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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Abbiamo stabilito un saggio di degranulazione dei mastociti ex vivo effettuato incubando cellule grezze di essudato peritoneale isolate dai topi, trattate con un agente farmacologico di interesse e precedentemente somministrate IgE anti-dinitrofenolo (DNP), con DNP su una proteina trasportatrice.

Abstract

Gli stabilizzatori dei mastociti sono una parte essenziale dei farmaci per l'allergia. L'anafilassi sistemica passiva (PSA) è un test su animali ampiamente utilizzato per studiare l'effetto di un agente farmacologico di interesse sui mastociti in vivo. Poiché i sintomi anafilattici sono principalmente attribuiti all'esocitosi dei granuli dei mastociti, si ritiene che l'agente che causa il miglioramento dei sintomi abbia un'attività stabilizzante dei mastociti. Nonostante ciò, è prudente confermare l'attività dimostrando direttamente il declino dell'attività funzionale dei mastociti in seguito al suo trattamento. A tal fine vengono regolarmente impiegati saggi di degranulazione in vitro utilizzando una linea di mastociti immortalizzati o mastociti primari in coltura. I risultati dei test in vitro e in vivo potrebbero non essere sempre simili tra loro; tuttavia, poiché le condizioni di trattamento (ad esempio, dose di trattamento, tempo, ambienti circostanti) per i test in vitro sono spesso distinte da quelle per il test in vivo come il PSA. Alla ricerca di un test in vitro (o ex vivo) che riflettesse più da vicino l'effetto di un agente farmacologico sui mastociti in vivo, abbiamo ideato il test di degranulazione dei mastociti ex vivo in cui le cellule grezze di essudato peritoneale (PEC) isolate dai topi, trattate con l'agente e somministrate IgE anti-dinitrofenolo (DNP), sono state incubate direttamente con DNP su una proteina trasportatrice. Si è scoperto che il test non era solo utile per convalidare l'attività stabilizzante dei mastociti di un agente farmacologico indicato dal test in vivo, ma anche pratico e altamente riproducibile.

Introduzione

I mastociti svolgono un ruolo centrale nell'allergia 1,2. Quando le IgE localizzate sulla superficie dei mastociti attraverso l'interazione con il recettore ad alta affinità per le IgE (FcεRI) incontrano un allergene affine, viene suscitata una cascata di segnalazione per indurre il rilascio dei granuli. Di conseguenza, una varietà di molecole effettrici di allergia, tra cui monoammine (ad es. istamina, serotonina), citochine (ad es. TNF-α) ed enzimi proteolitici (ad es. triptasi, chimasi), vengono rilasciate per causare una serie di reazioni immunologiche, neurologiche e vasomuscolari 3,4.

Una classe di farmaci è chiamata stabilizzatore dei mastociti che allevia i sintomi dell'allergia attenuando la funzione dei mastociti5. L'anafilassi sistemica passiva (PSA) è un modello animale spesso utilizzato per sondare l'attività stabilizzante dei mastociti di agenti farmacologici. Poiché i sintomi anafilattici derivano principalmente dall'attivazione dei mastociti in seguito all'interazione delle IgE apten-specifiche trasferite passivamente con l'aptene su una proteina trasportatrice iniettata successivamente nell'animale, è ben noto che un agente farmacologico di interesse ha un'attività stabilizzante dei mastociti quando il suo trattamento risulta in un miglioramento dei sintomi6. Tuttavia, è spesso imperativo dimostrare direttamente la compromissione della funzione dei mastociti da parte dell'agente in un esperimento separato per escludere la possibilità che il miglioramento dei sintomi derivi da un meccanismo diverso dalla soppressione della funzione dei mastociti.

Il saggio di degranulazione dei mastociti, che viene effettuato stimolando i mastociti con un reagente chimico o un antigene specifico di IgE che forma un complesso con FcεRI sulla superficie dei mastociti per indurre l'esocitosi dei granuli secretori (cioè la degranulazione), è generalmente utilizzato per determinare un'attività stabilizzante dei mastociti di un reagente farmacologico in vitro7. In quel test vengono utilizzati diversi tipi di cellule, tra cui la lineacellulare 8 di leucemia basofila (RBL) di ratto, i mastociti derivati dal midollo osseo (BMMC)9 e i mastociti derivati da cellule peritoneali (PCMC)10. Sebbene sia utile in quanto un gran numero di cellule può essere facilmente ottenuto, RBL è una linea cellulare tumorale immortalizzata le cui proprietà cellulari non sono più simili a quelle dei mastociti nel corpo. L'acquisizione di un numero sufficiente di BMMC o PCMC, anche se le loro proprietà cellulari possono assomigliare più da vicino a quelle dei mastociti nel corpo, è spesso costoso e richiede tempo.

Un test di degranulazione che utilizza mastociti primari purificati è un'alternativa desiderabile11. Tuttavia, l'uso di tale test non è diffuso come metodo semplice per purificare i mastociti da tessuti animali, in particolare da tessuti di topo, con un'elevata resa, e la purezza non è ancora disponibile. Inoltre, poiché la concentrazione e la durata del trattamento con un agente farmacologico per inibire la funzione dei mastociti in vitro possono non coincidere sempre con quelle in vivo, i risultati ottenuti con un test di degranulazione in vitro possono travisare quelli di un test in vivo come il PSA e viceversa. Pertanto, un nuovo test di degranulazione, che non solo imita da vicino il modo in cui l'attivazione dei mastociti si manifesta in vivo, ma riflette anche accuratamente gli effetti di un reagente farmacologico esercitato sui mastociti in vivo, è molto richiesto. Al fine di soddisfare queste esigenze, abbiamo ideato un test di degranulazione dei mastociti ex vivo in cui i mastociti in cellule di essudato peritoneale (PEC) isolate dai topi, trattati con un agente farmacologico di interesse e precedentemente somministrati IgE specifiche per il dinitrofenolo (DNP), vengono stimolati con albumina sierica bovina (BSA) coniugata con DNP.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida fornite dall'IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) dell'Università Nazionale di Chungnam (Numero di protocollo animale: CNU-00996).

1. Quantificazione di molecole specifiche dei mastociti nel lisato di PEC grezze

  1. Isolare le cellule dalla cavità peritoneale del topo12.
    1. Anestetizzare un topo (8 settimane di età, maschio, BALB/C) con isoflurano. Eutanasia tramite lussazione cervicale.
    2. Posiziona il mouse su un blocco di schiuma. Pulire l'addome con etanolo al 70%.
    3. Tagliare la pelle ventrale longitudinalmente con le forbici smussate. Staccare la pelle del mouse usando pinze e forbici.
    4. Iniettare 6 mL di tampone B13 ghiacciato di Tyrode nella cavità peritoneale utilizzando una siringa da 10 mL con un ago da 26 G. Inserire delicatamente l'ago per evitare di pungere gli organi.
    5. Massaggiare l'addome del topo per 60-90 s per raccogliere le cellule peritoneali nel tampone B di Tyrode. Fallo delicatamente per non danneggiare i vasi sanguigni.
    6. Inserire l'ago (20 G) collegato a una siringa da 10 mL smussato verso l'alto. Aspirare lentamente il liquido dalla cavità peritoneale (tipicamente 5-6 ml).
    7. Rimuovere l'ago dalla siringa. Erogare il liquido peritoneale in una provetta conica da 50 mL. Mantieni il tubo sul ghiaccio.
    8. Ripetere i passaggi 1.1.4 - 1.1.7.
    9. Centrifugare la provetta a 300 x g per 5 minuti a 10 °C. Risospendere le cellule in 1 mL di tampone di lisi dei globuli rossi (RBC). Tenere le celle sul ghiaccio per 3 minuti.
    10. Diluire la sospensione cellulare con 2 mL di tampone B di Tyrode. Centrifugare la provetta a 300 x g per 5 minuti a 10 °C.
    11. Rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule in 0,5 mL di tampone A13 di Tyrode.
    12. Contare le cellule con un emocitometro. Regolare il numero di cellule a 5 x 106/mL con il tampone A di Tyrode.
  2. Preparare le PEC impoverite dei mastociti utilizzando un sistema di purificazione magnetica delle cellule14.
    1. Centrifugare 5 x 105 PEC grezze a 300 x g per 5 min a 10 °C. Risospendere il pellet in 200 μl di tampone di purificazione cellulare PBSBE (0,5% BSA, 2 mM EDTA, 1 x PBS, pH 7,4).
    2. Aggiungere 1 μL di bloccante Fc (0,5 mg/mL) alle cellule per prevenire il legame non specifico dell'anticorpo monoclonale (mAb) anti-c-kit da aggiungere successivamente. Tenere le celle in ghiaccio per 5 minuti.
    3. Aggiungere 1 μL di c-kit mAb15 biotinilato anti-mouse (0,5 mg/mL). Tenere le celle in ghiaccio per 10 minuti.
    4. Aggiungere 2 ml di tampone PBSBE. Centrifugare le celle a 300 x g per 10 minuti a 10 °C.
    5. Rimuovere il surnatante. Lavare nuovamente le cellule con 2 ml di tampone PBSBE.
    6. Risospendere le cellule in 90 μL di tampone PBSBE. Aggiungere 10 μl di microsfere coniugate con streptavidina. Mantenere le celle in ghiaccio per 15 minuti.
    7. Aggiungere 2 ml di tampone PBSBE. Centrifugare le celle a 300 x g per 10 minuti a 10 °C.
    8. Caricare 500 μL di tampone PBSBE su una colonna magnetica media durante la centrifuga. Consentire al buffer di fluire attraverso la colonna.
    9. Rimuovere il surnatante dopo la centrifugazione. Risospendere le cellule in 500 μL di tampone PBSBE.
    10. Caricare le celle sulla colonna. Raccogli le celle che passano liberamente attraverso la colonna.
    11. Lavare la colonna con 500 μl di tampone PBSBE. Raccogli nuovamente le celle che passano attraverso la colonna.
    12. Ripetere il passaggio 1.2.11.
    13. Combina le celle dei passaggi 1.2.9-1.2.11 in una provetta. Centrifugare le celle a 300 x g per 10 minuti a 10 °C.
    14. Risospendere le celle nel buffer A di Tyrode. Conta le celle. Regolare il numero di celle su 5 x 106 celle/mL.
  3. Preparare il lisato di PEC.
    1. Piastre PEC (ad esempio, 5 x 105) in una piastra a fondo tondo da 96 pozzetti, rispettivamente. Centrifugare la piastra a 300 x g per 2 minuti a 10 °C per raccogliere le cellule. Rimuovere con cura il surnatante con una pipetta.
    2. Aggiungere 100 μl di tampone di lisi cellulare al pellet cellulare. Risospendere le cellule pipettando più volte e delicatamente. Tenere il piatto sul ghiaccio per 60 minuti.
    3. Centrifugare la piastra a 300 x g per 5 minuti a 10 °C per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire il surnatante (il lisato cellulare) in una nuova piastra a 96 pozzetti.
  4. Misurare l'attività enzimatica della β-esosaminidasi16.
    1. Aggiungere il lisato cellulare (50 μL) alla soluzione preriscaldata del substrato della β-esosaminidasi (50 μL) in una micropiastra a 96 pozzetti. Mescolarli delicatamente con una pipetta.
    2. Incubare la piastra in un'incubatrice a 37 °C. Aggiungere 50 μL di soluzione di arresto (100 mM di glicina, pH 10,7) dopo 30 minuti per terminare la reazione enzimatica.
    3. Lettura del diametro esterno delle miscele di reazione con un lettore di micropiastre ad assorbanza UV-visibile con impostazione a doppia lunghezza d'onda; 405 nm per determinare il livello della reazione enzimatica e 620 nm per la sottrazione automatica del fondo, rispettivamente.
  5. Misurare la concentrazione di istamina17.
    1. Trasferire 100 μl di lisati cellulari eliminati sulla piastra rivestita di antistaminico con mAb fornita con il kit ELISA per istamina. Eseguire un test ELISA dell'istamina competitivo seguendo il manuale del produttore.
    2. Lettura del diametro esterno dei campioni con un lettore di micropiastre con assorbanza UV-visibile a lunghezza d'onda di 450 nm.
  6. Determinare il rapporto dei mastociti nelle PEC con la citometria a flusso18.
    1. Trasferire 1 x 105 PEC grezzi o impoveriti di mastopiti in una piastra rotonda a fondo rotondo da 96 pozzetti. Centrifugare la piastra a 300 x g per 2 minuti a 10 °C.
    2. Risospendere le cellule in 50 μl di tampone FACS. Aggiungere 1 μL di c-kit anti-topo (0,5 mg/mL) e anti-mAb IgE di topo (0,5 mg/mL).
    3. Agitare brevemente le cellule. Tenere le celle sul ghiaccio per 20 minuti al buio.
    4. Riempire i pozzetti con 150 μl di tampone FACS. Centrifugare la piastra a 300 x g per 2 minuti a 10 °C. Eliminare il tampone capovolgendo rapidamente la piastra.
    5. Risospendere le cellule con 150 μL di tampone FACS contenente ioduro di propidio (1 μg/mL). Analizzare le cellule con un citometro a flusso.

2. Saggio di degranulazione dei mastociti utilizzando PEC grezze

  1. Determinare l'entità della degranulazione dei mastociti (% di degranulazione).
    1. Iniettare 3 topi BALB/C (8 settimane di età, maschi) per via endovenosa (i.v.) con 3 μg di mAb anti-DNP (IgE di topo). Isolare le PEC un giorno dopo l'iniezione di Ab (fare riferimento al passaggio 1.1).
    2. Piastra 90 μL di PEC grezzi (5,5 x 106/mL) in una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti (totale 4 pozzetti). Incubare la piastra in un incubatore umidificato aCO2 37 oC per 30 minuti.
    3. Aggiungere 10 μL di DNP-BSA (5 ng/mL in 1x PBS) ai pozzetti contenenti PEC. Incubare la piastra per 10 minuti in un incubatore a 37 °C di CO2 .
    4. Centrifugare la piastra a 300 x g per 5 minuti a 10 °C subito dopo l'incubazione. Assumere attentamente i surnatanti (100 μl) con la pipetta. Conservali in una nuova piastra a fondo tondo da 96 pozzetti su ghiaccio.
    5. Aggiungere 100 μL di tampone di lisi cellulare (0,1% Triton X-100 in 1 x PBS, pH 7,4) ai pozzetti della micropiastra contenenti PEC. Tenere il piatto sul ghiaccio per 60 minuti.
    6. Eseguire il test della β-esosaminidasi.
      1. Prelevare rispettivamente due serie di surnatanti e dei corrispondenti lisati cellulari su quattro che sono stati conservati nel ghiaccio dopo il saggio di degranulazione (fare riferimento ai passaggi 2.1.4 e 2.1.5). Dividere il surnatante e il lisato cellulare in due pozzetti separati (50 μl ciascuno) per la duplicazione del saggio.
      2. Aggiungere 50 μl di soluzione di substrato di β-esosaminidasi a ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 °C per 30 minuti. Aggiungere 50 μl di soluzione di arresto (100 mM di glicina, pH 10,7) alla miscela di reazione.
      3. Leggere il diametro esterno delle miscele di reazione (fare riferimento al punto 1.4.3). Calcolare l'entità della degranulazione dei mastociti come segue.
        % Degranulazione =surnatante OD /(surnatante OD +lisato OD) X 100%
    7. Eseguire il dosaggio dell'istamina.
      1. Aggiungere 100 μL di PBS 1x ad altri due pozzetti dei surnatanti e dei corrispondenti lisati cellulari salvati dopo la degranulazione per portare il volume totale dei campioni a 200 μL. Dividere ogni campione in due pozzetti separati in una piastra ELISA per istamina fornita con il kit ELISA per istamina.
      2. Eseguire il test ELISA seguendo il manuale del produttore. Lettura del diametro esterno dei campioni con un lettore di micropiastre con assorbanza UV-visibile a lunghezza d'onda di 450 nm. Calcolare l'entità della degranulazione come al punto 2.1.6.3.
        % Degranulazione = [istamina]sup /([istamina]sup + [istamina]lisato) X 100%
  2. Valutare gli effetti dei farmaci antiallergici sui mastociti esercitati in vivo con il saggio di degranulazione dei mastociti ex vivo.
    1. Somministrare per via orale (p.o.) 200 μL di desametasone19 (DEX) e ketotifen20 (KET), rispettivamente, a topi (6 settimane di età, maschi) una volta al giorno per 3 giorni (6 topi/gruppo).
    2. Iniettare i topi per via endovenosa (e.v.) con 3 μg di IgE anti-DNP dopo il 3° trattamento. Dividi ogni gruppo di topi in due gabbie separate (3 topi/gabbia); uno per il test del PSA e l'altro per il test di degranulazione dei mastociti ex vivo.
    3. Eseguire il test del PSA
      1. Iniettare nei topi DNP-BSA (80 μg) un giorno dopo l'iniezione di IgE anti-DNP. Misurare la temperatura corporea con un termometro rettale ogni 15 minuti per 1 ora a partire immediatamente dall'iniezione di DNP-BSA.
      2. Prelevare il sangue un giorno dopo l'iniezione di DNP-BSA. Misurare i livelli di MCPT-1 nel siero con ELISA.
    4. Eseguire un saggio di degranulazione dei mastociti ex vivo.
      1. Isolare le PEC dai topi un giorno dopo l'iniezione di IgE anti-DNP. Contare il numero di PEC isolate.
      2. Piastra 90 μL di PEC grezzi (5,5 x 106/mL) in una piastra da 96 pozzetti (4 pozzetti per topo). Incubare le piastre in un incubatore aCO2 umidificato a 37 °C per 30 minuti.
      3. Aggiungere 10 μL di DNP-BSA (5 ng/mL). Incubare la piastra per 10 minuti a 37 °C diCO2 umidificata.
      4. Centrifugare la piastra a 300 x g per 5 minuti a 10 °C. Assumere i surnatanti (100 μL) con attenzione, lasciando le cellule nei pozzetti.
      5. Aggiungere 100 μl di tampone di lisi cellulare ai pozzetti. Incubare la piastra con ghiaccio per 60 minuti.
      6. Effettuare il test β-esosaminidasi e il test ELISA dell'istamina come descritto ai punti 2.1.6 e 2.1.7. Calcolare la percentuale di degranulazione come al punto 2.1.6.3.

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Risultati

Determinazione del numero ottimale di PEC per il saggio di degranulazione dei mastociti ex vivo

Mastociti (c-kit+· Le cellule IgE+ doppie positive)15 rappresentano solo il 2% circa delle PEC (Figura 1A). Stimando i livelli massimi di molecole specifiche dei mastociti da rilevare nei surnatanti di coltura, partendo dal presupposto che il 100% dei granuli fosse rilascia...

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Discussione

La scoperta che il saggio di degranulazione dei mastociti può essere effettuato con un numero relativamente piccolo di PEC grezze di topo è significativa. Anche se le PEC devono essere un'ottima fonte di mastociti primari di topo, è impegnativo purificare i mastociti nelle PEC. Sebbene un mezzo a gradiente di densità come il Percoll25 sia stato utilizzato con successo per la purificazione dei mastociti dalle PEC di ratto, il suo uso per la purificazione dei ma...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Ringraziamo il Sig. Wonhee Lee e la Sig.ra Eunjoo Lee per la loro assistenza tecnica e amministrativa. Ringraziamo anche la dottoressa Thi Minh Nguyet Nguyen per i suoi commenti ponderati. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni di ricerca della Chungnam National University (CNU Research Grant 2017-2098-01) e dalla National Research Foundation of Korea (NRF-2019R1F1A1061894 e NRF-2019M3A9G4067293).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringe1757589701
1.5 mL micro tubeHisolMT-15003
10 mL syringe1757593161
15 mL conical tubeThermo Fisher scientific14-959-53A
20xPBSTech & InnovationBPB-9121-500mL
4-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminideSIGMAN9376
5 mL polystyrene round-bottom tubeLife sciences352003
50 mL conical tubeThermo Fisher scientific14-959-49A
Aluminium FiolBioFactTS1-3330
Anti-mouse CD117(c-kit)Biolegend135129keep at 2-8°C
Anti-mouse IgE mAbsThermo Fisher scientific11-5992-81keep at 2-8°C
Antiti-DNP-IgESIGMAD8406-.2MGkeep at -20°C
CentrifugeHANIL396150
D-(+)-gluouseSIGMAG8270
DexamethasoneSIGMAD2915-100MG
DNP-BSAInvitrogen2079360keep at -20°C
EDTABiofactPB131-500
Fetal Bovine serumThermo Fisher scientific11455035
GelatinSIGMAG1890
GlycineJUNSEI27185-0350
hemocytometerZEISS176045
HEPESThermo Fisher scientific15630130
Histamine ELISA kitAbcamGK3275957-4keep at 2-8°C
Hotplate stirrerLab teachzso-9001
IsofluranceTroikaaI29159
ketotifen fumarate saltSIGMAK2628
MCPT-1 ELISA kitThermo Fisher scientific88-7503-22keep at 2-8°C
Mouse Fc blockBD Biosciences553141keep at 2-8°C
Propidium iodioleSIGMA81845keep at 2-8°C
RBC lysis bufferBiolegend420301
Round-bottom 96 wellSPL-life sciences30096
Single use syringe filterStartoriusag16555
Streptavidin microbeadsMilteryiBiotec130-048-101keep at 2-8°C
Triton X-100JUNSEIchemical49415-1601
TWEEN 20SIGMA9005-64-5
Water bathCHANGSHINSCIENCE190107

Riferimenti

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