ab32058	Antibody
Synaptophysin	Merck	S5768	Antibody
Triton X-100	Merck	T8787	Chemical
Trypsin inhibitor	Merck Life Science	T9003-500MG	Chemical