JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

لقد أنشأنا مقايسة تحلل الخلايا البدينة خارج الجسم الحي التي يتم إجراؤها عن طريق احتضان الخلايا الإفرازية البريتونية الخام المعزولة من الفئران ، ومعالجتها بعامل دوائي ذي أهمية وإعطاء IgE المضاد لثنائي نيتروفينول (DNP) مسبقا ، مع DNP على بروتين ناقل.

Abstract

تعد مثبتات الخلايا البدينة جزءا أساسيا من أدوية الحساسية. الحساسية المفرطة الجهازية السلبية (PSA) هي اختبار حيواني يستخدم على نطاق واسع للتحقيق في تأثير عامل دوائي ذي أهمية على الخلايا البدينة في الجسم الحي. نظرا لأن أعراض الحساسية تعزى في المقام الأول إلى إفراز الخلايا من الخلايا البدينة ، فمن المتصور أن العامل الذي يسبب تحسين الأعراض له نشاط استقرار الخلايا البدينة. على الرغم من الحقيقة ، من الحكمة تأكيد النشاط من خلال إظهار التدهور المباشر في النشاط الوظيفي للخلايا البدينة بعد علاجها. يتم استخدام فحوصات التحلل في المختبر باستخدام خط الخلايا البدينة الخالد أو الخلايا البدينة الأولية المزروعة بشكل روتيني لتحقيق هذه الغاية. قد لا تكون نتائج المقايسات في المختبر وفي الجسم الحي متشابهة دائما مع بعضها البعض. ومع ذلك ، نظرا لأن ظروف العلاج (على سبيل المثال ، جرعة العلاج والوقت والبيئات المحيطة) للمقايسات في المختبر غالبا ما تكون مختلفة عن تلك الخاصة بالمقايسة في الجسم الحي مثل PSA. سعيا وراء اختبار في المختبر (أو خارج الجسم الحي) ليعكس عن كثب تأثير العامل الدوائي على الخلايا البدينة في الجسم الحي ، ابتكرنا مقايسة تحلل الخلايا البدينة خارج الجسم الحي حيث تم احتضان الخلايا الإفرازية البريتونية الخام (PECs) المعزولة من الفئران ، والمعالجة بالعامل وإدارتها المضادة لثنائي نيتروفينول (DNP) IgE ، مباشرة مع DNP على بروتين ناقل. اتضح أن الفحص لم يكن مفيدا فقط في التحقق من صحة نشاط تثبيت الخلايا البدينة لعامل دوائي مشار إليه بواسطة المقايسة في الجسم الحي ولكنه كان أيضا عمليا وقابلا للتكرار بدرجة كبيرة.

Introduction

تلعب الخلايا البدينة دورا مركزيا في الحساسية1،2. عندما يواجه IgE الموجود على سطح الخلايا البدينة عبر التفاعل مع المستقبل عالي التقارب ل IgE (FcεRI) مسببات حساسية مماثلة ، يتم استنباط سلسلة إشارات للحث على إطلاق الحبيبات. نتيجة لذلك ، يتم إطلاق مجموعة متنوعة من جزيئات مستجيب الحساسية ، بما في ذلك أحادي الأمين (مثل الهيستامين والسيروتونين) والسيتوكينات (على سبيل المثال ، TNF-α) ، والإنزيمات المحللة للبروتين (على سبيل المثال ، التربتاز والكيمامات) ، لإحداث سلسلة من التفاعلات المناعية والعصبية والأوعية الدمويةالعضلية 3،4.

تسمى فئة من المستحضرات الصيدلانية مثبت الخلايا البدينة الذي يخفف من أعراض الحساسية عن طريق تخفيف وظيفة الخلايا البدينة5. الحساسية المفرطة الجهازية السلبية (PSA) هي نموذج حيواني يستخدم غالبا لاستكشاف نشاط استقرار الخلايا البدينة للعوامل الدوائية. نظرا لأن أعراض الحساسية تنتج في المقام الأول عن تنشيط الخلايا البدينة بعد تفاعل IgE الخاص بالهابتين المنقول بشكل سلبي مع الهابتين على بروتين ناقل يتم حقنه في لاحقا ، فقد تم قبوله جيدا أن العامل الدوائي ذي الأهمية يحمل نشاطا لتثبيت الخلايا البدينة عندما يؤدي علاجه إلى تحسين الأعراض6. ومع ذلك ، غالبا ما يكون من الضروري إثبات ضعف وظيفة الخلية البدينة بشكل مباشر بواسطة العامل في تجربة منفصلة لاستبعاد احتمال أن يكون تحسين الأعراض مشتقا من آلية أخرى غير قمع وظيفة الخلايا البدينة.

مقايسة تحلل الخلايا البدينة ، والتي يتم إجراؤها عن طريق تحفيز الخلايا البدينة بكاشف كيميائي أو مستضد معين من IgE لتشكيل مركب مع FcεRI على سطح الخلايا البدينة للحث على إفراز الخلايا الإفرازية (أي التحلل) ، يستخدم بشكل عام لتحديد نشاط تثبيت الخلايا البدينة لكاشف دوائي في المختبر7. يتم استخدام عدة أنواع من الخلايا في هذا الفحص ، بما في ذلك خط خلايا ابيضاض الدم القاعدي للفئران (RBL)8 ، والخلايا البدينة المشتقة من نخاع العظام (BMMC) 9 ، والخلايا البدينة المشتقة من الخلايا البريتونية (PCMC) 10. في حين أنه مفيد حيث يمكن الحصول على عدد كبير من الخلايا بسهولة ، إلا أن RBL عبارة عن خط خلايا سرطانية خالد لم تعد خصائصه الخلوية أقرب إلى تلك الموجودة في الخلايا البدينة في الجسم. غالبا ما يكون الحصول على عدد كاف من BMMC أو PCMC ، على الرغم من أن خصائصها الخلوية تشبه إلى حد كبير تلك الموجودة في الخلايا البدينة في الجسم ، مكلفا ويستغرق وقتا طويلا.

يعد اختبار التحلل باستخدام الخلايا البدينة الأولية المنقاة بديلا مرغوبافيه 11. ومع ذلك ، فإن استخدام مثل هذا الاختبار ليس منتشرا كطريقة سهلة لتنقية الخلايا البدينة من الأنسجة الحيوانية ، وخاصة من أنسجة الفئران ، ذات الغلة العالية ، والنقاء غير متاح بعد. علاوة على ذلك ، نظرا لأن تركيز ومدة العلاج بعامل دوائي لتثبيط وظيفة الخلايا البدينة في المختبر قد لا يتطابق دائما مع تلك الموجودة في الجسم الحي ، فإن النتائج التي تم الحصول عليها من خلال اختبار التحلل في المختبر قد تشوه تلك الموجودة في اختبار في الجسم الحي مثل PSA ، والعكس صحيح. ومن ثم ، فإن مقايسة التحلل الجديدة ، التي لا تحاكي عن كثب طريقة تنشيط الخلايا البدينة التي تحدث في الجسم الحي فحسب ، بل تعكس أيضا بدقة تأثيرات الكاشف الدوائي الذي يمارس على الخلايا البدينة في الجسم الحي ، مطلوبة بشدة. من أجل تلبية هذه الاحتياجات ، ابتكرنا مقايسة تحلل الخلايا البدينة خارج الجسم الحي حيث يتم تحفيز الخلايا البدينة في الخلايا الإفرازية البريتونية (PECs) المعزولة من الفئران ، والمعالجة بعامل دوائي ذي أهمية ويتم إعطاء IgE الخاص بثنائي نيتروفينول (DNP) مسبقا ، باستخدام ألبومين مصل الأبقار المترافق DNP (BSA).

Protocol

تم إجراء جميع التجارب على وفقا للمبادئ التوجيهية المقدمة من IACUC (اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه) بجامعة تشونغنام الوطنية (رقم بروتوكول: CNU-00996).

1. تحديد الجزيئات الخاصة بالخلايا البدينة في محللة PECs الخام

  1. عزل الخلايا من التجويف البريتوني للفأر12.
    1. تخدير الفأر (8 أسابيع ، ذكر ، BALB / C) باستخدام الأيزوفلوران. القتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم.
    2. ضع الماوس على كتلة رغوية. امسح البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول.
    3. قطع الجلد البطني طوليا باستخدام مقص حافة حادة. انزع جلد الفأر باستخدام الملقط والمقص.
    4. حقن 6 مل من المخزن المؤقت B المثلج Tyrode's13 في التجويف البريتوني باستخدام حقنة سعة 10 مل بإبرة 26 جرام. أدخل الإبرة برفق لتجنب وخز أي أعضاء.
    5. قم بتدليك بطن الفأر لمدة 60-90 ثانية لجمع الخلايا البريتونية في عازلة Tyrode B. افعل ذلك برفق حتى لا تتلف الأوعية الدموية.
    6. أدخل الإبرة (20 جم) المرفقة بحقنة 10 مل شطبة. شفط السائل ببطء من التجويف البريتوني (عادة 5-6 مل).
    7. قم بإزالة الإبرة من المحقنة. استغني عن السائل البريتوني في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. احتفظ بالأنبوب على الجليد.
    8. كرر الخطوات 1.1.4 - 1.1.7.
    9. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 10 درجات مئوية. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من 1x مخزن تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC). احتفظ بالخلايا على الجليد لمدة 3 دقائق.
    10. قم بتخفيف تعليق الخلية ب 2 مل من المخزن المؤقت B لتايرود. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 10 درجات مئوية.
    11. قم بإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في 0.5 مل من المخزن المؤقت A لتيرود13.
    12. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. اضبط رقم الخلية على 5 × 106 / مل باستخدام المخزن المؤقت A من Tyrode.
  2. قم بإعداد PECs المستنفدة من الخلايا البدينة باستخدام نظام تنقية الخلايا المغناطيسية14.
    1. أجهزة الطرد المركزي 5 × 105 PECs الخام عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 10 درجات مئوية. أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتنقية خلايا PBSBE (0.5٪ BSA ، 2 ملي مولار EDTA ، 1 × PBS ، درجة الحموضة 7.4).
    2. أضف 1 ميكرولتر من حاصرات Fc (0.5 مجم / مل) إلى الخلايا لمنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة ل c-kit (mAb) ليتم إضافتها بعد ذلك. احتفظ بالخلايا على الجليد لمدة 5 دقائق.
    3. أضف 1 ميكرولتر من مجموعة c-kit المضادة للفأر المضادة للفأرالبيوتينيل mAb 15 (0.5 مجم / مل). احتفظ بالخلايا على الجليد لمدة 10 دقائق.
    4. أضف 2 مل من المخزن المؤقت PBSBE. الطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 10 درجات مئوية.
    5. قم بإزالة المادة الطافية. اغسل الخلايا مرة أخرى باستخدام 2 مل من المخزن المؤقت PBSBE.
    6. أعد تعليق الخلايا في 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBSBE. أضف 10 ميكرولتر من الميكروبيدات المترافقة بالستربتافيدين. احتفظ بالخلايا على الجليد لمدة 15 دقيقة.
    7. أضف 2 مل من المخزن المؤقت PBSBE. الطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 10 درجات مئوية.
    8. قم بتحميل 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBSBE على عمود مغناطيسي متوسط أثناء الدوران. اسمح للمخزن المؤقت بالتدفق عبر العمود.
    9. قم بإزالة المادة الطافية بعد الطرد المركزي. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBSBE.
    10. قم بتحميل الخلايا الموجودة على العمود. اجمع الخلايا التي تمر بحرية عبر العمود.
    11. اغسل العمود ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBSBE. اجمع الخلايا التي تمر عبر العمود مرة أخرى.
    12. كرر الخطوة 1.2.11.
    13. اجمع الخلايا من الخطوات 1.2.9-1.2.11 في أنبوب واحد. الطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 10 درجات مئوية.
    14. أعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت ل Tyrode. عد الخلايا. اضبط رقم الخلية على 5 × 106 خلايا / مل.
  3. تحضير محللة PECs.
    1. لوحة PECs (على سبيل المثال ، 5 × 105) في صفيحة بئر مستديرة القاع 96 ، على التوالي. الطرد المركزي للوحة عند 300 × جم لمدة دقيقتين عند 10 درجات مئوية لجمع الخلايا. قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام الماصة.
    2. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل الخلية إلى حبيبات الخلية. أعد تعليق الخلايا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات برفق. احتفظ بالطبق على الجليد لمدة 60 دقيقة.
    3. قم بالطرد المركزي للوحة عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 10 درجات مئوية لإزالة حطام الخلية. انقل المادة الطافية (محللة الخلية) إلى صفيحة جديدة 96 بئر.
  4. قياس النشاط الأنزيمي ل β-hexosaminidase16.
    1. أضف محللة الخلية (50 ميكرولتر) إلى محلول الركيزة β-hexosaminidase المسخن مسبقا (50 ميكرولتر) في صفيحة دقيقة 96 بئر. امزجهم برفق باستخدام ماصة.
    2. احتضان اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية. أضف 50 ميكرولتر من محلول التوقف (100 ملي مولار جلايسين ، الرقم الهيدروجيني 10.7) بعد 30 دقيقة لإنهاء تفاعل الإنزيم.
    3. اقرأ OD لمخاليط التفاعل باستخدام قارئ صفيحة دقيقة لامتصاص مرئي للأشعة فوق البنفسجية في إعداد الطول الموجي المزدوج ؛ 405 نانومتر لتحديد مستوى تفاعل الإنزيم و 620 نانومتر للطرح التلقائي للخلفية ، على التوالي.
  5. قياس تركيز الهيستامين17.
    1. نقل 100 ميكرولتر من محللات الخلية التي تم تطهيرها إلى الصفيحة المطلية بمضاد للهيستامين mAb المرفقة بمجموعة ELISA للهيستامين. قم بإجراء اختبار ELISA للهيستامين التنافسي باتباع دليل الشركة المصنعة.
    2. اقرأ OD للعينات باستخدام قارئ صفيحة دقيقة لامتصاص مرئي للأشعة فوق البنفسجية بطول موجي 450 نانومتر.
  6. تحديد نسبة الخلايا البدينة في PECs مع قياس التدفقالخلوي 18.
    1. انقل 1 × 105 PECs الخام أو المستنفد من الخلايا البدينة في صفيحة بئر 96 قاع دائري. جهاز الطرد المركزي للوحة عند 300 × جم لمدة دقيقتين عند 10 درجات مئوية.
    2. أعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. أضف 1 ميكرولتر من مجموعة C المضادة للفأر (0.5 مجم / مل) ومضادة للفأر IgE mAbs (0.5 مجم / مل).
    3. دوامة الخلايا لفترة وجيزة. احتفظ بالخلايا على الجليد لمدة 20 دقيقة في الظلام.
    4. املأ الآبار ب 150 ميكرولتر من محلول FACS. جهاز الطرد المركزي للوحة عند 300 × جم لمدة دقيقتين عند 10 درجات مئوية. تخلص من المخزن المؤقت عن طريق قلب اللوحة بسرعة.
    5. أعد تعليق الخلايا ب 150 ميكرولتر من محلول FACS الذي يحتوي على يوديد البروبيديوم (1 ميكروغرام / مل). تحليل الخلايا باستخدام مقياس التدفق الخلوي.

2. مقايسة تحلل الخلايا البدينة باستخدام PECs الخام

  1. تحديد مدى تحلل الخلايا البدينة (٪ تحلل).
    1. حقن 3 فئران BALB / C (8 أسابيع ، ذكر) عن طريق الوريد (IV) مع 3 ميكروغرام من mAb المضاد ل DNP (IgE للفأر). عزل PECs بعد يوم واحد من حقن Ab (راجع الخطوة 1.1).
    2. صفيحة 90 ميكرولتر من PECs الخام (5.5 × 106 / مل) في صفيحة بئر 96 مسطحة القاع (إجمالي 4 آبار). احتضان اللوحة في حاضنة CO2 المرطبة 37 درجة مئويةلمدة 30 دقيقة.
    3. أضف 10 ميكرولتر من DNP-BSA (5 نانوغرام / مل في 1x PBS) إلى الآبار التي تحتوي على PECs. احتضن اللوحة لمدة 10 دقائق في حاضنة 37 درجة مئوية CO2 .
    4. جهاز الطرد المركزي للوحة عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 10 درجات مئوية مباشرة بعد الحضانة. خذ المواد الطافية (100 ميكرولتر) بعناية باستخدام الماصة. احفظها في طبق بئر جديد مستدير القاع 96 على الجليد.
    5. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل الخلية (0.1٪ Triton X-100 في 1 × PBS ، درجة الحموضة 7.4) إلى آبار الصفيحة الدقيقة التي تحتوي على PECs. احتفظ بالطبق على الجليد لمدة 60 دقيقة.
    6. قم بإجراء فحص β-hexosaminidase.
      1. خذ مجموعتين من المواد الطافية ومحللات الخلية المقابلة ، على التوالي ، من أصل أربع مجموعات تم تخزينها في الجليد بعد مقايسة التحلل (راجع الخطوتين 2.1.4 و 2.1.5). قسم المادة الطافية ومحللة الخلية إلى بئرين منفصلين (50 ميكرولتر لكل منهما) لتكرار الفحص.
      2. أضف 50 ميكرولتر من محلول الركيزة β-hexosaminidase إلى كل بئر. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أضف 50 ميكرولتر من محلول التوقف (100 ملي مولار جلايسين ، الرقم الهيدروجيني 10.7) إلى خليط التفاعل.
      3. اقرأ OD لمخاليط التفاعل (راجع الخطوة 1.4.3). احسب مدى تحلل الخلايا البدينة على النحو التالي.
        النسبة المئوية للتحلل =طافي OD / (طافي OD +محللة OD) × 100٪
    7. إجراء فحص الهيستامين.
      1. أضف 100 ميكرولتر من 1x PBS إلى بئرين آخرين من المواد الطافية ومحللات الخلية المقابلة المحفوظة بعد التحلل ليصل الحجم الإجمالي للعينات إلى 200 ميكرولتر. قسم كل عينة إلى بئرين منفصلين في لوحة ELISA الهيستامين المزودة بمجموعة ELISA الهيستامينية.
      2. قم بإجراء اختبار ELISA باتباع دليل الشركة المصنعة. اقرأ OD للعينات باستخدام قارئ صفيحة دقيقة لامتصاص مرئي للأشعة فوق البنفسجية بطول موجي 450 نانومتر. احسب مدى التحلل كما في 2.1.6.3.
        ٪ تحلل = [الهيستامين] sup / ([الهيستامين] sup + [الهيستامين] المحلل) × 100٪
  2. تقييم آثار الأدوية المضادة للحساسية على الخلايا البدينة التي تمارس في الجسم الحي باستخدام مقايسة تحلل الخلايا البدينة خارج الجسم الحي.
    1. يتم تطبيق 200 ميكرولتر من ديكساميثازون19 (DEX) والكيتوتيفين20 (KET) عن طريق الفم (6 أسابيع، ذكور) مرة واحدة يوميا لمدة 3 أيام (6 فئران/مجموعة).
    2. حقن الفئران عن طريق الوريد (IV) مع 3 ميكروغرام من IgE المضادة ل DNPبعد العلاج 3rd. قسم كل مجموعة من الفئران إلى قفصين منفصلين (3 فئران / قفص) ؛ أحدهما لمقايسة PSA والآخر لمقايسة تحلل الخلايا البدينة خارج الجسم الحي.
    3. إجراء اختبار مستضد البروستاتا النوعي
      1. حقن الفئران مع DNP-BSA (80 ميكروغرام) بعد يوم واحد من حقن IgE المضادة ل DNP. قم بقياس درجة حرارة الجسم باستخدام مقياس حرارة المستقيم كل 15 دقيقة لمدة ساعة واحدة بدءا من حقن DNP-BSA مباشرة.
      2. خذ الدم بعد يوم واحد من حقن DNP-BSA. قياس مستويات MCPT-1 في المصل باستخدام ELISA.
    4. قم بإجراء فحص تحلل الخلايا البدينة خارج الجسم الحي.
      1. عزل PECs من الفئران بعد يوم واحد من حقن IgE المضاد ل DNP. احسب أعداد PECs المعزولة.
      2. صفيحة 90 ميكرولتر من PECs الخام (5.5 × 106 / مل) في صفيحة 96 بئر (4 آبار لكل فأر). احتضان الألواح في حاضنة CO2 مرطب 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      3. أضف 10 ميكرولتر من DNP-BSA (5 نانوغرام / مل). احتضان اللوحة لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية حاضنة ثاني أكسيد الكربونالمرطبة .
      4. جهاز الطرد المركزي للوحة عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 10 درجات مئوية. خذ المواد الطافية (100 ميكرولتر) بعناية ، واترك الخلايا وراءها في الآبار.
      5. أضف 100 ميكرولتر من محلول تحلل الخلايا إلى الآبار. احتضن الطبق على الثلج لمدة 60 دقيقة.
      6. إجراء مقايسة β-hexosaminidase ومقايسة الهيستامين ELISA كما هو موضح في 2.1.6 و 2.1.7. احسب النسبة المئوية لتحلل النسبة المئوية كما في الخطوة 2.1.6.3.

النتائج

تحديد العدد الأمثل من PECs لمقايسة تحلل الخلايا البدينة خارج الجسم الحي

الخلايا البدينة ([ك-كيت]+· تمثل الخلايا الموجبة المزدوجة IgE + 15 حوالي 2٪ فقط من PECs (الشكل 1 أ). بتقدير المستويات القصوى للجزيئات الخاصة بال...

Discussion

إن اكتشاف أن مقايسة تحلل الخلايا البدينة يمكن إجراؤها باستخدام عدد صغير نسبيا من PECs الفئران الخام أمر مهم. على الرغم من أن PECs يجب أن تكون مصدرا ممتازا لخلايا الفئران البدينة الأولية ، إلا أنها تتطلب تنقية الخلايا البدينة في الخلايا البدينة في PECs. على الرغم من أن وسائط تدر...

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

ونشكر السيد وونهي لي والسيدة أونجو لي على مساعدتهما التقنية والإدارية. كما نشكر الدكتورة ثي مينه نغويت نغوين على تعليقاتها المدروسة. تم دعم هذا العمل من خلال المنح البحثية من جامعة تشونغنام الوطنية (منحة أبحاث CNU 2017-2098-01) ومن المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF-2019R1F1A1061894 و NRF-2019M3A9G4067293).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringe1757589701
1.5 mL micro tubeHisolMT-15003
10 mL syringe1757593161
15 mL conical tubeThermo Fisher scientific14-959-53A
20xPBSTech & InnovationBPB-9121-500mL
4-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminideSIGMAN9376
5 mL polystyrene round-bottom tubeLife sciences352003
50 mL conical tubeThermo Fisher scientific14-959-49A
Aluminium FiolBioFactTS1-3330
Anti-mouse CD117(c-kit)Biolegend135129keep at 2-8°C
Anti-mouse IgE mAbsThermo Fisher scientific11-5992-81keep at 2-8°C
Antiti-DNP-IgESIGMAD8406-.2MGkeep at -20°C
CentrifugeHANIL396150
D-(+)-gluouseSIGMAG8270
DexamethasoneSIGMAD2915-100MG
DNP-BSAInvitrogen2079360keep at -20°C
EDTABiofactPB131-500
Fetal Bovine serumThermo Fisher scientific11455035
GelatinSIGMAG1890
GlycineJUNSEI27185-0350
hemocytometerZEISS176045
HEPESThermo Fisher scientific15630130
Histamine ELISA kitAbcamGK3275957-4keep at 2-8°C
Hotplate stirrerLab teachzso-9001
IsofluranceTroikaaI29159
ketotifen fumarate saltSIGMAK2628
MCPT-1 ELISA kitThermo Fisher scientific88-7503-22keep at 2-8°C
Mouse Fc blockBD Biosciences553141keep at 2-8°C
Propidium iodioleSIGMA81845keep at 2-8°C
RBC lysis bufferBiolegend420301
Round-bottom 96 wellSPL-life sciences30096
Single use syringe filterStartoriusag16555
Streptavidin microbeadsMilteryiBiotec130-048-101keep at 2-8°C
Triton X-100JUNSEIchemical49415-1601
TWEEN 20SIGMA9005-64-5
Water bathCHANGSHINSCIENCE190107

References

  1. Amin, K. The role of mast cells in allergic inflammation. Respiratory Medicine. 106 (1), 9-14 (2012).
  2. Holgate, S., et al. The anti-inflammatory effects of omalizumab confirm the central role of IgE in allergic inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 115 (3), 459-465 (2005).
  3. Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nature Medicine. 18 (5), 693 (2012).
  4. Roth, K., Chen, W. M., Lin, T. J. Positive and negative regulatory mechanisms in high-affinity IgE receptor-mediated mast cell activation. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 56 (6), 385-399 (2008).
  5. Finn, D., Walsh, J. Twenty-first century mast cell stabilizers. British Journal of Pharmacology. 170 (1), 23-37 (2013).
  6. Lu, Y., et al. Emodin, a naturally occurring anthraquinone derivative, suppresses IgE-mediated anaphylactic reaction and mast cell activation. Biochemical Pharmacology. 82 (11), 1700-1708 (2011).
  7. Demo, S., et al. Quantitative measurement of mast cell degranulation using a novel flow cytometric annexin-V binding assay. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 36 (4), 340-348 (1999).
  8. Passante, E., Ehrhardt, C., Sheridan, H., Frankish, N. RBL-2H3 cells are an imprecise model for mast cell mediator release. Inflammation Research. 58 (9), 611-618 (2009).
  9. Fukuishi, N., et al. Does β-hexosaminidase function only as a degranulation indicator in mast cells? The primary role of β-hexosaminidase in mast cell granules. The Journal of Immunology. 193 (4), 1886-1894 (2014).
  10. Malbec, O., et al. Peritoneal cell-derived mast cells: an in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells. The Journal of Immunology. 178 (10), 6465-6475 (2007).
  11. Arock, M., Le Nours, A., Malbec, O., Daëron, M. . Innate Immunity. , 241-254 (2008).
  12. Befus, A., Pearce, F., Gauldie, J., Horsewood, P., Bienenstock, J. Mucosal mast cells. I. Isolation and functional characteristics of rat intestinal mast cells. The Journal of Immunology. 128 (6), 2475-2480 (1982).
  13. Yoon, S. C., et al. Anti-allergic and anti-inflammatory effects of aqueous extract of Pogostemon cablin. International Journal of Molecular Medicien. 37 (1), 217-224 (2016).
  14. Mierke, C. T., et al. Human endothelial cells regulate survival and proliferation of human mast cells. Journal of Experimental Medicien. 192 (6), 801-812 (2000).
  15. Hermes, B., et al. Altered expression of mast cell chymase and tryptase and of c-Kit in human cutaneous scar tissue. Journal of Investigative Dermatology. 114 (1), 51-55 (2000).
  16. Wendeler, M., Sandhoff, K. J. Hexosaminidase assays. Glycoconjugate Journal. 26 (8), 945-952 (2009).
  17. Russell, M., et al. Learned histamine release. Science. 225 (4663), 733-734 (1984).
  18. Darzynkiewicz, Z., et al. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry. 13 (8), 795-808 (1992).
  19. Kitamura, Y., et al. Dexamethasone suppresses histamine synthesis by repressing both transcription and activity of HDC in allergic rats. Allergology International. 55 (3), 279-286 (2006).
  20. Grant, S. M., Goa, K. L., Fitton, A., Sorkin, E. M. Ketotifen. A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic use in asthma and allergic disorder. Drugs. 40 (3), 412-448 (1990).
  21. Cook, E., Stahl, J., Barney, N., Graziano, F. Mechanisms of antihistamines and mast cell stabilizers in ocular allergic inflammation. Current Drug Targets-Inflammation & Allergy. 1 (2), 167-180 (2002).
  22. Schoch, C. In vitro inhibition of human conjunctival mast-cell degranulation by ketotifen. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 19 (1), 75-81 (2003).
  23. Franchimont, D., et al. Inhibition of Th1 immune response by glucocorticoids: dexamethasone selectively inhibits IL-12-induced Stat4 phosphorylation in T lymphocytes. The Journal of Immunology. 164 (4), 1768-1774 (2000).
  24. Simmons, C. P., et al. The clinical benefit of adjunctive dexamethasone in tuberculous meningitis is not associated with measurable attenuation of peripheral or local immune responses. The Journal of Immunology. 175 (1), 579-590 (2005).
  25. Cavalher-Machado, S. C., et al. The anti-allergic activity of the acetate fraction of Schinus terebinthifolius leaves in IgE induced mice paw edema and pleurisy. International Immunopharmacology. 8 (11), 1552-1560 (2008).
  26. Dhakal, H., et al. Gomisin M2 inhibits mast cell-mediated allergic inflammation via attenuation of FcεRI-mediated Lyn and Fyn activation and intracellular calcium levels. Frontiers in Pharmacology. 10, 869 (2019).
  27. Galli, S. J., Wedemeyer, J., Tsai, M. Analyzing the roles of mast cells and basophils in host defense and other biological responses. International Journal of Hematology. 75 (4), 363-369 (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

IgE DNP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved