Un test ex vivo de dégranulation des mastocytes à l’aide de cellules d’exsudat péritonéale brutes et d’une stimulation antigénique naturelle

Résumé

Nous avons mis au point un test de dégranulation ex vivo des mastocytes réalisé en incubant des cellules d’exsudat péritonéale brutes isolées chez la souris, traitées avec un agent pharmacologique d’intérêt et administrées au préalable des IgE anti-dinitrophénols (DNP), avec du DNP sur une protéine porteuse.

Résumé

Les stabilisateurs de mastocytes sont un élément essentiel des médicaments contre les allergies. L’anaphylaxie systémique passive (APS) est un test animal largement utilisé pour étudier l’effet d’un agent pharmacologique d’intérêt sur les mastocytes in vivo. Comme les symptômes anaphylactiques sont principalement attribués à l’exocytose des granules des mastocytes, on conçoit que l’agent qui provoque l’amélioration des symptômes a une activité stabilisatrice des mastocytes. Malgré le fait, il est prudent de confirmer l’activité en démontrant directement le déclin de l’activité fonctionnelle des mastocytes suite à son traitement. Des essais de dégranulation in vitro utilisant une lignée de mastocytes immortalisés ou des mastocytes primaires cultivés sont couramment utilisés à cette fin. Les résultats des essais in vitro et in vivo ne sont pas toujours semblables ; Cependant, les conditions de traitement (p. ex., dose de traitement, temps, environnement environnant) pour les essais in vitro sont souvent distinctes de celles pour les essais in vivo, comme l’APS. Dans le but de réaliser un test in vitro (ou ex vivo) pour refléter plus fidèlement l’effet d’un agent pharmacologique sur les mastocytes in vivo, nous avons conçu le test de dégranulation ex vivo des mastocytes dans lequel des cellules d’exsudat péritonéale (PEC) brutes isolées des souris, traitées avec l’agent et auxquelles on a administré des IgE anti-dinitrophénols (DNP), ont été incubées directement avec du DNP sur une protéine porteuse. Il s’est avéré que le test était non seulement utile pour valider l’activité stabilisatrice des mastocytes d’un agent pharmacologique indiqué par le test in vivo, mais aussi pratique et hautement reproductible.

Introduction

Les mastocytes jouent un rôle central dans l’allergie ^1,2. Lorsque les IgE localisées à la surface des mastocytes via l’interaction avec le récepteur de haute affinité pour les IgE (FcεRI) rencontrent un allergène apparenté, une cascade de signalisation est déclenchée pour provoquer la libération des granules. Par conséquent, diverses molécules effectrices d’allergies, y compris les monoamines (p. ex., histamine, sérotonine), les cytokines (p. ex., TNF-α) et les enzymes protéolytiques (p. ex., tryptase, chymase), sont libérées pour provoquer une série de réactions immunologiques, neurologiques et vasomusculaires ^3,4.

Une classe de produits pharmaceutiques est appelée stabilisateur de mastocytes qui atténue les symptômes d’allergie en atténuant la fonction des mastocytes⁵. L’anaphylaxie systémique passive (APS) est un modèle animal souvent utilisé pour sonder l’activité stabilisatrice des mastocytes des agents pharmacologiques. Comme les symptômes anaphylactiques résultent principalement de l’activation des mastocytes à la suite de l’interaction d’IgE spécifiques de l’haptène passivement transférées avec l’haptène sur une protéine porteuse injectée ultérieurement dans l’animal, il est bien admis qu’un agent pharmacologique d’intérêt a une activité stabilisatrice des mastocytes lorsque son traitement entraîne une amélioration des symptômes⁶. Pourtant, il est souvent impératif de démontrer directement l’altération de la fonction des mastocytes par l’agent dans une expérience distincte afin d’exclure la possibilité que l’amélioration des symptômes soit dérivée d’un mécanisme autre que la suppression de la fonction des mastocytes.

Le dosage de la dégranulation des mastocytes, qui est effectué en stimulant les mastocytes avec un réactif chimique ou un antigène spécifique d’IgE formant un complexe avec le FcεRI à la surface des mastocytes pour induire l’exocytose des granules sécrétoires (c’est-à-dire la dégranulation), est généralement utilisé pour déterminer l’activité stabilisatrice des mastocytes d’un réactif pharmacologique in vitro⁷. Plusieurs types de cellules sont utilisés dans ce test, notamment la lignée cellulaire⁸ de la leucémie basophile du rat (RBL), les mastocytes dérivés de la moelle osseuse (BMMC)⁹ et les mastocytes dérivés des cellules péritonéales (PCMC)¹⁰. Bien qu’utile car un grand nombre de cellules peut être facilement obtenu, RBL est une lignée cellulaire cancéreuse immortalisée dont les propriétés cellulaires ne sont plus similaires à celles des mastocytes dans le corps. L’acquisition d’un nombre suffisant de BMMC ou de PCMC, même si leurs propriétés cellulaires peuvent ressembler davantage à celles des mastocytes dans le corps, est souvent coûteuse et prend du temps.

Un test de dégranulation utilisant des mastocytes primaires purifiés est une alternative souhaitable¹¹. Néanmoins, l’utilisation d’un tel test n’est pas répandue en tant que méthode facile pour purifier les mastocytes des tissus animaux, en particulier des tissus de souris, avec un rendement élevé, et la pureté n’est pas encore disponible. De plus, étant donné que la concentration et la durée du traitement par un agent pharmacologique pour inhiber la fonction des mastocytes in vitro ne coïncident pas toujours avec celles obtenues in vivo, les résultats obtenus avec un test de dégranulation in vitro peuvent fausser ceux d’un test in vivo tel que le PSA, et vice versa. Par conséquent, un nouveau test de dégranulation, qui non seulement imite étroitement la façon dont l’activation des mastocytes se produit in vivo, mais reflète également avec précision les effets d’un réactif pharmacologique exercé sur les mastocytes in vivo, est très demandé. Afin de répondre à ces besoins, nous avons conçu un test de dégranulation des mastocytes ex vivo où les mastocytes dans les cellules exsudatives péritonéales (PEC) isolées des souris, traitées avec un agent pharmacologique d’intérêt et auxquelles on a préalablement administré des IgE spécifiques du dinitrophénol (DNP), sont stimulées avec de l’albumine sérique bovine (BSA) conjuguée au DNP.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux directives fournies par l’IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) de l’Université nationale de Chungnam (numéro de protocole animal : CNU-00996).

1. Quantifier les molécules spécifiques des mastocytes dans le lysat des CEE brutes

1. Isolez les cellules de la cavité péritonéale de la souris¹².
   1. Anesthésier une souris (âgée de 8 semaines, mâle, BALB/C) avec de l’isoflurane. Euthanasier par luxation cervicale.
   2. Placez la souris sur un bloc de mousse. Essuyez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %.
   3. Coupez la peau ventrale longitudinalement avec des ciseaux à bord émoussé. Décollez la peau de la souris à l’aide d’une pince et de ciseaux.
   4. Injecter 6 mL de tampon B¹³ de Tyrode dans la cavité péritonéale à l’aide d’une seringue de 10 mL munie d’une aiguille de 26 G. Insérez l’aiguille doucement pour éviter de piquer des organes.
   5. Massez l’abdomen de la souris pendant 60 à 90 secondes pour recueillir les cellules péritonéales dans le tampon B de Tyrode. Faites-le doucement pour ne pas endommager les vaisseaux sanguins.
   6. Insérez l’aiguille (20 G) fixée à une seringue de 10 mL et levez-la. Aspirez lentement le liquide de la cavité péritonéale (généralement 5 à 6 ml).
   7. Retirez l’aiguille de la seringue. Versez le liquide péritonéal dans un tube conique de 50 ml. Gardez le tube sur de la glace.
   8. Répétez les étapes 1.1.4 à 1.1.7.
   9. Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min à 10 °C. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de 1 tampon de lyse des globules rouges (GR). Gardez les cellules sur la glace pendant 3 min.
   10. Diluez la suspension cellulaire avec 2 mL de tampon B de Tyrode. Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min à 10 °C.
   11. Retirez le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans 0,5 mL de tampon A¹³ de Tyrode.
   12. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Ajustez le numéro de cellule à 5 x 10⁶/mL avec la mémoire tampon A de Tyrode.
2. Préparer des CEE appauvries en mastocytes à l’aide d’un système de purification magnétique^{des cellules 14}.
   1. Centrifugeuse 5 x 10⁵ CEE bruts à 300 x g pendant 5 min à 10 °C. Remettre la pastille en suspension dans 200 μL de tampon de purification cellulaire PBSBE (0,5 % BSA, 2 mM EDTA, 1 x PBS, pH 7,4).
   2. Ajouter 1 μL d’inhibiteur Fc (0,5 mg/mL) dans les cellules pour empêcher la liaison non spécifique de l’anticorps monoclonal (mAb) anti-c-kit à ajouter ensuite. Gardez les cellules sur la glace pendant 5 min.
   3. Ajouter 1 μL de c-kit anti-souris biotinylé mAb¹⁵ (0,5 mg/mL). Gardez les cellules sur de la glace pendant 10 min.
   4. Ajouter 2 mL de tampon PBSBE. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 10 min à 10 °C.
   5. Retirez le surnageant. Lavez à nouveau les cellules avec 2 mL de tampon PBSBE.
   6. Remettre les cellules en suspension dans 90 μL de tampon PBSBE. Ajouter 10 μL de microbilles conjuguées à la streptavidine. Gardez les cellules sur de la glace pendant 15 min.
   7. Ajouter 2 mL de tampon PBSBE. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 10 min à 10 °C.
   8. Chargez 500 μL de tampon PBSBE sur une colonne magnétique moyenne pendant le spin. Laissez la mémoire tampon s’écouler à travers la colonne.
   9. Retirer le surnageant après centrifugation. Remettre les cellules en suspension dans 500 μL de tampon PBSBE.
   10. Chargez les cellules sur la colonne. Récupérez les cellules qui passent librement dans la colonne.
   11. Laver la colonne avec 500 μL de tampon PBSBE. Récupérez à nouveau les cellules passant par la colonne.
   12. Répétez l’étape 1.2.11.
   13. Combinez les cellules des étapes 1.2.9 à 1.2.11 dans un seul tube. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 10 min à 10 °C.
   14. Remettez les cellules en suspension dans le tampon A de Tyrode. Comptez les cellules. Ajustez le numéro de cellule à 5 x 10⁶ cellules/ml.
3. Préparez le lysat des CEE
   1. Plaquez les CEE (p. ex., 5 x 10⁵) dans une plaque à fond rond à 96 puits, respectivement. Centrifuger la plaque à 300 x g pendant 2 min à 10 °C pour recueillir les cellules. Retirez le surnageant avec précaution à l’aide d’une pipette.
   2. Ajouter 100 μL de tampon de lyse cellulaire à la pastille cellulaire. Remettez les cellules en suspension en les pipetant plusieurs fois de haut en bas doucement. Gardez l’assiette sur de la glace pendant 60 min.
   3. Centrifuger la plaque à 300 x g pendant 5 min à 10 °C pour éliminer les débris cellulaires. Transférez le surnageant (le lysat cellulaire) dans une nouvelle plaque à 96 puits.
4. Mesurer l’activité enzymatique de la β-hexosaminidase¹⁶.
   1. Ajouter le lysat cellulaire (50 μL) à une solution de substrat préchauffé de β-hexosaminidase (50 μL) dans une microplaque de 96 puits. Mélangez-les délicatement à l’aide d’une pipette.
   2. Incuber la plaque dans un incubateur à 37 °C. Ajouter 50 μL de solution d’arrêt (100 mM de glycine, pH 10,7) après 30 min pour terminer la réaction enzymatique.
   3. Lire le diamètre extérieur des mélanges réactionnels avec un lecteur de microplaques à absorbance UV-visible en réglage à double longueur d’onde ; 405 nm pour déterminer le niveau de la réaction enzymatique et 620 nm pour la soustraction automatique du bruit de fond, respectivement.
5. Mesurez la concentration d’histamine¹⁷.
   1. Transférez 100 μL des lysats cellulaires éliminés dans la plaque recouverte d’anticorps monoclonaux antihistaminiques fournie avec le kit ELISA d’histamine. Effectuer un test ELISA compétitif de l’histamine en suivant le manuel du fabricant.
   2. Lisez le diamètre extérieur des échantillons à l’aide d’un lecteur de microplaques à absorbance UV-visible à une longueur d’onde de 450 nm.
6. Déterminer le rapport des mastocytes dans les CEE avec la cytométrie en flux¹⁸.
   1. Transvaser 1 x 10⁵ CEE bruts ou appauvris en mastocytes dans une plaque à fond rond à 96 puits. Centrifuger la plaque à 300 x g pendant 2 min à 10 °C.
   2. Remettre les cellules en suspension dans 50 μL de tampon FACS. Ajouter 1 μL de c-kit anti-souris (0,5 mg/mL) et d’anticorps monoclonaux IgE anti-souris (0,5 mg/mL).
   3. Vortex les cellules brièvement. Gardez les cellules sur la glace pendant 20 minutes dans l’obscurité.
   4. Remplissez les puits avec 150 μL de tampon FACS. Centrifuger la plaque à 300 x g pendant 2 min à 10 °C. Jetez le tampon en retournant rapidement la plaque.
   5. Remettre les cellules en suspension avec 150 μL de tampon FACS contenant de l’iodure de propidium (1 μg/mL). Analysez les cellules à l’aide d’un cytomètre en flux.

2. Dosage de la dégranulation des mastocytes à l’aide de CEE bruts

1. Déterminer l’étendue de la dégranulation des mastocytes ( % de dégranulation).
   1. Injecter 3 μg d’anticorps monoclonaux anti-DNP (IgE de souris) chez 3 souris BALB/C (mâles de 8 semaines) avec 3 μg d’anticorps monoclonaux anti-DNP. Isolez les CEE un jour après l’injection d’Ab (voir l’étape 1.1).
   2. Plaque de 90 μL de CEE brut (5,5 x 10⁶/mL) dans une plaque à fond plat de 96 puits (total de 4 puits). Incuber la plaque dans un incubateur de CO₂ humidifié à 37 ^°C pendant 30 minutes.
   3. Ajouter 10 μL de DNP-BSA (5 ng/mL dans 1x PBS) dans les puits contenant des CEE Incuber la plaque pendant 10 min dans un incubateur à 37 °C CO₂ .
   4. Centrifuger la plaque à 300 x g pendant 5 min à 10 °C immédiatement après l’incubation. Prélever délicatement les surnageants (100 μL) à l’aide d’une pipette. Conservez-les dans une nouvelle assiette à fond rond de 96 puits sur de la glace.
   5. Ajouter 100 μL de tampon de lyse cellulaire (0,1 % de Triton X-100 dans 1 x PBS, pH 7,4) dans les puits de microplaques contenant des CEE Gardez l’assiette sur de la glace pendant 60 min.
   6. Effectuer le dosage de la β-hexosaminidase.
      1. Prélever respectivement deux séries de surnageants et les lysats cellulaires correspondants sur quatre qui ont été stockés dans la glace après l’essai de dégranulation (voir les étapes 2.1.4 et 2.1.5). Divisez le surnageant et le lysat cellulaire en deux puits distincts (50 μL chacun) pour la duplication du test.
      2. Ajouter 50 μL de solution de substrat de β-hexosaminidase dans chaque puits. Incuber la plaque à 37 °C pendant 30 min. Ajouter 50 μL de solution stop (100 mM de glycine, pH 10,7) au mélange réactionnel.
      3. Lire D.E. des mélanges réactionnels (se référer à l’étape 1.4.3). Calculez l’étendue de la dégranulation des mastocytes comme suit.
         % de dégranulation =_surnageant de DO /(_surnageant de DO +_lysat de D) X 100 %
   7. Effectuez le dosage de l’histamine.
      1. Ajoutez 100 μL de 1x PBS dans deux autres puits des surnageants et les lysats cellulaires correspondants enregistrés après la dégranulation pour porter le volume total des échantillons à 200 μL. Divisez chaque échantillon dans deux puits distincts dans une plaque ELISA d’histamine fournie avec le kit ELISA d’histamine.
      2. Effectuez le test ELISA en suivant le manuel du fabricant. Lisez le diamètre extérieur des échantillons à l’aide d’un lecteur de microplaques à absorbance UV-visible à une longueur d’onde de 450 nm. Calculer l’étendue de la dégranulation comme indiqué à la section 2.1.6.3.
         % de dégranulation = [histamine]_sup /([histamine]_sup + [histamine]_lysat) X 100 %
2. Évaluer les effets des médicaments antiallergiques sur les mastocytes exercés in vivo à l’aide du test de dégranulation des mastocytes ex vivo.
   1. Administrer par voie orale (p.o.) 200 μL de dexaméthasone¹⁹ (DEX) et de kétotifène²⁰ (KET), respectivement, à des souris (mâles de 6 semaines) une fois par jour pendant 3 jours (6 souris/groupe).
   2. Injectez aux souris par voie intraveineuse (i.v.) 3 μg d’IgE anti-DNP après le 3^ème traitement. Divisez chaque groupe de souris en deux cages distinctes (3 souris/cage) ; l’un pour le dosage de l’APS et l’autre pour le dosage ex vivo de la dégranulation des mastocytes.
   3. Effectuer le dosage de l’APS
      1. Injectez aux souris du DNP-BSA (80 μg) un jour après l’injection d’IgE anti-DNP. Mesurer la température corporelle à l’aide d’un thermomètre rectal toutes les 15 minutes pendant 1 h à partir de l’immédiat après l’injection de DNP-BSA.
      2. Prélever le sang un jour après l’injection de DNP-BSA. Mesurez les niveaux de MCPT-1 dans le sérum avec ELISA.
   4. Effectuer un test de dégranulation des mastocytes ex vivo.
      1. Isolez les CEE des souris un jour après l’injection d’IgE anti-DNP. Comptez le nombre de CEE isolés.
      2. Plaque de 90 μL de CEE brut (5,5 x 10⁶/mL) dans une plaque de 96 puits (4 puits par souris). Incuber les plaques dans un incubateur au CO₂ humidifié à 37 °C pendant 30 min.
      3. Ajouter 10 μL de DNP-BSA (5 ng/mL). Incuber la plaque pendant 10 min à 37 °C dans un incubateur de CO₂ humidifié.
      4. Centrifuger la plaque à 300 x g pendant 5 min à 10 °C. Prélevez les surnageants (100 μL) avec précaution, en laissant les cellules dans les puits.
      5. Ajouter 100 μL de tampon de lyse cellulaire dans les puits. Incuber l’assiette sur de la glace pendant 60 min.
      6. Effectuer le dosage de la β-hexosaminidase et le dosage ELISA de l’histamine comme décrit aux sections 2.1.6 et 2.1.7. Calculez le % de dégranulation comme à l’étape 2.1.6.3.

Résultats

Détermination du nombre optimal de CEE pour l’essai de dégranulation ex vivo des mastocytes

Mastocytes (c-kit⁺· IgE⁺ double positive)¹⁵ ne représentent qu’environ 2 % des CEE (Figure 1A). En estimant les niveaux maximaux de molécules spécifiques des mastocytes à détecter dans les surnageants de culture en supposant que 100 % des granules étaient libérés...

Discussion

La découverte que le test de dégranulation des mastocytes peut être effectué avec un nombre relativement faible de CEE de souris brutes est significative. Même si les CEE doivent être une excellente source de mastocytes primaires de souris, il est difficile de purifier les mastocytes dans les CEE. Bien qu’un milieu à gradient de densité tel que Percoll²⁵ ait été utilisé avec succès pour la purification des mastocytes à partir des CEE de rat, son uti...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe		1757589701
1.5 mL micro tube	Hisol	MT-15003
10 mL syringe		1757593161
15 mL conical tube	Thermo Fisher scientific	14-959-53A
20xPBS	Tech & Innovation	BPB-9121-500mL
4-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide	SIGMA	N9376
5 mL polystyrene round-bottom tube	Life sciences	352003
50 mL conical tube	Thermo Fisher scientific	14-959-49A
Aluminium Fiol	BioFact	TS1-3330
Anti-mouse CD117(c-kit)	Biolegend	135129	keep at 2-8°C
Anti-mouse IgE mAbs	Thermo Fisher scientific	11-5992-81	keep at 2-8°C
Antiti-DNP-IgE	SIGMA	D8406-.2MG	keep at -20°C
Centrifuge	HANIL	396150
D-(+)-gluouse	SIGMA	G8270
Dexamethasone	SIGMA	D2915-100MG
DNP-BSA	Invitrogen	2079360	keep at -20°C
EDTA	Biofact	PB131-500
Fetal Bovine serum	Thermo Fisher scientific	11455035
Gelatin	SIGMA	G1890
Glycine	JUNSEI	27185-0350
hemocytometer	ZEISS	176045
HEPES	Thermo Fisher scientific	15630130
Histamine ELISA kit	Abcam	GK3275957-4	keep at 2-8°C
Hotplate stirrer	Lab teach	zso-9001
Isoflurance	Troikaa	I29159
ketotifen fumarate salt	SIGMA	K2628
MCPT-1 ELISA kit	Thermo Fisher scientific	88-7503-22	keep at 2-8°C
Mouse Fc block	BD Biosciences	553141	keep at 2-8°C
Propidium iodiole	SIGMA	81845	keep at 2-8°C
RBC lysis buffer	Biolegend	420301
Round-bottom 96 well	SPL-life sciences	30096
Single use syringe filter	Startoriusag	16555
Streptavidin microbeads	MilteryiBiotec	130-048-101	keep at 2-8°C
Triton X-100	JUNSEIchemical	49415-1601
TWEEN 20	SIGMA	9005-64-5
Water bath	CHANGSHINSCIENCE	190107