Супер-разрешение изображения для изучения совместной локализации белков и синаптических маркеров в первичных нейронов

Резюме

Этот протокол показывает, как использовать микроскопию супер-разрешения для изучения совместной локализации белка в первичных нейронных культурах.

Аннотация

Синапсы являются функциональными элементами нейронов и их дефекты или потери находятся в основе нескольких нейродегенеративных и неврологических расстройств. Исследования изображений широко используются для исследования их функции и пластичности в физиологических и патологических условиях. Из-за их размера и структуры, локализация исследований белков требуют высокого разрешения методов визуализации. В этом протоколе мы описываем процедуру изучения в первичных нейронах совместной локализации целевых белков с синаптических маркерами на уровне супер-разрешения с использованием структурированной микроскопии освещения (SIM). SIM-карта – это метод освещения с узорным светом, который удваивает пространственное разрешение широкой микроскопии, достигая детализации около 100 нм. Протокол указывает необходимые элементы управления и настройки для надежных исследований совместной локализации и обзор статистических методов для правильного анализа данных изображений.

Введение

Понимание и взгляд на синапсе сильно изменилось с момента его первого описания Фостер и Шеррингтон в 1897^{году 1}. С тех пор наши знания нейрональной коммуникации и молекулярных процессов, стоящих за ней, выросли в геометрической^{прогрессии на 2.} Стало ясно, что синапсы можно рассматривать как двухкомпанейную систему: до синаптический отсек, содержащий пузырьки для высвобождения нейротрансмиттеров и пост-синаптический отсек с рецепторами³. Этот упрощенный взгляд, в последние двадцать лет, превратилась в сложную сеть белков, необходимых для трансдуцирования передатчик связывания в сигнализации⁴.

Достижения в понимании частично из-за супер-разрешение^{методов,}которые преодолели дифракционный предел обычной световой микроскопии в соответствии с^{измерением синапсов лучше 5,6,,7,8,9,10}. Из-за предела дифракции, оптический микроскоп не может достичь разрешения выше 200^{нм с другой стороны 11,12}. Чтобы обойти этот предел, были созданы методы супер-разрешения, используя различные подходы и достигая различных разрешений предела субдифракции: SIM, STED (Стимулированная микроскопия истощения выбросов), PALM (ФотоАктивированная микроскопия локализации) и STORM (Стохастическая оптическая реконструкция микроскопии)^13,14. SIM удваивает пространственное разрешение лазерной широкой полевой микроскопии систем, вставив дифракционную решетку в траекторию возбуждения^{пучка 15}. Подвижная решетка дифрактов лазерных лучей для создания известного шаблона освещения, как правило, полосы. Этот намеренно структурированный световой узор накладывается на неизвестное пространственное распределение флуоресцентного красителя (образца). Интерференционные бахромы, образованные двумя шаблонами, кодируются для неразличимых мелких деталей с обычной широкой микроскопией. Окончательное сверхразрешеное изображение получено путем объединения и расшифровки математическими методами нескольких необработанных изображений одного и того же образца, полученных переводами и вращениями дифракционной решетки. Разрешение сверхпроверенные изображения достигает 100 нм в боковом и 500 нм в осяных направлениях для 2D-SIM¹⁵ или 100 нм в боковом и 250 нм в осяных направлениях для 3D-SIM^16.

Новое понимание синапса является еще более важным в свете многих неврологических расстройств, где синаптическая дисфункция играет важную роль в наступлении и^{прогрессии 17,18}. Болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, болезнь Паркинсона, прионные заболевания, эпилепсия, расстройства аутистического спектра и хрупкий синдром Х среди других были связаны с аномалиями в синаптической композиции,^{морфологии и функции 19,20,21,22}.

Недавно, используя набор SUMO-специфических антител, мы использовали SIM, чтобы показать ко-локализацию в первичных гиппокампа нейронов белков SUMO с до- и пост-синаптических маркеров синаптофизин и PSD95 на уровне^{супер-разрешения 23}. Это позволило нам подтвердить биохимические и конфокальные микроскопии доказательства локализации СУМО в нейронах.

Здесь мы описываем протокол для изучения локализации белков в гиппокампе мыши первичных нейронов. В то же время, этот протокол может быть адаптирован к различным типам первичных нейронных культур.

протокол

1. Начальные культуры

1. Культура мыши гиппокампа первичных нейронов в камерных coverslips (таких, как Ibidi μ-Slide 8 Ну или Nunc Lab-Tek камерный Coverglass), которые соответствуют объективным требованиям для #1,5 (0,17 мм) крышка толщиной.
2. Пальто камерные крышки со 100 йл поли-L-лизина (100 мкг/мл).
3. На следующий день мыть камерные крышки дважды стерильным фосфатно-буферным солевым раствором (PBS).
4. Для получения мыши первичных нейронов, изолировать гиппокампа от P1-P4 щенков²³.
5. Поместите расчлененный гиппокамп в 10 мл dissection Media(таблица 1) и дайте им отпустить в нижней части трубки.
6. Используя стерильную пипетку, тщательно удалите средства вскрытия, оставляя гиппокамп спокойно на дне трубки.
7. Добавьте 10 мл Media 1(таблица 1) в гиппокамп и инкубировать в течение 30 минут при 37 градусов по Цельсию.
8. Используя стерильную пипетку, аккуратно удалите Media 1, оставив гиппокамп спокойно на дне трубки.
9. Добавьте 10 мл Media 2(таблица 1) и оставьте (ограниченную) центрифугу трубку под капотом горизонтально в течение 45 минут.
10. Пусть центрифуга трубки стоять вертикально, чтобы позволить ткани поселиться в нижней части трубки.
11. Используя стерильную пипетку, аккуратно удалите Media 2, оставив гиппокамп нетронутым на дне центрифуги трубки.
12. Добавить 2 мл media 3 ( Таблица1).
13. Используя р1000 пипетку с отфильтрованным кончиком, механически отмежевать клетки от ткани.
14. Перенесите супернатант, в котором расположены изолированные нейроны, в центрифугу 15 мл.
15. Центрифуга клеточной подвески в течение 2 мин при температуре 300 х при комнатной температуре (RT).
16. После центрифугации клетки расположены на дне центрифуги. С помощью стерильной пипетки отбросьте супернатант.
17. Повторное приостановление ячеек в 1 мл Media 4.
18. Используйте 70 мкм фильтр для устранения недисциированных клеток.
19. Подсчитайте жизнеспособные клетки в камере Бюркера, добавив 1 МКЛ из 0,4% трипанового синего раствора до 19 МКЛ клеточной подвески.
20. Клетки плиты на 70.000 клетках/хорошо в томе 200 l в наилучшим образом.
21. Разрешить клеткам прикрепляться в течение 2 ч во влажном инкубаторе при 37 градусах Цельсия и 5% CO_2.
22. Вынул камерные крышки из инкубатора и тщательно замените носитель на 200 МКЛ Культурных Медиа.
23. Оставьте камерные крышки в увлажненные инкубатор при 37 градусов по Цельсию и 5% CO₂.
24. Заменить одну треть среды свежими средствами массовой информации культуры каждые 5-7 дней.
25. Подождите, пока гиппокамп первичных нейронов полностью созрели (12-14 дней после покрытия), чтобы выполнить совместное обучение локализации.

2. Иммунофлуоресценция окрашивания

1. Возьмите камерные крышки из инкубатора.
2. Удалите носитель.
3. Быстро промыть скважины с 200 йл PBS.
4. Добавьте 4% параформальдегид (PFA) в PBS (200 йл/хорошо) к нейронам, чтобы исправить их быстро.
5. Инкубировать клетки в течение 15 минут на RT.
6. Удалите решение PFA.
7. Permeabilize клетки, добавив PBS с 0,2% Тритон X-100 (200 йл / хорошо).
8. Инкубация в течение 1 мин на RT.
9. Удалите раствор и инкубировать образцы с 1% бычьей сыворотки альбумин (BSA) в PBS (200 йл / хорошо) в течение 1 ч на RT пассивно покрыть все свободные связывающие поверхности пластины с неуместным белка для анализа. Блокирующий буфер на основе BSA без Triton X-100 снижает фон антител более эффективно, чем тот же буфер с 0,2% Triton X-100.
10. Удалите решение.
11. Добавьте первичное антитело выбора, разбавленное в растворе PBS, содержащем 1% BSA и 0,2% Triton X-100 (120-200 йл/колодец, в зависимости от разбавления антител и доступности). Инкубировать образцы в течение 2 ч.
    1. В качестве отрицательного контроля, не добавляйте никаких первичных антител к одной из скважин. Одновременно может использоваться несколько антител различных видов против различных целей. Используйте антитела против MAP2 (нейронный маркер), поднятый в курицу, антитела против либо PSD95 или синаптофизин, поднятый в мыши, и антитела против целевого белка, поднятого в кролика. Это позволяет анализировать трехцветную SIM-карту.
12. Быстро промыть скважины три раза с PBS (200 йл / хорошо).
13. Добавьте вторичные антитела (диЛайт и Alexa вторичные антитела могут быть использованы) разбавленные в растворе PBS, содержащем 1% BSA и 0,2% Triton X-100 (200 йл/колодец). Инкубировать образцы в течение 1 ч на RT.
14. Быстро промыть скважины три раза с PBS (200 йл / хорошо).
15. Добавьте краситель Hoechst в концентрации 1 мкг/мл, разбавленный в PBS (200 МКЛ/хорошо), чтобы окрасить ядра. Инкубировать образцы в течение 10 минут на RT.
16. Быстро мыть колодцы дважды с PBS.
17. Намонтировать ячейки с помощью SIM-совместимого крепления. Используйте 10 йл/колодец ProLong Glass Antifade Mountant.
18. Накройте и защитите клетки стеклом (например, круглым стеклом диаметром 8 мм). Квадратные также могут быть использованы.
19. Храните камерные крышки на RT и ждать по крайней мере 48 ч, прежде чем приобретать изображения. Diamond Glass требует по крайней мере два дня лечения до приобретения супер-разрешения.

3. Контроль специфичности антител

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте две стратегии, чтобы обеспечить специфичность антител. Первая стратегия заключается в использовании по крайней мере двух различных антител, нацеленных на один и тот же субстрат. Второй стратегией является нейтрализация антител путем инкубации с целью очищенного белка или эпитопа, используемого для повышения антител.

1. Инкубировать антитела выбора с пяти раз превышает рекомбинантной цели или эпитоп для 1 ч на RT в 1% BSA в PBS.
2. После инкубации используйте нейтрализованные антитела при обычной концентрации для окрашивания, как описано выше, с 2.11.

4. Калибровка микроскопа

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы регулярно используем N-SIM Super-Resolution Микроскоп системы производства Nikon для супер-разрешения исследований. Тем не менее, некоторые другие компании также предлагают супер-разрешение микроскопов в своих каталогах. Хотя конкретные указания для системы N-SIM nikon описаны, инструкции, которые следуют, могут быть обобщены другим системам. Перед приобретением SIM-изображений система требует надлежащей калибровки с определенными флуоресцентными бусинками подпоколения. Примером могут быть микросферы TetraSpeck. Эти бусы окрашены различными флуоресцентными красителями, чтобы позволить калибровку различных лазеров с одним образцом.

1. В водяной бане sonicate около 1,8 х 10^{8 флуоресцентных} микросфер в течение 10 минут. Система N-SIM компании Nikon требует малонаселенного образца разноцветных бусин для калибровки. Это может отличаться для других систем, которые требуют плотного одного слоя суб-разрешение размера флуоресцентных бусин. Соответствующим образом отрегулируйте количество флуоресцентных частиц.
2. Разбавить флуоресцентные микросферы 1:500 в двойной дистиллированной воде.
3. Sonicate второй раз в течение дополнительных 10 минут.
4. Пипетки 15 йл разбавленных бусин в колодец камерной крышки.
5. Дайте раствору высохнуть в течение 5 минут на RT.
6. Добавьте 10 мкл монтажного раствора и поместите сверху 8-мм крышку.
7. Подождите, по крайней мере 48 часов, чтобы надлежащее лечение.
8. Включите микроскоп и лазеры.
9. Пусть система прогреется, чтобы достичь теплового равновесия всех компонентов микроскопа. Микроскопная система N-SIM Super-Resolution требует не менее 3 часов.
10. Выберите цель 100x.
11. Начните калибровку путем выравнивания лазеров к центру блока решетки дифракции. В системе N-SIM микрометровая ручка и специальная камера позволяют центрирование световых лучей к цели.
12. Вставьте камерный крышки в микроскоп для просмотра. Установите систему на толщину камерного покрытия, регулируя воротник объективной коррекции. Программное обеспечение NIS, несвободное программное обеспечение, предоставляемое системами N-SIM Super-Resolution Microscope, имеет автоматическую функцию регулирования коррекционных воротников.
13. Отрегулируйте фокус блока решетки для каждого канала для того чтобы обеспечить сфокусированное структурированное освещение картины на образце. Программное обеспечение NIS обеспечивает автоматическую функцию для этой задачи.
14. Далее приобрету необработанные 3D-SIM изображения многоцветных микросфер. Реконструкция необработанных изображений для получения супер-решенного изображения с помощью программного обеспечения микроскопа или программной платформы с открытым исходным кодом для анализа биологических изображений ImageJ²⁴ и плагина fairSIM²⁵.
15. Рассчитайте, для каждой отделенной длины волны, Преобразование Фурье супер-решенного изображения, полученного в 4.14. Если преобразованное изображение не может получить правильный цветок, как шаблон, перезапустить калибровку от 4.11, так как супер-разрешение не было достигнуто.
16. На супер-решенном изображении выберите единую микросферу и вычислите ее профиль интенсивности для каждого канала для измерения достигнутого разрешения. Теперь она должна быть близка к 100 нм с боковой стороны.
17. Далее выполните регистрацию канала, наложить многоканальный приобретение микросфер. Цель состоит в том, чтобы коллиматировать все сигналы канала с боковой и аксиально. Это позволит устранить хроматические аберрации из-за несогласованности различных каналов и поможет анализу совместной локализации.
18. Подтвердите качество калибровки с помощью функций "Шаги фазы освещения" и "Фокус освещения шаблона" SIMcheck²⁶, набор плагинов для приложения с открытым исходным кодом ImageJ. С этой целью подготовьте камерную крышку, чтобы получить плотный один слой микросфер TetraSpeck и получить 3D-SIM изображение образца. Проанализируйте изображение в ImageJ и, если обнаружены аберрации, перезапустите калибровку микроскопа с шага 4.11.

5. Приобретение

1. Начните анализировать образец с помощью 40-х целей в конфокальном или широкоугольном режиме. Это позволяет навигации по образцу, сохраняя хорошие детали и большое поле зрения.
2. Используйте сигнал антител MAP2 для определения области, представляющей нейронные процессы.
3. Приобретайте изображения образца в конфокальцном режиме, чтобы определить качество окрашивания. Низкое конфокальные качества будут отражаться в плохом качестве SIM-карты, поэтому требуется отказаться от образцов.
4. Если область и качество изображения являются удовлетворительными, переключитесь на цель в 100 раз.
5. Нанесите масло на цель 100x.
6. Приобрети широкое поле или конфокальные изображения, которые будут использоваться позже для оценки качества супер-разрешенного изображения(рисунок 1A,B).
7. Переключитесь в режим 3D-SIM.
8. Используя диалоговые окна для настройки параметров для приобретения, выберите самый высокий бит-глубокий параметр, доступный для максимизации информации о цвете. Как правило, 16-битный является стандартным выбором. Кроме того, чтобы улучшить соотношение сигнала к шуму, выберите низкочастотное значение для приобретения, например 1 МГц.
9. Используя гистограммы окна, установить лазеры власти для получения линейной реакции сигнала. Чтобы избежать потери информации, ограничьте насыщенные пиксели на изображениях. Система N-SIM использует камеру Andor iXon3. При работе на 16-битной, выбрать целевую интенсивность 16000 для обеспечения линейной реакции камеры. Кроме того, выберите диапазон от 30 000 до 45 000, чтобы максимизировать динамический диапазон приобретения.
10. Установите мощность лазера от 0,1% до 50% при визуализации образцов и времени экспозиции от 50 мс до 2 с. Лазерные силы выше 50% могут вызвать быстрое фотоотлив флюорофоров в использовании.
11. Начните приобретать изображения в режиме 3D-SIM.
12. Используйте SIMcheck, набор бесплатных плагинов для ImageJ, чтобы оценить качество приобретения необработанных изображений.
13. Если SIMCheck не обнаруживает никаких артефактов или проблем с качеством, приобрети как минимум 10 изображений из 4 технических репликаций, чтобы позволить статистический анализ.

6. Пост-продукция: реконструкция изображения

ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-SIM приобретенные изображения являются необработанными изображениями, которые должны быть обработаны для получения реконструированных изображений с супер-разрешением. Неправильная реконструкция необработанных изображений может привести к артефактам, которые повлияют на анализ образцов. Поэтому большое внимание следует уделить правильному выбору параметров реконструкции.

1. Обработка необработанных изображений с помощью программного обеспечения для анализа реконструкции микроскопа для получения сверхобучтеемогоизображения (рисунок 1C). Кроме того, используйте свободно доступный плагин ImageJ fairSIM для восстановления необработанных изображений.
2. Рассчитайте преобразование Fourier супер-решенных изображений с помощью программного обеспечения для реконструкции микроскопа или плагина ImageJ SIMCheck. Хорошее реконструированное изображение должно вернуть для каждого канала изображение, похожее на цветок. Если реконструированные изображения не воссоздают форму, похожую на цветок, перезапустите необработанные изображения и реконструируете их, изменив параметры реконструкции, такие как фильтрация Винера, аподизация и подавление^{нулевого порядка 27}. В программном обеспечении NIS, используя предварительный просмотр для мониторинга того, как изменение параметров влияет на окончательное разрешение изображения, изменить параметры i) Контраст модуляции освещения, ii) подавление шума высокого разрешения и iii) Из фокуса подавления.
3. Затем проанализируйте реконструированное изображение, чтобы объективно обнаружить артефакты с помощью NanoJ-SQUIRREL²⁸, плагина на основе ImageJ для оценки качества сверхразображенных изображений.
4. Если NanoJ-SQUIRREL обнаруживает артефакты, перезапустите необработанные изображения и реконструируете их, изменив параметры реконструкции, такие как фильтрация Винера, аподизация и подавление нулевого порядка. В программном обеспечении NIS, используя предварительный просмотр для мониторинга того, как изменение параметров влияет на окончательное разрешение изображения, изменить параметры модуляции освещения Контраст, подавление шума высокого разрешения и из фокуса подавления.
5. Используйте сверхпровереные изображения для расчета профиля совместной локализации и/или коэффициентов Пирсона и Мандера.

7. Ко-локализация с анализом профиля

ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве первого шага к изучению совместной локализации между синаптических маркеров и белка интереса, принять супер-разрешенное изображение и проанализировать один локус для определения перекрытия сигнала.

1. Определите один локус на супер-решенное изображение.
2. Получить интенсивности профилей флуоресцентных сигналов локуса интереса.
3. Экспорт данных.
4. Используйте GraphPad Prism, или аналогичное программное обеспечение для анализа, чтобы нормализовать все пики сигнала и получить сопоставимую интенсивность сигнала для каждого канала с конечной целью определения локуса конкретной совместной локализации.

8. Количественная оценка коэффициентов Пирсона и Мандера

ПРИМЕЧАНИЕ: Если анализ профиля предложил один локус совместной локализации, более общий анализ всего изображения может быть проведен путем расчета коэффициентов Пирсона и^{Мандера 29,30}.

1. Используйте JACoP³¹, плагин ImageJ, чтобы определить два параметра совместной локализации: Pearson's и Mander's.

9. Статистический анализ

1. Используйте GraphPad Prism или аналогичное программное обеспечение для анализа и графикирования для обработки данных, собранных с помощью JACoP.
2. Используйте не менее 40 SIM-изображений для каждого анализируемого состояния для получения графиков и статистической значимости.

Результаты

Мы представляем здесь стандартный рабочий процесс для изучения совместной локализации нейрональных белков. Сначала мы откалибровали микроскоп, а затем провели SIM-анализ образцов. Для калибровки системы мы использовали флуоресцентные микросферы диаметром 0,1 мкм. После получения супер...

Обсуждение

Выяснение структуры и состава синапса имеет решающее значение для понимания физиологических и патологических процессов, которые регулируют память и познание. В то время как в нормальном состоянии, синапсы являются строительными блоками памяти, они также лежат в основе сложных неврол?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue solution	Thermo Fisher Scientific	15250061	Chemical
70 µm filter	Corning	352350	Equiment
Alexa	Thermo Fisher Scientific	-	Antibody
Antibody SENP1	Santa Cruz	sc-271360	Antibody
B27 Supplement	Life Technologies	17504044	Chemical
Bovine serum albumin	Merck	5470	Chemical
CaCl2	Merck Life Science	21115	Chemical
Chambered coverslips	Ibidi	80826	Equiment
DyLight	Thermo Fisher Scientific	-	Antibody
FBS (Hyclone)	GIBCO	SH3007002 (CHA1111L)	Serum
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent	Thermo Fisher Scientific	F8803	Equiment
Glucose	Merck Life Science	G8769	Chemical
Glutamax	GIBCO	35050061	Chemical
HEPES	Merck Life Science	H3537	Chemical
L-Cystein	Merck Life Science	C6852-25g	Chemical
MAP2	Merck	AB15452	Antibody
MEM	Life Technologies	21575022	Medium
MgCl	Merck Life Science	M8266	Chemical
NaOH	VWR International	1,091,371,000	Chemical
Neurobasal A	Life Technologies	10888022	Medium
N-SIM Super Resolution Microscope	Nikon	-	Instrument
Papain	Merck Life Science	P-3125	Chemical
paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific	28908	Chemical
Pen/Strep 10x	Life Technologies	15140122	Chemical
phosphate-buffered saline	Gibco	10010023	Chemical
Poly-L lysine	Sigma	P2636	Chemical
ProLong Diamond Glass Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36970	Chemical
PSD95	NeuroMab	K28/43	Antibody
Round coverglass	Thermo	12052712	Equiment
SUMO1	Abcam	ab32058	Antibody
Synaptophysin	Merck	S5768	Antibody
Triton X-100	Merck	T8787	Chemical
Trypsin inhibitor	Merck Life Science	T9003-500MG	Chemical