Imagem de super-resolução para estudar co-localização de proteínas e marcadores sinápticos em neurônios primários

Resumo

Este protocolo mostra como empregar microscopia de super-resolução para estudar a co-localização de proteínas em culturas neuronais primárias.

Resumo

Sinapses são os elementos funcionais dos neurônios e seus defeitos ou perdas são a base de várias doenças neurodegenerativas e neurológicas. Estudos de imagem são amplamente utilizados para investigar sua função e plasticidade em condições fisiológicas e patológicas. Devido ao seu tamanho e estrutura, estudos de localização de proteínas requerem técnicas de imagem de alta resolução. Neste protocolo, descrevemos um procedimento para estudar em neurônios primários a co-localização de proteínas-alvo com marcadores sinápticos em um nível de super-resolução utilizando microscopia de iluminação estruturada (SIM). SIM é uma técnica de iluminação de luz padronizada que dobra a resolução espacial da microscopia de campo largo, atingindo um detalhe de cerca de 100 nm. O protocolo indica os controles e configurações necessários para estudos robustos de co-localização e uma visão geral dos métodos estatísticos para analisar adequadamente os dados de imagem.

Introdução

A compreensão e visão da sinapse mudou enormemente desde sua primeira descrição por¹Foster e Sherrington em 18971 . Desde então, nosso conhecimento da comunicação neuronal e dos processos moleculares por trás dela tem crescido exponencialmente². Tornou-se claro que as sinapses podem ser consideradas como um sistema de dois compartimentos: um compartimento pré-sináptico contendo vesículas para a liberação de neurotransmissores e um compartimento pós-sináptico com receptores³. Essa visão simplista, nos últimos vinte anos, evoluiu para uma complexa rede de proteínas necessárias para transdutor de transmissão ligado à sinalização⁴.

Os ganhos no entendimento se devem, em parte, às técnicas de super-resolução que superaram o limite de difração da microscopia de luz convencional para se adequar melhor à dimensão das sinapses^{5,,6,,7,,8,,9,,10}. Devido ao limite de difração, um microscópio óptico não pode atingir uma resolução acima de 200 nm lateralmente^11,12. Para contornar esse limite, foram criadas técnicas de super-resolução, utilizando diferentes abordagens e atingindo diferentes resoluções de limite de subditração: SIM, STED (Estimulada Microscopia de Esgotamento de Emissões), PALM (Microscopia de Localização FotoAtivada) e STORM (Microscopia óptica de Reconstrução Estocástica)^13,14. O SIM dobra a resolução espacial de sistemas de microscopia de campo largo baseados em laser inserindo uma grade de difração no feixe de excitação¹⁵. A grade móvel difunde os raios laser para criar um padrão de iluminação conhecido, geralmente listras. Este padrão de luz estruturado propositalmente é sobreposto à distribuição espacial desconhecida do corante fluorescente (da amostra). As franjas de interferência formadas pelos dois padrões codificam para detalhes finos indistinguíveis com microscopia de campo largo normal. A imagem super-resolvida final é obtida pela combinação e decodificação com métodos matemáticos várias imagens brutas da mesma amostra obtidas pelas traduções e rotações da grade de difração. A resolução das imagens super-resolvidas atinge 100 nm na lateral e 500 nm nas direções axial para 2D-SIM¹⁵ ou 100 nm na lateral e 250 nm nas direções axial para 3D-SIM¹⁶.

O novo entendimento da sinapse é ainda mais importante à luz das muitas doenças neurológicas onde a disfunção sináptica desempenha um papel importante no início e progressão^17,18. Doença de Alzheimer, Síndrome de Down, Doença de Parkinson, doenças de príon, epilepsia, transtornos do espectro autista e síndrome do X frágil, entre outros, têm sido associadas a anormalidades na composição sináptica, morfologia e função^{19,,20,,21,22}.

Recentemente, utilizando um conjunto de anticorpos específicos do SUMH, usamos o SIM para mostrar a co-localização nos neurônios hipocampais primários das proteínas SUMO com os marcadores pré e pós-sináptico sinaptophysin e PSD95 no nível de super resolução²³. Isso nos permitiu confirmar evidências de microscopia bioquímica e confocal da localização do SUM nos neurônios.

Aqui, descrevemos um protocolo para estudar a localização de proteínas em neurônios primários hipocampais de camundongos. Ao mesmo tempo, este protocolo pode ser adaptado a diferentes tipos de culturas neuronais primárias.

Protocolo

1. Culturas primárias

1. Neurônios primários hipocampais de rato de cultura em tampas câmaras (como Ibidi μ-Slide 8 Bem ou Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) que correspondem ao requisito objetivo para #1,5 (0,17 mm) de espessura de deslizamento.
2. Tampas de câmara de revestimento com 100 μL de poli-L-lisina (100 μg/mL).
3. No dia seguinte, lave as tampas câmara duas vezes com soro fisco estéril tamponado (PBS).
4. Para obter neurônios primários do camundongo, isole o hipocampi dos filhotes P1-P4²³.
5. Coloque hipocampi dissecado em 10 mL de Mídia de Dissecção (Tabela 1) e deixe-os depositar na parte inferior do tubo.
6. Usando uma pipeta estéril, remova cuidadosamente a Mídia de Dissecção, deixando o hipocampi intacto na parte inferior do tubo.
7. Adicione 10 mL de Media 1 (Tabela 1) ao hipocampi e incubar por 30 minutos a 37 °C.
8. Usando uma pipeta estéril, remova cuidadosamente a Media 1, deixando o hipocampi intacto na parte inferior do tubo.
9. Adicione 10 mL de Media 2(Tabela 1) e deixe o tubo de centrífuga (tampado) sob o capô horizontalmente por 45 minutos.
10. Deixe o tubo de centrífugas ficar verticalmente para permitir que o tecido se instale na parte inferior do tubo.
11. Usando uma pipeta estéril, remova cuidadosamente a Media 2, deixando o hipocampi intacto na parte inferior do tubo centrífuga.
12. Adicionar 2 mL de Media 3(Tabela 1).
13. Usando uma pipeta p1000 com ponta filtrada, dissociar mecanicamente células do tecido.
14. Transfira o supernante, no qual estão localizados os neurônios isolados, para um tubo de centrífuga de 15 mL.
15. Centrifugar a suspensão celular por 2 min a 300 x g em temperatura ambiente (RT).
16. Após a centrifugação, as células estão localizadas na parte inferior do tubo de centrífuga. Usando uma pipeta estéril, descarte o supernaspeso.
17. Células resuspend em 1 mL de Media 4.
18. Use um filtro de 70 μm para eliminar células não dissociadas.
19. Conte células viáveis em uma câmara de Bürker adicionando 1 μL de solução azul trypan de 0,4 % a 19 μL da suspensão celular.
20. Células de placa a 70.000 células/bem em um volume de 200 μL por poço.
21. Deixe as células anexar por 2h em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO₂.
22. Retire as tampas câmaradas da incubadora e substitua cuidadosamente o meio por 200 μL de Mídia de Cultura.
23. Deixe as tampas em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO₂.
24. Substitua um terço do meio por novas mídias culturais a cada 5-7 dias.
25. Espere até que os neurônios primários hipocampais estejam totalmente maduros (12-14 dias após o revestimento) para realizar estudos de co-localização.

2. Coloração de imunofluorescência

1. Pegue as tampas de câmara da incubadora.
2. Remova o meio.
3. Lave rapidamente os poços com 200 μL de PBS.
4. Adicione 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS (200 μL/bem) aos neurônios para corrigi-los rapidamente.
5. Incubar as células por 15 minutos na RT.
6. Remova a solução PFA.
7. Permeabilize as células adicionando PBS com Triton X-100 (200 μL/well).
8. Incubar por 1 min na RT.
9. Remova a solução e incuba as amostras com 1% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS (200 μL/well) por 1 h em RT para cobrir passivamente todas as superfícies de ligação livre da placa com uma proteína irrelevante para a análise. Um buffer de bloqueio baseado em BSA sem Triton X-100 reduz o fundo do anticorpo de forma mais eficiente do que o mesmo buffer com Triton X-100 de 0,2%.
10. Remova a solução.
11. Adicione o anticorpo primário de escolha diluído em uma solução PBS contendo 1% BSA e 0,2% Triton X-100 (120-200 μL/bem, dependendo da diluição e disponibilidade de anticorpos). Incubar as amostras por 2h.
    1. Como controle negativo, não adicione nenhum anticorpo primário a um dos poços. Vários anticorpos de diferentes espécies contra alvos diferentes podem ser usados ao mesmo tempo. Use um anticorpo contra MAP2 (um marcador neuronal) criado em frango, um anticorpo contra PSD95 ou sinaptofisina criada em camundongos, e um anticorpo contra uma proteína alvo levantada em coelho. Isso permite análises sim de três cores.
12. Lave rapidamente os poços três vezes com PBS (200 μL/well).
13. Adicione anticorpos secundários (anticorpos secundários dyLight e Alexa podem ser ambos diluídos) diluídos em uma solução PBS contendo 1% BSA e 0,2% Triton X-100 (200 μL/well). Incubar as amostras por 1h na RT.
14. Lave rapidamente os poços três vezes com PBS (200 μL/well).
15. Adicione corante Hoechst a uma concentração de 1 μg/mL diluída em PBS (200 μL/well) para colorir núcleos. Incubar as amostras por 10 minutos na RT.
16. Lave rapidamente os poços duas vezes com PBS.
17. Monte células usando um montador compatível com SIM. Use 10 μL/well de ProLong Glass Antifade Mountant.
18. Cubra e proteja as células com um óculos de cobertura (por exemplo, um copo de cobertura redondo com um diâmetro de 8 mm). Os quadrados também podem ser usados.
19. Armazene as tampas em câmara no RT e espere pelo menos 48h antes de adquirir imagens. A Diamond Glass requer pelo menos dois dias de cura antes das aquisições de super resolução.

3. Controle de especificidade de anticorpos

NOTA: Use duas estratégias para garantir a especificidade do anticorpo. A primeira estratégia é usar pelo menos dois anticorpos diferentes visando o mesmo substrato. A segunda estratégia é a neutralização de anticorpos por incubação com o alvo proteico purificado ou o epítope usado para elevar o anticorpo.

1. Incubar o anticorpo de escolha com cinco vezes mais do alvo recombinante ou epítope por 1 h em RT em 1% de BSA na PBS.
2. Após a incubação, use o anticorpo neutralizado na concentração usual para coloração conforme descrito acima de 2,11.

4. Calibração do microscópio

NOTA: Usamos rotineiramente um sistema de microscópio de super resolução N-SIM fabricado pela Nikon para os estudos de super-resolução. No entanto, várias outras empresas também oferecem microscópios de super resolução em seus catálogos. Embora as indicações específicas para o sistema N-SIM da Nikon sejam descritas, as instruções a seguir podem ser generalizadas para outros sistemas. Antes da aquisição de imagens SIM, o sistema requer uma calibração adequada com contas fluorescentes específicas de tamanho de sub-resolução. Um exemplo são as microesferas tetraspeck. Estas contas são manchadas com diferentes corantes fluorescentes para permitir a calibração de diferentes lasers com uma amostra.

1. Em um banho de água sonicate em torno de 1,8 x 10⁸ microesferas fluorescentes por 10 minutos. O sistema N-SIM da Nikon requer uma amostra de contas multicoloridas pouco povoadas para a calibração. Isso pode diferir para outros sistemas que requerem uma densa camada única de contas fluorescentes de tamanho de sub-resolução. Ajuste o número de partículas fluorescentes de acordo.
2. Diluir as microesferas fluorescentes 1:500 em água dupla destilada.
3. Sonicate uma segunda vez por mais 10 minutos.
4. Pipet 15 μL das contas diluídas em um poço de um deslizamento de cobertura câmara.
5. Deixe a solução secar por 5 minutos na RT.
6. Adicione 10 μL da solução de montagem e coloque uma tampa de 8 mm por cima.
7. Aguarde pelo menos 48 horas para permitir a cura adequada.
8. Ligue o microscópio e os lasers.
9. Deixe o sistema aquecer para alcançar o equilíbrio térmico de todos os componentes do microscópio. O sistema de microscópio de super-resolução N-SIM requer pelo menos 3 horas.
10. Selecione o objetivo de 100x.
11. Inicie a calibração alinhando os lasers ao centro do bloco de grade de difração. No sistema N-SIM, um botão de micrômetro e uma câmera dedicada permitem o centro dos feixes de luz para o alvo.
12. Insira a tampa de câmara no microscópio para visualização. Ajuste o sistema para a espessura da tampa de câmara, ajustando a coleira de correção objetiva. O software NIS, o software proprietário fornecido com sistemas de microscópio de super-resolução N-SIM, tem uma função automática para regular colares de correção.
13. Ajuste o foco do bloco de grade para cada canal para garantir a iluminação de padrão estruturado focalizada na amostra. O software NIS fornece uma função automática para esta tarefa.
14. Em seguida, adquira imagens 3D-SIM brutas das microesferas multicoloridas. Reconstrua as imagens brutas para obter uma imagem super-resolvida usando o software de microscópio ou a plataforma de software de código aberto para a análise de imagens biológicas ImageJ²⁴ e o plugin fairSIM²⁵.
15. Calcule, para cada comprimento de onda separado, a transformação fourier da imagem super-resolvida obtida em 4.14. Se a imagem transformada não conseguir um padrão correto semelhante a uma flor, reinicie a calibração a partir de 4.11, uma vez que a super-resolução não foi alcançada.
16. Na imagem super resolvida, selecione uma única microesfera e calcule seu perfil de intensidade para cada canal para medir a resolução alcançada. Agora deve estar perto de 100 nm lateralmente.
17. Em seguida, realize o registro do canal sobrepondo uma aquisição multicanal das microesferas. O objetivo é reunir todos os sinais do canal lateralmente e axily. Isso eliminará as aberrações cromáticas devido ao desalinhamento dos diferentes canais e ajudará na análise de co-localização.
18. Confirme a qualidade da calibração usando as funções "Passos de Fase de Iluminação" e "Foco de Padrão de Iluminação" do SIMcheck²⁶, um conjunto de plugins para o aplicativo de código aberto ImageJ. Para isso, prepare um clipe de cobertura com câmara para obter uma densa camada única de microesferas TetraSpeck e adquira uma imagem 3D-SIM da amostra. Analise a imagem no ImageJ e, se forem detectadas aberrações, reinicie a calibração do microscópio a partir da etapa 4.11.

5. Aquisição

1. Comece a analisar a amostra usando um objetivo de 40x no modo confocal ou widefield. Isso permite a navegação para a amostra, mantendo bons detalhes e um grande campo de visão.
2. Use o sinal de anticorpos MAP2 para identificar uma área que represente processos neuronais.
3. Adquira imagens da amostra no modo confocal para determinar a qualidade da coloração. A má qualidade confocal refletirá na má qualidade do SIM, exigindo, portanto, que as amostras sejam descartadas.
4. Se a área e a qualidade das imagens forem satisfatórias, mude o objetivo para 100x.
5. Aplique óleo ao objetivo de 100x.
6. Adquira uma imagem widefield ou confocal que será usada posteriormente para avaliar a qualidade da imagem super-resolvida (Figura 1A,B).
7. Mude para o modo 3D-SIM.
8. Usando janelas de diálogo para definir parâmetros para aquisição, selecione a configuração de profundidade de bit mais alta disponível para maximizar as informações de cores. Normalmente, 16 bits é a escolha padrão. Além disso, para melhorar a relação sinal-ruído, selecione um baixo valor de frequência para aquisição, como 1 MHz.
9. Usando janelas histogramas, defina lasers para obter uma resposta linear do sinal. Para evitar a perda de informações, limite pixels saturados nas imagens. O sistema N-SIM usa uma câmera Andor iXon3. Ao trabalhar em 16 bits, escolha uma intensidade de destino de 16.000 para garantir a resposta linear da câmera. Alternativamente, escolha uma faixa entre 30.000-45.000 para maximizar o alcance dinâmico da aquisição.
10. Defina a potência laser entre 0,1% e 50% ao fotografar as amostras e os tempos de exposição entre 50 e 2 s. Potências a laser acima de 50% podem causar fotobleachamento rápido dos fluoroforos em uso.
11. Comece a adquirir as imagens no modo 3D-SIM.
12. Use o SIMcheck, um conjunto de plugins gratuitos para ImageJ, para avaliar a qualidade da aquisição das imagens brutas.
13. Se o SIMCheck não detectar quaisquer artefatos ou problemas de qualidade, adquira um mínimo de 10 imagens de 4 réplicas técnicas para permitir a análise estatística.

6. Pós-produção: reconstrução de imagem

NOTA: As imagens adquiridas 3D-SIM são imagens brutas que precisam ser processadas para obter imagens super-resolvidas reconstruídas. A reconstrução incorreta de imagens brutas pode levar a artefatos que afetariam a análise das amostras. Deve-se, portanto, prestar muita atenção à escolha adequada dos parâmetros de reconstrução.

1. Processe as imagens brutas usando o software de análise de reconstrução do microscópio para obter uma imagem super-resolvida(Figura 1C). Alternativamente, use o plugin ImageJ livremente disponível fairSIM para reconstruir imagens brutas.
2. Calcule a transformação Fourier das imagens super-resolvidas usando o software de reconstrução do microscópio ou o plugin ImageJ SIMCheck. Uma boa imagem reconstruída deve retornar, para cada canal, uma imagem semelhante a uma flor. Se as imagens reconstruídas não recriarem uma forma semelhante a uma flor, reiniciem a partir das imagens brutas e reconstruam-nas modificando os parâmetros de reconstrução, como filtragem de Wiener, apodização e supressão de ordem zero²⁷. No software NIS, usando a visualização para monitorar como a alteração dos parâmetros afeta a imagem final resolvida, modifique os parâmetros i) Contraste de Modulação de Iluminação, ii) Supressão de Ruído de Alta Resolução e iii) Supressão de Foco.
3. Em seguida, analise a imagem reconstruída para detectar artefatos imparcialmente usando NanoJ-SQUIRREL²⁸, um plugin baseado em ImageJ para avaliar a qualidade de imagens super-resolvidas.
4. Se o NanoJ-SQUIRREL detectar artefatos, reinicie-os a partir das imagens brutas e reconstrua-os modificando os parâmetros de reconstrução, como filtragem de Wiener, apodização e supressão de ordem zero. No software NIS, usando a visualização para monitorar como a alteração dos parâmetros afeta a imagem final resolvida, modifique os parâmetros Contraste de Modulação de Iluminação, Supressão de Ruído de Alta Resolução e Supressão de Foco.
5. Use as imagens super resolvidas para calcular o perfil de co-localização e/ou os coeficientes de Pearson e Mander.

7. Co-localização com análise de perfil

NOTA: Como primeiro passo para estudar a co-localização entre marcadores sinápticos e uma proteína de interesse, pegue uma imagem super resolvida e analise um único lócus para determinar a sobreposição de sinal.

1. Identifique um único lócus na imagem super resolvida.
2. Obtenha os perfis de intensidade dos sinais fluorescentes do lócus de interesse.
3. Exportar os dados.
4. Use o GraphPad Prism, ou um software de análise semelhante, para normalizar todos os picos de sinal e obter intensidades de sinal comparáveis para cada canal com o objetivo final de determinar a co-localização específica do lócus.

8. Quantificação dos coeficientes de Pearson e Mander

NOTA: Se a análise do perfil tiver sugerido a co-localização do locus único, uma análise mais geral de toda a imagem pode ser realizada calculando os coeficientes de Pearson e Mander^29,30.

1. Use o JACoP³¹, um plug-in ImageJ, para determinar os dois parâmetros de co-localização: Pearson's e Mander's.

9. Análise estatística

1. Use o GraphPad Prism, ou um software de análise e gráfico semelhante, para processar dados coletados com JACoP.
2. Utilize pelo menos 40 imagens SIM para cada condição analisada para obtenção de gráficos e para relevância estatística.

Resultados

Apresentamos aqui o fluxo de trabalho padrão para estudar a co-localização das proteínas neuronais. Primeiro calibramos o microscópio e, em seguida, realizamos a análise sim das amostras. Para calibrar o sistema, utilizamos microesferas fluorescentes de 0,1 μm de diâmetro. Ao obter imagens 3D-SIM super resolvidas das contas, os dados de imagem subjacentes são transformados em Fourier para recon converter-nas em uma representação de frequência espacial. Na Figura 2A,o padrão de f...

Discussão

Elucidar a estrutura e a composição da sinapse é crucial para a compreensão dos processos fisiológicos e patológicos que regulam a memória e a cognição. Enquanto no estado normal, as sinapses são os blocos de construção da memória, elas também estão por trás de distúrbios neurológicos complexos, como a doença de Alzheimer³². O protocolo descrito aqui serve para estudar a co-localização de proteínas neuronais com uma técnica de microscopia de super resolução chamada SIM. Ut...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue solution	Thermo Fisher Scientific	15250061	Chemical
70 µm filter	Corning	352350	Equiment
Alexa	Thermo Fisher Scientific	-	Antibody
Antibody SENP1	Santa Cruz	sc-271360	Antibody
B27 Supplement	Life Technologies	17504044	Chemical
Bovine serum albumin	Merck	5470	Chemical
CaCl2	Merck Life Science	21115	Chemical
Chambered coverslips	Ibidi	80826	Equiment
DyLight	Thermo Fisher Scientific	-	Antibody
FBS (Hyclone)	GIBCO	SH3007002 (CHA1111L)	Serum
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent	Thermo Fisher Scientific	F8803	Equiment
Glucose	Merck Life Science	G8769	Chemical
Glutamax	GIBCO	35050061	Chemical
HEPES	Merck Life Science	H3537	Chemical
L-Cystein	Merck Life Science	C6852-25g	Chemical
MAP2	Merck	AB15452	Antibody
MEM	Life Technologies	21575022	Medium
MgCl	Merck Life Science	M8266	Chemical
NaOH	VWR International	1,091,371,000	Chemical
Neurobasal A	Life Technologies	10888022	Medium
N-SIM Super Resolution Microscope	Nikon	-	Instrument
Papain	Merck Life Science	P-3125	Chemical
paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific	28908	Chemical
Pen/Strep 10x	Life Technologies	15140122	Chemical
phosphate-buffered saline	Gibco	10010023	Chemical
Poly-L lysine	Sigma	P2636	Chemical
ProLong Diamond Glass Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36970	Chemical
PSD95	NeuroMab	K28/43	Antibody
Round coverglass	Thermo	12052712	Equiment
SUMO1	Abcam	ab32058	Antibody
Synaptophysin	Merck	S5768	Antibody
Triton X-100	Merck	T8787	Chemical
Trypsin inhibitor	Merck Life Science	T9003-500MG	Chemical