Imágenes de Superresoridad para estudiar la co-localización de proteínas y marcadores sinápticos en neuronas primarias

Resumen

Este protocolo muestra cómo emplear la microscopía de superresorción para estudiar la co-localización de proteínas en cultivos neuronales primarios.

Resumen

Las sinapsis son los elementos funcionales de las neuronas y sus defectos o pérdidas están en la base de varios trastornos neurodegenerativos y neurológicos. Los estudios por imágenes se utilizan ampliamente para investigar su función y plasticidad en condiciones fisiológicas y patológicas. Debido a su tamaño y estructura, los estudios de localización de proteínas requieren técnicas de imagen de alta resolución. En este protocolo, describimos un procedimiento para estudiar en las neuronas primarias la co-localización de proteínas diana con marcadores sinápticos a nivel de superresción utilizando microscopía de iluminación estructurada (SIM). SIM es una técnica de iluminación de luz estanco que duplica la resolución espacial de la microscopía de campo ancho, alcanzando un detalle de alrededor de 100 nm. El protocolo indica los controles y la configuración necesarios para estudios de co-localización robustos y una visión general de los métodos estadísticos para analizar los datos de imagen correctamente.

Introducción

La comprensión y la visión de la sinapsis ha cambiado enormemente desde su primera descripción por Foster y Sherrington en 1897¹. Desde entonces, nuestro conocimiento de la comunicación neuronal y los procesos moleculares detrás de ella ha crecido exponencialmente². Ha quedado claro que las sinapsis pueden considerarse como un sistema de dos compartimentos: un compartimento presináptico que contiene vesículas para la liberación de neurotransmisores y un compartimento postsináptico con receptores^3. Esta visión simplista, en los últimos veinte años, se ha convertido en una compleja red de proteínas necesarias para transducir la unión del transmisor a la señalización^4.

Las ganancias en el entendimiento se deben en parte a las técnicas de superrescencia que superaron el límite de difracción de la microscopía de luz convencional para adaptarse a la dimensión de las sinapsis mejores^5,6,7,8,9,10. Debido al límite de difracción, un microscopio óptico no puede alcanzar una resolución superior a 200 nm lateralmente^11,12. Para eludir este límite, se crearon técnicas de superrescencia, utilizando diferentes enfoques y alcanzando diferentes resoluciones de límite de subdifacción: SIM, STED (Microscopía de Agotamiento de Emisiones Estimuladas), PALM (Microscopía de Localización Fotoactiva) y STORM (Microscopía de Reconstrucción Óptica Estocástica)^13,,14. SIM duplica la resolución espacial de los sistemas de microscopía de campo ancho basados en láser mediante la inserción de una rejilla de difracción en la trayectoria del haz de excitación¹⁵. La rejilla móvil difracta los rayos láser para crear un patrón de iluminación conocido, generalmente rayas. Este patrón de luz estructurado específicamente se superpone a la distribución espacial desconocida del tinte fluorescente (de la muestra). Los flecos de interferencia formados por los dos patrones codifican para detalles finos indistinguibles con microscopía de campo ancho normal. La imagen superconsfectada final se obtiene combinando y decodificando con métodos matemáticos varias imágenes crudas de la misma muestra obtenidas por las traducciones y rotaciones de la rejilla de difracción. La resolución de las imágenes superconsueltas alcanza los 100 nm en las direcciones lateral y 500 nm en las direcciones axiales para 2D-SIM¹⁵ o 100 nm en las direcciones lateral y 250 nm en las direcciones axiales para 3D-SIM¹⁶.

La nueva comprensión de la sinapsis es aún más importante a la luz de los muchos trastornos neurológicos donde la disfunción sináptica juega un papel importante en la aparición y progresión^17,,18. Enfermedad de Alzheimer, Síndrome de Down, Enfermedad de Parkinson, enfermedades priónicas, epilepsia, trastornos del espectro autista y síndrome X frágil entre otros se han relacionado con anomalías en la composición sináptica, morfología y función^{19,,20,,21,,22.}

Recientemente, utilizando un conjunto de anticuerpos específicos de SUMO, utilizamos SIM para mostrar la co-localización en las neuronas primarias del hipocampo de las proteínas SUMO con los marcadores pre y postsinápticos sinaptofisina y PSD95 en el nivel de superrescresía²³. Esto nos permitió confirmar la evidencia de microscopía bioquímica y confocal de la localización SUMO en las neuronas.

Aquí, describimos un protocolo para estudiar la localización de proteínas en las neuronas primarias del hipocampo de ratón. Al mismo tiempo, este protocolo puede adaptarse a diferentes tipos de cultivos neuronales primarios.

Protocolo

1. Culturas primarias

1. Neuronas primarias de hipocampo de ratón de cultivo en cubreobjetos con cámara (como Ibidi μ-Slide 8 Well o Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) que coinciden con el requisito objetivo para el espesor de la cubierta de #1,5 (0,17 mm).
2. Cubiertas con cámara de abrigo con 100 ml de poli-L-lisina (100 g/ml).
3. Al día siguiente, lave los cubreobjetos a cámara dos veces con solución salina estéril tamponada por fosfato (PBS).
4. Para obtener neuronas primarias de ratón, aislar hipocampos de cachorros P1-P4²³.
5. Coloque el hipocampo diseccionado en 10 ml de medios de disección (Tabla 1) y déjelos depositar en la parte inferior del tubo.
6. Con una pipeta estéril, retire cuidadosamente el soporte de disección, dejando el hipocampo inalterado en la parte inferior del tubo.
7. Añadir 10 ml de Media 1 (Tabla 1) al hipocampo e incubar durante 30 minutos a 37oC.
8. Con una pipeta estéril, retire cuidadosamente el Media 1, dejando el hipocampo inalterado en la parte inferior del tubo.
9. Añadir 10 ml de Media 2 (Tabla 1) y dejar el tubo centrífugo (tapado) debajo del capó horizontalmente durante 45 minutos.
10. Deje reposar el tubo de centrífuga verticalmente para permitir que el tejido se asiente en la parte inferior del tubo.
11. Con una pipeta estéril, retire cuidadosamente media 2, dejando el hipocampo inalterado en la parte inferior del tubo centrífugo.
12. Añadir 2 mL de Medios 3 (Tabla 1).
13. Usando una pipeta p1000 con una punta filtrada, disocia mecánicamente las células del tejido.
14. Transfiera el sobrenadante, en el que se encuentran las neuronas aisladas, a un tubo centrífugo de 15 ml.
15. Centrifugar la suspensión celular durante 2 min a 300 x g a temperatura ambiente (RT).
16. Después de la centrifugación, las células se encuentran en la parte inferior del tubo centrífugo. Con una pipeta estéril, deseche el sobrenadante.
17. Células resuspendidas en 1 ml de Medios 4.
18. Utilice un filtro de 70 m para eliminar las celdas no disociadas.
19. Contar las células viables en una cámara de B-rker añadiendo 1 l de 0,4 % de solución azul de Trippan a 19 l de la suspensión celular.
20. Células de placa a 70.000 células/pozo en un volumen de 200 l por pocócil.
21. Dejar que las células se adhieran durante 2 h en una incubadora humidificada a 37oC y 5% co_2.
22. Saque los cubreobjetos con cámara de la incubadora y sustituya cuidadosamente el medio por 200 l de medios de cultivo.
23. Dejar los cubreobjetos con cámara en una incubadora humidificada a 37oC y 5% de CO₂.
24. Sustituya un tercio del medio por medios de cultivo frescos cada 5-7 días.
25. Espere hasta que las neuronas primarias del hipocampo estén completamente maduradas (12-14 días después del enchapado) para realizar estudios de co-localización.

2. Tinción de inmunofluorescencia

1. Tome los cubreobjetos con cámara de la incubadora.
2. Retire el medio.
3. Lave rápidamente los pozos con 200 ml de PBS.
4. Añadir 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS (200 l/pozo) a las neuronas para fijarlas rápidamente.
5. Incubar las células durante 15 minutos en RT.
6. Retire la solución PFA.
7. Permeabilizar las células mediante la adición de PBS con 0.2% Tritón X-100 (200 l/pozo).
8. Incubar durante 1 min en RT.
9. Retirar la solución e incubar las muestras con albúmina sérica bovina (BSA) en PBS (200 l/pozo) durante 1 h en RT para cubrir pasivamente todas las superficies de unión libres de la placa con una proteína irrelevante para el análisis. Un búfer de bloqueo basado en BSA sin Triton X-100 reduce el fondo de anticuerpos de manera más eficiente que el mismo búfer con 0,2% Triton X-100.
10. Retire la solución.
11. Añadir el anticuerpo primario de elección diluido en una solución de PBS que contenga 1% de BSA y 0,2% Tritón X-100 (120-200 l/pozo, dependiendo de la dilución y disponibilidad del anticuerpo). Incubar las muestras durante 2 h.
    1. Como control negativo, no agregue ningún anticuerpo primario a uno de los pozos. Múltiples anticuerpos de diferentes especies contra diferentes objetivos se pueden utilizar al mismo tiempo. Utilice un anticuerpo contra el MAP2 (un marcador neuronal) criado en el pollo, un anticuerpo contra el PSD95 o la sinaptofisina levantado en el ratón y un anticuerpo contra una proteína diana criada en el conejo. Esto permite análisis SIM de tres colores.
12. Lave rápidamente los pozos tres veces con PBS (200 l/pozo).
13. Añadir anticuerpos secundarios (se pueden utilizar anticuerpos secundarios dyLight y Alexa) diluidos en una solución de PBS que contenga 1% de BSA y 0,2% tritón X-100 (200 l/pozo). Incubar las muestras durante 1 h en RT.
14. Lave rápidamente los pozos tres veces con PBS (200 l/pozo).
15. Añadir el tinte Hoechst a una concentración de 1 g/ml diluido en PBS (200 l/pozo) a los núcleos de tinción. Incubar las muestras durante 10 minutos en RT.
16. Lave rápidamente los pozos dos veces con PBS.
17. Monte las celdas con un montura compatible con SIM. Utilice 10 l/pozo de soporte antifada de vidrio ProLong.
18. Cubra y proteja las celdas con una cubierta (por ejemplo, una cubierta redonda con un diámetro de 8 mm). También se pueden utilizar plazas.
19. Guarde los cubreobjetos con cámara en RT y espere al menos 48 horas antes de adquirir imágenes. Diamond Glass requiere al menos dos días de curado antes de las adquisiciones de superresor resolución.

3. Control de especificidad de anticuerpos

NOTA: Utilice dos estrategias para asegurar la especificidad de los anticuerpos. La primera estrategia es utilizar al menos dos anticuerpos diferentes dirigidos al mismo sustrato. La segunda estrategia es la neutralización de anticuerpos por incubación con el objetivo de proteína purificada o el epítopo utilizado para aumentar el anticuerpo.

1. Incubar el anticuerpo de elección con cinco veces el exceso del objetivo recombinante o epítopo durante 1 h en RT en 1% de BSA en PBS.
2. Después de la incubación, utilice el anticuerpo neutralizado a la concentración habitual para la tinción como se describió anteriormente a partir de 2.11.

4. Calibración del microscopio

NOTA: Utilizamos rutinariamente un sistema de microscopio de superconorción N-SIM fabricado por Nikon para los estudios de super resolución. Sin embargo, varias otras empresas también ofrecen microscopios de superrescresía en sus catálogos. Aunque se describen indicaciones específicas para el sistema N-SIM de Nikon, las instrucciones siguientes se pueden generalizar en otros sistemas. Antes de la adquisición de imágenes SIM, el sistema requiere una calibración adecuada con perlas fluorescentes de tamaño de subrescresación específicas. Un ejemplo son las microesferas TetraSpeck. Estas perlas están teñidas con diferentes tintes fluorescentes para permitir la calibración de diferentes láseres con una sola muestra.

1. En un baño de agua sonicar alrededor de 1.8 x 10⁸ microesferas fluorescentes durante 10 minutos. El sistema N-SIM de Nikon requiere una muestra de perlas multicolores escasamente pobladas para la calibración. Esto podría diferir para otros sistemas que requieren una capa única densa de perlas fluorescentes de tamaño de subresión. Ajuste el número de partículas fluorescentes en consecuencia.
2. Diluir las microesferas fluorescentes 1:500 en agua destilada doble.
3. Sonicar una segunda vez durante 10 minutos adicionales.
4. Pipetear 15 l de las perlas diluidas en un pozo de un cubreobjetos con cámara.
5. Deje secar la solución durante 5 minutos en RT.
6. Añada 10 l de la solución de montaje y coloque un cubreobjetos de 8 mm en la parte superior.
7. Espere al menos 48 horas para permitir el curado adecuado.
8. Encienda el microscopio y los láseres.
9. Deje que el sistema se caliente para alcanzar el equilibrio térmico de todos los componentes del microscopio. El sistema de microscopio de superconorción N-SIM requiere al menos 3 horas.
10. Seleccione el objetivo 100x.
11. Inicie la calibración alineando los láseres con el centro del bloque de rejilla de difracción. En el sistema N-SIM, una perilla de micrómetros y una cámara dedicada permiten centrar los haces de luz al objetivo.
12. Inserte el cubreobjetos con cámara en el microscopio para su visualización. Ajuste el sistema al espesor de la cubierta con cámara ajustando el collar de corrección objetiva. El software NIS, el software propietario proporcionado con los sistemas de microscopio de superresorción N-SIM, tiene una función automática para regular los collares de corrección.
13. Ajuste el enfoque del bloque de rejilla para cada canal para garantizar una iluminación de patrón estructurado enfocada en la muestra. El software NIS proporciona una función automática para esta tarea.
14. A continuación, adquiera imágenes 3D-SIM en bruto de las microesferas multicolores. Reconstruya las imágenes en bruto para obtener una imagen superconsuelta utilizando el software del microscopio o la plataforma de software de código abierto para el análisis de imágenes biológicas ImageJ²⁴ y el plugin fairSIM²⁵.
15. Calcular, para cada longitud de onda separada, la transformación de Fourier de la imagen superconsuelta obtenida en 4.14. Si la imagen transformada no puede obtener un patrón correcto de flores, reinicie la calibración desde 4.11 ya que no se ha logrado la super-resolución.
16. En la imagen superconsútil, seleccione una sola microesfera y calcule su perfil de intensidad para cada canal para medir la resolución alcanzada. Ahora debe estar cerca de 100 nm lateralmente.
17. A continuación, realice el registro de canales superponiendo una adquisición multicanal de las microesferas. El objetivo es colisionar todas las señales de canal de forma lateral y axial. Esto eliminará las aberraciones cromáticas debido a la desalineación de los diferentes canales y ayudará al análisis de la co-localización.
18. Confirme la calidad de la calibración utilizando las funciones "Illumination Phase Steps" y "Illumination Pattern Focus" de SIMcheck²⁶, un conjunto de plugins para la aplicación de código abierto ImageJ. Con este fin, prepare un cubreobjetos con cámara para obtener una sola capa densa de microesferas TetraSpeck y adquiera una imagen 3D-SIM de la muestra. Analice la imagen en ImageJ y, si se detectan aberraciones, reinicie la calibración del microscopio desde el paso 4.11.

5. Adquisición

1. Comience a analizar la muestra utilizando un objetivo 40x en modo confocal o de campo ancho. Esto permite la navegación a la muestra, manteniendo buenos detalles y un gran campo de visión.
2. Utilice la señal de anticuerpos MAP2 para identificar un área que represente procesos neuronales.
3. Adquiera imágenes de la muestra en modo confocal para determinar la calidad de la tinción. La mala calidad confocal se reflejará en la mala calidad de la SIM, por lo que se requiere que las muestras se desechan.
4. Si el área y la calidad de las imágenes son satisfactorias, cambie el objetivo a 100x.
5. Aplique aceite al objetivo 100x.
6. Adquirir una imagen de campo ancho o confocal que se utilizará más adelante para evaluar la calidad de la imagen superconstionada (Figura 1A,B).
7. Cambie al modo 3D-SIM.
8. Mediante las ventanas de diálogo para establecer parámetros para la adquisición, seleccione la configuración de profundidad de bits más alta disponible para maximizar la información de color. Normalmente, 16 bits es la opción estándar. Además, para mejorar la relación señal-ruido, seleccione un valor de baja frecuencia para la adquisición, como 1 MHz.
9. Usando ventanas de histograma, ajuste la potencia de los láseres para obtener una respuesta lineal de la señal. Para evitar la pérdida de información, limite los píxeles saturados en las imágenes. El sistema N-SIM utiliza una cámara Andor iXon3. Cuando trabaje a 16 bits, elija una intensidad objetivo de 16.000 para garantizar la respuesta lineal de la cámara. Alternativamente, elija un rango entre 30,000-45,000 para maximizar el rango dinámico de la adquisición.
10. Establezca la potencia del láser entre 0,1% y 50% al tomar imágenes de las muestras y los tiempos de exposición entre 50 ms y 2 s. Las potencias láser superiores al 50% pueden causar un fotoblanqueo rápido de los fluoróforos en uso.
11. Comience a adquirir las imágenes en modo 3D-SIM.
12. Utilice SIMcheck, un conjunto de plugins gratuitos para ImageJ, para evaluar la calidad de adquisición de las imágenes sin procesar.
13. Si SIMCheck no detecta artefactos ni problemas de calidad, adquiera un mínimo de 10 imágenes de 4 réplicas técnicas para permitir el análisis estadístico.

6. Postproducción: reconstrucción de imágenes

NOTA: Las imágenes adquiridas en 3D-SIM son imágenes sin procesar que deben procesarse para obtener imágenes superconsueltas reconstruidas. La reconstrucción incorrecta de imágenes sin procesar puede dar lugar a artefactos que afectarían al análisis de las muestras. Por lo tanto, se debe prestar una gran atención a la elección adecuada de los parámetros de reconstrucción.

1. Procesar las imágenes sin procesar utilizando el software de análisis de reconstrucción del microscopio para obtener una imagen superconsuel(Figura 1C). Alternativamente, utilice el plugin gratuito ImageJ fairSIM para reconstruir imágenes sin procesar.
2. Calcule la transformación de Fourier de las imágenes superconsueltas utilizando el software de reconstrucción del microscopio o el plugin ImageJ SIMCheck. Una buena imagen reconstruida debe devolver, para cada canal, una imagen similar a una flor. Si las imágenes reconstruidas no pueden recrear una forma similar a una flor, reinicie desde las imágenes sin procesar y reconstruya modificando los parámetros de reconstrucción como el filtrado De Wiener, la apodización y la supresión de orden cero²⁷. En el software NIS, utilizando la vista previa para supervisar cómo el cambio de los parámetros afecta a la imagen final resuelta, modifique los parámetros i) Contraste de modulación de iluminación, ii) Supresión de ruido de alta resolución y iii) Supresión de de enfoque.
3. A continuación, analiza la imagen reconstruida para detectar de forma imparcial artefactos mediante NanoJ-SQUIRREL²⁸, un plugin basado en ImageJ para evaluar la calidad de las imágenes superconsúcedas.
4. Si NanoJ-SQUIRREL detecta artefactos, reinicie desde las imágenes sin procesar y reconstruyalos modificando los parámetros de reconstrucción, como el filtrado Wiener, la apodización y la supresión de orden cero. En el software NIS, utilizando la vista previa para supervisar cómo el cambio de los parámetros afecta a la imagen final resuelta, modifique los parámetros Contraste de modulación de iluminación, Supresión de ruido de alta resolución y Supresión de desenfoque.
5. Utilice las imágenes superconsueltos para calcular el perfil de co-localización y/o los coeficientes de Pearson y Mander.

7. Co-localización con análisis de perfil

NOTA: Como primer paso para estudiar la co-localización entre marcadores sinápticos y una proteína de interés, tome una imagen superconsuelta y analice un solo locus para determinar la superposición de la señal.

1. Identifique un solo locus en la imagen superconsuel.
2. Obtener los perfiles de intensidad de las señales fluorescentes del locus de interés.
3. Exporte los datos.
4. Utilice GraphPad Prism, o un software de análisis similar, para normalizar todos los picos de señal y obtener intensidades de señal comparables para cada canal con el objetivo final de determinar la co-localización específica del locus.

8. Cuantificación de los coeficientes de Pearson y Mander

NOTA: Si el análisis de perfil ha sugerido una sola co-localización de locus, se puede realizar un análisis más general de toda la imagen calculando los coeficientes^29,,30de Pearson y Mander.

1. Utilice JACoP³¹, un plug-in ImageJ, para determinar los dos parámetros de la co-localización: Pearson's y Mander's.

9. Análisis estadístico

1. Utilice GraphPad Prism, o un software de análisis y gráficos similar, para procesar los datos recopilados con JACoP.
2. Utilice al menos 40 imágenes SIM para cada condición analizada para obtener gráficos y para la relevancia estadística.

Resultados

Aquí presentamos el flujo de trabajo estándar para estudiar la co-localización de proteínas neuronales. Primero calibramos el microscopio y luego realizamos el análisis SIM de las muestras. Para calibrar el sistema, utilizamos microesferas fluorescentes de 0,1 m de diámetro. Al obtener imágenes 3D-SIM superconsúcesas de los cordones, los datos de imagen subyacentes se transforman en Fourier para volver a convertirlas en una representación de frecuencia espacial. En la Figura 2A,el p...

Discusión

Elucidar la estructura y composición de la sinapsis es crucial para entender los procesos fisiológicos y patológicos que regulan la memoria y la cognición. Mientras que en el estado normal, las sinapsis son los bloques de construcción de la memoria, también subyacen a trastornos neurológicos complejos como la enfermedad de Alzheimer³². El protocolo descrito aquí sirve para estudiar la co-localización de proteínas neuronales con una técnica de microscopía de superresor resolución llama...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue solution	Thermo Fisher Scientific	15250061	Chemical
70 µm filter	Corning	352350	Equiment
Alexa	Thermo Fisher Scientific	-	Antibody
Antibody SENP1	Santa Cruz	sc-271360	Antibody
B27 Supplement	Life Technologies	17504044	Chemical
Bovine serum albumin	Merck	5470	Chemical
CaCl2	Merck Life Science	21115	Chemical
Chambered coverslips	Ibidi	80826	Equiment
DyLight	Thermo Fisher Scientific	-	Antibody
FBS (Hyclone)	GIBCO	SH3007002 (CHA1111L)	Serum
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent	Thermo Fisher Scientific	F8803	Equiment
Glucose	Merck Life Science	G8769	Chemical
Glutamax	GIBCO	35050061	Chemical
HEPES	Merck Life Science	H3537	Chemical
L-Cystein	Merck Life Science	C6852-25g	Chemical
MAP2	Merck	AB15452	Antibody
MEM	Life Technologies	21575022	Medium
MgCl	Merck Life Science	M8266	Chemical
NaOH	VWR International	1,091,371,000	Chemical
Neurobasal A	Life Technologies	10888022	Medium
N-SIM Super Resolution Microscope	Nikon	-	Instrument
Papain	Merck Life Science	P-3125	Chemical
paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific	28908	Chemical
Pen/Strep 10x	Life Technologies	15140122	Chemical
phosphate-buffered saline	Gibco	10010023	Chemical
Poly-L lysine	Sigma	P2636	Chemical
ProLong Diamond Glass Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36970	Chemical
PSD95	NeuroMab	K28/43	Antibody
Round coverglass	Thermo	12052712	Equiment
SUMO1	Abcam	ab32058	Antibody
Synaptophysin	Merck	S5768	Antibody
Triton X-100	Merck	T8787	Chemical
Trypsin inhibitor	Merck Life Science	T9003-500MG	Chemical