Primer Nöronlarda Proteinlerin ve Sinaptik Belirteçlerin Eş Lokalizasyonunun İncelenmesinde Süper Çözünürlüklü Görüntüleme

Özet

Bu protokol, primer nöronal kültürlerde protein ko-lokalizasyonunu incelemek için süper çözünürlüklü mikroskopinin nasıl yapılacağını göstermektedir.

Özet

Sinapslar nöronların fonksiyonel elemanları dır ve bunların kusurları veya kayıpları çeşitli nörodejeneratif ve nörolojik bozuklukların temelinde dir. Görüntüleme çalışmaları fizyolojik ve patolojik koşullarda işlevlerini ve plastisitesini araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Büyüklükleri ve yapıları nedeniyle proteinlerin lokalizasyon çalışmaları yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleri gerektirir. Bu protokolde, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) kullanılarak süper çözünürlük düzeyinde sinaptik belirteçlerle hedef proteinlerin birlikte lokalizasyonu nun primer nöronlarda incelenmesi için bir prosedür tanımlıyoruz. SIM, geniş alan mikroskopisinin uzamsal çözünürlüğünü iki katına çıkararak yaklaşık 100 nm'lik bir detaya ulaşan desenli ışık aydınlatma tekniğidir. Protokol, sağlam eş yerelleştirme çalışmaları için gerekli denetimleri ve ayarları ve görüntüleme verilerini doğru analiz etmek için istatistiksel yöntemlere genel bakışı gösterir.

Giriş

Anlayış ve sinaps görünümü 1897¹Yılında Foster ve Sherrington tarafından ilk açıklamasından bu yana büyük ölçüde değişti. O zamandan beri, nöronal iletişim bilgimiz ve arkasındaki moleküler süreçler katlanarak 2^büyüdü. Bu sinapslar iki bölmeli bir sistem olarak düşünülebilir açık hale gelmiştir: nörotransmitterlerin salınımı için veziküller içeren bir pre-sinaptik bölmesi ve reseptörleri ile post-sinaptik bölmesi³. Bu basit görüş, son yirmi yıl içinde, sinyal^{izasyon 4}içine bağlayıcı transduce için gerekli proteinlerin karmaşık bir ağ haline gelmiştir.

Anlayış kazanımları kısmen sinapsların boyutuna uygun geleneksel ışık mikroskobu kırınım sınırını aştı süper çözünürlük teknikleri nedeniyle daha iyi^5,6,7,8,9,10. Kırınım sınırı nedeniyle, optik mikroskop yanal olarak 200 nm üzerinde bir çözünürlüğe ulaşamaz^11,12. Bu sınırı atlamak için, farklı yaklaşımlar kullanılarak ve farklı alt kırınım sınır kararlarına ulaşan süper çözünürlük teknikleri oluşturuldu: SIM, STED (Uyarılmış Emisyon Tükenmesi Mikroskopisi), PALM (FotoAktislokalizasyon Mikroskopisi) ve STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)^13,14. SIM uyarma ışını yolu¹⁵içine bir kırınım ızgara ekleyerek lazer tabanlı geniş alan mikroskobu sistemlerinin mekansal çözünürlüğü iki katına çıkar. Hareketli ızgara, lazer ışınlarını difüzörlererek bilinen bir aydınlatma deseni oluşturur, genellikle çizgiler. Bu amaçla yapılandırılmış ışık deseni floresan boyanın (numunenin) bilinmeyen mekansal dağılımına yerleştirilir. İki modelin oluşturduğu girişim saçaklar, normal geniş alan mikroskobu yla ayırt edilemeyen ince ayrıntıları kodlar. Son süper çözümlü görüntü, kırınım ızgarasının çevirileri ve rotasyonları ile elde edilen aynı örneğin birkaç ham görüntüsünün matematiksel yöntemlerle birleştirilmesi ve kodlanması ile elde edilir. Süper çözülmüş görüntülerin çözünürlüğü lateral de 100 nm ve eksenel yönlerde 500 nm'ye ulaşır 2D-SIM¹⁵ veya 100 nm lateral de xeksensel yönlerde 3D-SIM^16.

Sinaps yeni anlayış sinaptik disfonksiyon başlangıçlı ve ilerleme önemli bir rol oynar birçok nörolojik bozukluklar ışığında daha da önemlidir^17,18. Alzheimer hastalığı, Down sendromu, Parkinson hastalığı, prion hastalıkları, epilepsi, otizm spektrum bozuklukları ve diğerleri arasında kırılgan X sendromu sinaptik kompozisyon anormallikleri ile bağlantılı olmuştur, morfoloji ve fonksiyon^19,20,21,22.

Son zamanlarda, SUMO özgü antikorlar bir dizi kullanarak, biz süper çözünürlük düzeyinde pre-ve post-sinaptik belirteçleri sinapofiz ve PSD95 ile SUMO proteinlerinin primer hipokampal nöronlarda co-lokalizasyon göstermek için SIM kullanılır²³. Bu, nöronlarda SUMO lokalizasyonuna dair biyokimyasal ve konfokal mikroskopi kanıtlarını doğrulamamızı sağladı.

Burada, fare hipokampal primer nöronlarda proteinlerin lokalizasyonunu inceleyen bir protokol uyguluyoruz. Aynı zamanda, bu protokol birincil nöronal kültürlerin farklı adapte edilebilir.

Protokol

1. Birincil kültürler

1. #1.5 (0.17 mm) kapak kalınlığı için objektif gereksinime uyan odalı kapaklı dudaklarda (Ibidi μ-Slide 8 Kuyu veya Nunc Lab-Tek Odalı Coverglass gibi) kültür faresi hipokampal primer nöronlar.
2. 100 μL poli-L-lizin (100 μg/mL) ile paltolu kapaklar.
3. Ertesi gün, steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez odalı kapakları yıkayın.
4. Fare birincil nöronlar elde etmek için, P1-P4^yavru23gelen hipokampi izole .
5. Diseksiyon Media(Tablo 1)10 mL diseksiyon hipokampi yerleştirin ve onları tüpün altına yatırın.
6. Steril bir pipet kullanarak, dikkatle Diseksiyon Medya kaldırmak, tüp altında hipokampi rahatsız bırakarak.
7. Hippocampi'ye 10 mL Medya(Tablo 1)ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
8. Steril bir pipet kullanarak, dikkatli bir şekilde Medya 1 kaldırmak, tüp altında hipokampi rahatsız bırakarak.
9. 10 mL Media 2(Tablo 1)ekleyin ve (kapaklı) santrifüj tüpünü kaputun altında yatay olarak 45 dakika bekletin.
10. Santrifüj tüpün dikey olarak durmasını bekleyin ve dokunun tüpün dibine yerleşmesini bekleyin.
11. Steril bir pipet kullanarak Media 2'yi dikkatlice çıkarın ve hipokampiyi santrifüj tüpünün altında rahatsız edilmeden bırakarak.
12. 2 mL Ortam 3(Tablo 1) ekleyin.
13. Filtrelenmiş uçlu bir p1000 pipet kullanarak hücreleri dokudan mekanik olarak ayırın.
14. İzole nöronların bulunduğu süpernatantı 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.
15. Hücre süspansiyonuna oda sıcaklığında 300 x g'da (RT) 2 dk santrifüj edin.
16. Santrifüjden sonra hücreler santrifüj tüpünün alt kısmında yer alır. Steril bir pipet kullanarak supernatant atın.
17. Media 4'ün 1 mL'inde hücreleri yeniden askıya alın.
18. Çözünmemiş hücreleri ortadan kaldırmak için 70 μm filtre kullanın.
19. Hücre süspansiyonunun 19 μL'sine %0,4 Trypan mavisi çözeltinin 1 μL'sini ekleyerek Bürker odasındaki canlı hücreleri sayın.
20. 70.000 hücre/kuyudaki plaka hücreleri kuyu başına 200 μL hacimdedir.
21. Hücrelerin 37 °C ve %5 CO 2'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 2 saat boyunca_{bağlanmasına}izin verin.
22. Odacıklı kapakları kuvözden alın ve ortamı 200 μL Kültür Medya ile dikkatlice değiştirin.
23. Odacıklı kapakları 37 °C ve %5 CO_2'denemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde bırakın.
24. Her 5-7 günde bir ortamın üçte birini taze kültür medyası ile değiştirin.
25. Hipokampal primer nöronlar tamamen olgunlaşmış kadar bekleyin (12-14 gün kaplama sonra) co-lokalizasyon çalışmaları gerçekleştirmek için.

2. İmmünofluoresans boyama

1. Kuvözdeki odacıklı kapakları alın.
2. Ortamı çıkarın.
3. Kuyuları 200 μL PBS ile hızlıca yıkayın.
4. PBS'de (200 μL/well) nöronlara hızlı bir şekilde düzeltmek için %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin.
5. HÜCRELERI 15 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
6. PFA çözümlerini çıkarın.
7. % 0.2 Triton X-100 (200 μL/ iyi) ile PBS ekleyerek hücreleri permeabilize.
8. RT'de 1 dakika kuluçka.
9. Çözeltiyi çıkarın ve numuneleri PBS'de %1 büyükbaş serum albumini (BSA) ile (200 μL/iyi) 1 saat boyunca RT'de analiz için alakasız bir proteinle plakanın tüm serbest bağlayıcı yüzeylerini pasif olarak kaplayın. Triton X-100 olmadan BSA tabanlı engelleme tamponu, %0,2 Triton X-100 ile aynı tampondan daha verimli bir şekilde antikor arka planını azaltır.
10. Çözümü çıkarın.
11. %1 BSA ve %0.2 Triton X-100 içeren bir PBS çözeltisinde seyreltilmiş birincil antikor (antikor seyreltmesi ve kullanılabilirliğine bağlı olarak 120-200 μL/kuyu) ekleyin. Örnekleri 2 saat kuluçkaya yatırın.
    1. Negatif kontrol olarak, kuyulardan birine herhangi bir birincil antikor eklemeyin. Farklı hedeflere karşı farklı türlerin birden fazla antikorları aynı anda kullanılabilir. TAVUKTA YÜKSELTİlEN MAP2 (nöronal belirteç) karşı bir antikor, farede yetiştirilen PSD95 veya sinaptophysin'e karşı bir antikor ve tavşanda yetiştirilen bir hedef proteine karşı bir antikor kullanın. Bu, üç renkli SIM analizleri sağlar.
12. Kuyuları PBS (200 μL/iyi) ile üç kez hızlıca yıkayın.
13. %1 BSA ve %0,2 Triton X-100 (200 μL/well) içeren bir PBS çözeltisinde seyreltilmiş ikincil antikorlar (dyLight ve Alexa sekonder antikorlar kullanılabilir). Rt'de 1 saat boyunca örnekleri kuluçkaya yatırın.
14. Kuyuları PBS (200 μL/iyi) ile üç kez hızlıca yıkayın.
15. Çekirdekleri lekelemek için PBS'de (200 μL/iyi) seyreltilmiş 1 μg/mL konsantrasyonda Hoechst boyaekleyin. Rt'de 10 dakika boyunca örnekleri kuluçkaya yatırın.
16. PBS ile kuyuları iki kez hızlıca yıkayın.
17. SIM uyumlu bir montaj antonu kullanarak hücreleri monte edin. 10 μL/well prolong cam antifade mountant kullanın.
18. Hücreleri bir kapak camı (örn. 8 mm çapında yuvarlak bir kapak lı cam) ile kaplayın ve koruyun. Kare olanlar da kullanılabilir.
19. Odacıklı kapakları RT'de saklayın ve görüntü almadan önce en az 48 saat bekleyin. Diamond Glass süper çözünürlüklü satın almadan önce en az iki gün kür gerektirir.

3. Antikor özgüllük kontrolü

NOT: Antikor özgüllüğünü sağlamak için iki strateji kullanın. İlk strateji, aynı substratı hedefleyen en az iki farklı antikor kullanmaktır. İkinci strateji saflaştırılmış protein hedefi veya antikor yükseltmek için kullanılan epitop ile kuluçka ile antikor nötralizasyon olduğunu.

1. PBS'de %1 BSA'da 1 saat boyunca rekombinant hedef veya epitopun beş kat fazlasıyla tercih edilen antikora inkübün.
2. Kuluçkadan sonra, yukarıda açıklandığı gibi 2.11 boyama için her zamanki konsantrasyonda nötralize antikor kullanın.

4. Mikroskop kalibrasyonu

NOT: Nikon tarafından üretilen n-sim süper çözünürlüklü mikroskop sistemini süper çözünürlüklü çalışmalar için rutin olarak kullanıyoruz. Ancak, diğer birçok şirket de kendi kataloglarında süper çözünürlüklü mikroskoplar sunuyoruz. Nikon'un N-SIM sistemi için özel endikasyonlar açıklansa da, takip eden talimatlar diğer sistemlere genellenebilir. SIM görüntülerin edinilmesinden önce, sistem belirli alt çözünürlüklü boyutta floresan boncuklar ile uygun bir kalibrasyon gerektirir. Buna bir örnek TetraSpeck mikroküreleridir. Bu boncuklar farklı floresan boyalar ile tek bir örnek ile farklı lazerlerin kalibrasyonu sağlamak için boyanmıştır.

1. Bir su banyosu nda 10 dakika boyunca 1.8 x 10⁸ floresan mikrosferler civarında sonicate. Nikon'un N-SIM sistemi kalibrasyon için seyrek nüfuslu çok renkli boncuk örneği gerektirir. Bu alt çözünürlük boyutu floresan boncuk yoğun bir tek katman gerektiren diğer sistemler için farklı olabilir. Floresan partiküllerin sayısını buna göre ayarlayın.
2. Floresan mikrosferleri 1:500'ü çift distile suda seyreltin.
3. Ek bir 10 dakika için ikinci kez Sonicate.
4. Pipet 15 l sulandırılmış boncuklar odalı bir kapak bir kuyuiçine.
5. Çözeltinin RT'de 5 dakika kurutulmasına izin verin.
6. Montaj çözeltisinin 10 μL'sini ekleyin ve üzerine 8 mm'lik bir kapak kaydırın.
7. Uygun kür izin vermek için en az 48 saat bekleyin.
8. Mikroskobu ve lazerleri açın.
9. Tüm mikroskop bileşenlerinin termal dengesine ulaşmak için sistemin ısınmasına izin verin. N-SIM Süper Çözünürlüklü Mikroskop Sistemi en az 3 saat sürer.
10. 100x hedefini seçin.
11. Lazerleri kırınım ızgara bloğunun ortasına hizalayarak kalibrasyonu başlatın. N-SIM sisteminde, bir mikrometre knob ve özel bir kamera, ışık demetlerinin hedefe ortalanmasına olanak sağlar.
12. Görüntülemek için odacıklı kapak fişini mikroskopa yerleştirin. Objektif düzeltme yakasını ayarlayarak sistemi odalı kapak kalınlığına ayarlayın. N-SIM Süper Çözünürlüklü Mikroskop sistemleri ile sağlanan tescilli yazılım Olan NIS yazılımı, düzeltme yakalarını düzenlemek için otomatik bir fonksiyona sahiptir.
13. Numune üzerinde odaklanmış yapılandırılmış desen aydınlatması sağlamak için her kanal için ızgara bloğu odağı ayarlayın. NIS yazılımı bu görev için otomatik bir işlev sağlar.
14. Ardından, çok renkli mikrokürelerin ham 3D-SIM görüntülerini edinin. Biyolojik görüntülerin analizi için mikroskop yazılımı veya açık kaynak yazılım platformu kullanarak süper çözümlü görüntü elde etmek için ham görüntüleri yeniden oluşturmak ImageJ²⁴ ve eklenti fairSIM²⁵.
15. Her ayrılmış dalga boyu için 4,14'te elde edilen süper çözümlü görüntünün Fourier dönüşümünü hesaplayın. Dönüştürülen görüntü doğru çiçek benzeri bir desen elde edemezse, süper çözünürlük elde edilemediğinden kalibrasyonu 4,11'den yeniden başlatın.
16. Süper çözümlü görüntüde, elde edilen çözünürlüğü ölçmek için tek bir mikrosfer seçin ve her kanal için yoğunluk profilini hesaplayın. Şimdi yanal olarak 100 nm yakın olmalıdır.
17. Ardından, mikrokürelerin çok kanallı bir edinimi kaplayarak kanal kaydı gerçekleştirin. Amaç, tüm kanal sinyallerini yanal ve eksenli olarak harmanlamaktır. Bu, farklı kanalların yanlış hizalanması nedeniyle renk sapmalarını ortadan kaldırır ve birlikte yerelleştirme analizine yardımcı olur.
18. Açık kaynak uygulaması ImageJ için bir eklenti paketi olan SIMcheck^26'nın"Aydınlatma Faz Adımları" ve "Aydınlatma Desen Odağı" işlevlerini kullanarak kalibrasyon kalitesini onaylayın. Bu amaçla, yoğun bir TetraSpeck mikroküre tabakası elde etmek ve numunenin 3D SIM görüntüsünü elde etmek için odacıklı bir kapak fişi hazırlayın. ImageJ'deki görüntüyü analiz edin ve sapmalar tespit edilirse, 4.11 adımdan mikroskop kalibrasyonünü yeniden başlatın.

5. Satın alma

1. Confocal veya widefield modunda 40x hedefi kullanarak örnek analiz başlayın. Bu, iyi ayrıntıları ve geniş bir görüş alanı koruyarak, örnek navigasyon sağlar.
2. Nöronal süreçleri temsil eden bir alanı belirlemek için MAP2 antikor sinyalini kullanın.
3. Boyama kalitesini belirlemek için numunenin konfokal modda görüntülerini edinin. Düşük konfokal kalite, düşük SIM kalitesini yansıtacak, bu nedenle numunelerin atılmasını gerektirecektir.
4. Görüntülerin alanı ve kalitesi tatmin ediciyse, hedefi 100x'e geçin.
5. 100x hedefine yağ uygulayın.
6. Süper çözümlenmiş görüntünün kalitesini değerlendirmek için daha sonra kullanılacak geniş alan veya konfokal görüntü elde edin (Şekil 1A,B).
7. 3D-SIM moduna geçin.
8. Edinme parametrelerini ayarlamak için iletişim pencerelerini kullanarak, renk bilgilerini en üst düzeye çıkarmak için kullanılabilen en yüksek bit derinliği ayarını seçin. Genellikle, 16-bit standart seçimdir. Ayrıca, sinyal-gürültü oranını artırmak için, 1 MHz gibi satın alma için düşük frekans değeri seçin.
9. Histogram pencereleri kullanarak, sinyal doğrusal bir yanıt elde etmek için lazerler güç ayarlayın. Bilgi kaybını önlemek için görüntülerdeki doymuş pikselleri sınırlayın. N-SIM sistemi Andor iXon3 kamera kullanır. 16 bit'te çalışırken, kameranın doğrusal tepkisini sağlamak için 16.000 hedef yoğunluğu seçin. Alternatif olarak, satın alma dinamik aralığını en üst düzeye çıkarmak için 30.000-45.000 arasında bir aralık seçin.
10. Numuneleri görüntülerken %0,1 ile %50 arasında lazer gücü ve 50 ms ile 2 s arasında maruz kalma süreleri ayarlayın. %50'nin üzerindeki lazer güçleri, kullanımdaki floroforların hızlı fotobeyazrlanmasına neden olabilir.
11. Görüntüleri 3D-SIM modunda edinmeye başlayın.
12. Raw görüntülerin edinim kalitesini değerlendirmek için ImageJ için ücretsiz eklentipaketi olan SIMcheck'i kullanın.
13. SIMCheck herhangi bir yapı veya kalite sorunu algılamazsa, istatistiksel analize izin vermek için 4 teknik kopyadan en az 10 görüntü elde edin.

6. Post-prodüksiyon: görüntü rekonstrüksiyonu

NOT: 3D-SIM edinilmiş görüntüler, yeniden oluşturulmuş süper çözümlü görüntüleri elde etmek için işlenmesi gereken ham görüntülerdir. Ham görüntülerin yanlış yeniden yapılandırılması, örneklerin analizini etkileyecek yapılara yol açabilir. Bu nedenle rekonstrüksiyon parametrelerinin doğru şekilde seçilmesi için büyük dikkat edilmelidir.

1. Süper çözümlenmiş bir görüntü elde etmek için mikroskop rekonstrüksiyon analiz yazılımını kullanarak ham görüntüleri işleyin(Şekil 1C). Alternatif olarak, ham görüntüleri yeniden oluşturmak için serbestçe kullanılabilir ImageJ eklentifairSIM kullanın.
2. Mikroskop rekonstrüksiyon yazılımı veya ImageJ eklentisi SIMCheck kullanarak süper çözülmüş görüntülerin Fourier dönüşümünü hesaplayın. İyi bir yeniden oluşturulmuş görüntü, her kanal için, bir çiçek gibi görüntü dönmek gerekir. Yeniden yapılandırıladaki görüntüler çiçek benzeri bir şekli yeniden oluşturamazsa, ham görüntülerden yeniden başlatın ve Wiener filtreleme, apodization ve sıfır sıra bastırma²⁷gibi yeniden yapılandırma parametrelerini değiştirerek yeniden oluşturun. NIS yazılımında, parametrelerin değiştirilmesinin son çözülmüş görüntüyü nasıl etkilediğini izlemek için önizlemeyi kullanarak, parametreleri değiştirmek i) Aydınlatma Modülasyon Kontrastı, ii) Yüksek Çözünürlüklü Gürültü Bastırma ve iii) Odak Dışı Bastırma.
3. Daha sonra, nanoj-SQUIRREL²⁸kullanarak tarafsız bir şekilde eserler tespit etmek için yeniden oluşturulmuş görüntü analiz , süper çözülmüş görüntülerin kalitesini değerlendirmek için bir ImageJ tabanlı eklenti.
4. NanoJ-SINCAP yapıları algılarsa, ham görüntülerden yeniden başlatın ve Wiener filtreleme, apodizasyon ve sıfır sıra bastırma gibi yeniden yapılandırma parametrelerini değiştirerek yeniden yapılandırın. NIS yazılımında, parametrelerin değiştirilmesinin son çözümlenmiş görüntüyü nasıl etkilediğini izlemek için önizlemeyi kullanarak, Aydınlatma Modülasyon Kontrastı, Yüksek Çözünürlüklü Gürültü Bastırma ve Odak Dışı Bastırma parametrelerini değiştirin.
5. Ortak yerelleştirme profilini ve/veya Pearson ve Mander'in katsayılarını hesaplamak için süper çözümlenmiş görüntüleri kullanın.

7. Profil analizi ile birlikte yerelleştirme

NOT: Sinaptik belirteçler ve ilgi çekici bir protein arasındaki birlikte lokalizasyonu incelemek için ilk adım olarak, süper çözümlenmiş bir görüntü alın ve sinyal çakışmasını belirlemek için tek bir lokusu analiz edin.

1. Süper çözümlenmiş görüntüde tek bir locus tanımlayın.
2. İlgi çekirgelerinin floresan sinyallerinin yoğunluk profillerini elde edin.
3. Verileri dışa aktarın.
4. Tüm sinyal tepelerini normalleştirmek ve locus'a özgü eş yerelleştirmeyi belirlemek amacıyla her kanal için karşılaştırılabilir sinyal yoğunlukları elde etmek için GraphPad Prizma veya benzer bir analiz yazılımı kullanın.

8. Pearson ve Mander katsayıları quantification

NOT: Profil analizi tek lokus eş lokalizasyonu önermişse, Pearson ve Mander'in katsayıları^29,30hesaplanarak tüm resmin daha genel bir analizi yapılabilir.

1. Co-localizasyon iki parametre: Pearson ve Mander's: belirlemek için JACoP³¹kullanın , bir ImageJ eklentisi.

9. İstatistiksel analiz

1. JACoP ile toplanan verileri işlemek için GraphPad Prizma'yı veya benzer bir analiz ve grafik yazılımLarını kullanın.
2. Grafikleri elde etmek ve istatistiksel alaka düzeyi için analiz edilen her durum için en az 40 SIM görüntü kullanın.

Sonuçlar

Burada nöronal proteinlerin eş lokalizasyonunu incelemek için standart iş akışını sıyoruz. Önce mikroskobu kalibre ettik ve ardından numunelerin SIM analizini yaptık. Sistemi kalibre etmek için 0,1 m çapında floresan mikroküreler kullandık. Boncukların süper çözümlü 3D-SIM görüntüleri elde edildikten sonra, temel deki görüntü verileri, bunları uzamsal frekans gösterimine dönüştürmek için Fourier dönüştürülmüştür. Şekil 2A'da,farklı çiçek deseni...

Tartışmalar

Sinapsın yapısını ve bileşimini açıklamak, hafıza ve bilişi düzenleyen fizyolojik ve patolojik süreçlerin anlaşılması için çok önemlidir. Normal durumda iken, sinapsbellek yapı taşları dır, onlar da Alzheimer hastalığı gibi karmaşık nörolojik bozukluklar altında yatan³². Burada açıklanan protokol sim adı verilen bir süper çözünürlüklü mikroskopi tekniği ile nöronal proteinlerin birlikte lokalizasyonu çalışma için hizmet vermektedir. Sim, belirli bir ayd...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue solution	Thermo Fisher Scientific	15250061	Chemical
70 µm filter	Corning	352350	Equiment
Alexa	Thermo Fisher Scientific	-	Antibody
Antibody SENP1	Santa Cruz	sc-271360	Antibody
B27 Supplement	Life Technologies	17504044	Chemical
Bovine serum albumin	Merck	5470	Chemical
CaCl2	Merck Life Science	21115	Chemical
Chambered coverslips	Ibidi	80826	Equiment
DyLight	Thermo Fisher Scientific	-	Antibody
FBS (Hyclone)	GIBCO	SH3007002 (CHA1111L)	Serum
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent	Thermo Fisher Scientific	F8803	Equiment
Glucose	Merck Life Science	G8769	Chemical
Glutamax	GIBCO	35050061	Chemical
HEPES	Merck Life Science	H3537	Chemical
L-Cystein	Merck Life Science	C6852-25g	Chemical
MAP2	Merck	AB15452	Antibody
MEM	Life Technologies	21575022	Medium
MgCl	Merck Life Science	M8266	Chemical
NaOH	VWR International	1,091,371,000	Chemical
Neurobasal A	Life Technologies	10888022	Medium
N-SIM Super Resolution Microscope	Nikon	-	Instrument
Papain	Merck Life Science	P-3125	Chemical
paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific	28908	Chemical
Pen/Strep 10x	Life Technologies	15140122	Chemical
phosphate-buffered saline	Gibco	10010023	Chemical
Poly-L lysine	Sigma	P2636	Chemical
ProLong Diamond Glass Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36970	Chemical
PSD95	NeuroMab	K28/43	Antibody
Round coverglass	Thermo	12052712	Equiment
SUMO1	Abcam	ab32058	Antibody
Synaptophysin	Merck	S5768	Antibody
Triton X-100	Merck	T8787	Chemical
Trypsin inhibitor	Merck Life Science	T9003-500MG	Chemical