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要約

私たちは、マウスから単離した粗腹膜滲出液細胞をインキュベートし、目的の薬理学的薬剤で処理し、事前に抗ジニトロフェノール(DNP)IgEをキャリアタンパク質にDNPを投与することにより、ex vivo肥満細胞脱顆粒アッセイを確立しました。

要約

肥満細胞安定剤は、アレルギー治療薬の重要な部分です。受動的全身アナフィラキシー(PSA)は、in vivoで肥満細胞に対する目的の薬理学的薬剤の効果を調査するために広く使用されている動物アッセイです。アナフィラキシー症状は主に肥満細胞由来の顆粒のエキソサイトーシスに起因することから、症状の改善を引き起こす薬剤は肥満細胞安定化活性を有すると考えられる。事実にもかかわらず、その治療後の肥満細胞の機能活性の低下を直接示すことによって活性を確認することが賢明です。そのために、不死化マスト細胞株または培養初代マスト細胞を用いたin vitro脱顆粒アッセイが日常的に行われています。in vitro アッセイと in vivo アッセイの結果は、必ずしも互いに類似しているとは限りません。ただし、in vitroアッセイの治療条件(治療用量、時間、周辺環境など)は、PSAなどのin vivoアッセイとは異なることがよくあります。in vivoでの肥満細胞に対する薬理学的薬剤の影響をより密接に反映するin vitro(またはex vivo)アッセイを追求するために、マウスから単離された粗腹膜滲出液細胞(PEC)を薬剤で処理し、抗ジニトロフェノール(DNP)IgEを投与したところ、キャリアタンパク質上でDNPと直接インキュベートするex vivo肥満細胞脱顆粒アッセイを考案しました。その結果、このアッセイは、in vivoアッセイで示された薬理学的薬剤の肥満細胞安定化活性の検証に有用であるだけでなく、実用的で再現性が高いことがわかりました。

概要

肥満細胞はアレルギーにおいて中心的な役割を果たします1,2。高親和性IgE受容体(FcεRI)との相互作用を介して肥満細胞の表面に位置するIgEが同族のアレルゲンに遭遇すると、シグナル伝達カスケードが誘発され、顆粒の放出が促されます。その結果、モノアミン(ヒスタミン、セロトニンなど)、サイトカイン(TNF-αなど)、タンパク質分解酵素(トリプターゼ、キマーゼなど)など、さまざまなアレルギーエフェクター分子が放出され、一連の免疫反応、神経反応、血管筋反応を引き起こします3,4。

医薬品のクラスは、肥満細胞の機能を弱めることによりアレルギー症状を緩和する肥満細胞安定剤と呼ばれます5。受動的全身性アナフィラキシー(PSA)は、薬理学的薬剤の肥満細胞安定化活性を調べるためによく使用される動物モデルです。アナフィラキシー症状は、主に受動的に伝達されたハプテン特異的IgEとハプテンとの相互作用に続くマスト細胞の活性化に起因するため、その治療が症状の改善をもたらす場合、関心のある薬理学的物質がマスト細胞安定化活性を有することはよく受け入れられています6.それでも、症状の改善が肥満細胞機能の抑制以外のメカニズムに由来する可能性を排除するために、別の実験で薬剤による肥満細胞機能の障害を直接示すことがしばしば不可欠です。

マスト細胞の脱顆粒アッセイは、化学試薬またはIgEの特定の抗原でマスト細胞を刺激し、マスト細胞の表面にFcεRIと複合体を形成して分泌顆粒のエキソサイトーシスを誘導すること(すなわち、脱顆粒)によって行われ、一般に、薬理学的試薬のマスト細胞安定化活性をin vitroで測定するために使用されます7。このアッセイでは、ラット好塩基性白血病(RBL)細胞株8、骨髄由来肥満細胞(BMMC)9、腹膜細胞由来肥満細胞(PCMC)10など、いくつかの種類の細胞が使用されます。RBLは、多数の細胞を容易に入手できるという有用性がありますが、不死化がん細胞株であり、その細胞特性はもはや体内の肥満細胞の細胞特性とは異なります。十分な数のBMMCまたはPCMCを取得することは、その細胞特性が体内の肥満細胞の特性により似ている場合でも、多くの場合、費用と時間がかかります。

精製された初代肥満細胞を用いた脱顆粒アッセイは、望ましい代替手段である11。それにもかかわらず、このようなアッセイの使用は、動物組織、特にマウス組織から肥満細胞を高収率で精製するための簡便な方法として普及しておらず、純度はまだ得られていません。さらに、in vitroで肥満細胞の機能を阻害する薬理学的薬剤による治療の濃度と期間は、in vivoのものと必ずしも一致するとは限らないため、in vitroの脱顆粒アッセイで得られた結果は、PSAなどのin vivoアッセイの結果と誤って表現される可能性があり、その逆も同様です。したがって、in vivoで発生する肥満細胞の活性化方法を厳密に模倣するだけでなく、in vivoで肥満細胞に及ぼされる薬理学的試薬の効果を正確に反映する新しい脱顆粒アッセイは、高い需要があります。そこで、マウスから単離した腹膜滲出液細胞(PEC)の肥満細胞を目的の薬理学的薬剤で処理し、事前にジニトロフェノール(DNP)に特異的なIgEを投与した上で、DNP標識ウシ血清アルブミン(BSA)で刺激するex vivoマスト細胞脱顆粒アッセイを考案しました。

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プロトコル

すべての動物実験は、忠南大学校のIACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)のガイドライン(動物プロトコル番号:CNU-00996)に従って行われました。

1. 粗PECのライセート中の肥満細胞特異的分子の定量

  1. マウス腹腔12から細胞を単離する。
    1. マウス(8週齢、雄、BALB/C)にイソフルランを麻酔します。頸部脱臼による安楽死。
    2. マウスを発泡スチロールブロックの上に置きます。腹部を70%エタノールで拭きます。
    3. 鈍いエッジハサミで腹側の皮膚を縦方向に切ります。鉗子とハサミを使用してマウスの皮膚を剥がします。
    4. 26 Gの針が付いた10 mLのシリンジを使用して、6 mLの氷冷Tyrode's Bバッファー13 を腹腔に注入します。.臓器を刺さないように、針をそっと挿入します。
    5. マウスの腹部を60〜90秒間マッサージして、腹膜細胞をTyrodeのBバッファーに集めます。血管を傷つけないように優しく行ってください。
    6. 10mLシリンジのベベルアップに取り付けられた針(20G)を挿入します。腹腔から液体をゆっくりと吸引します(通常は5〜6 mL)。
    7. 注射器から針を取り出します。腹膜液を50mLのコニカルチューブに分注します。チューブを氷の上に保ちます。
    8. 手順1.1.4〜1.1.7を繰り返します。
    9. チューブを300 x g で10°Cで5分間遠心分離します。 細胞を1x赤血球(RBC)溶解バッファー1mLに再懸濁します。細胞を氷上に3分間置きます。
    10. 細胞懸濁液を2 mLのTyrode's Bバッファーで希釈します。チューブを300 x g で10°Cで5分間遠心分離します。
    11. 上清を取り除きます。細胞を0.5 mLのTyrode's Aバッファー13に再懸濁します。
    12. 血球計算盤で細胞を数えます。細胞数を5 x 106/mLに調整し、Tyrode's Aバッファーを使用します。
  2. 磁気細胞精製システム14を用いて、マスト細胞が枯渇したPECを調製する。
    1. 5 x 105 個の粗 PEC を 300 x g で 10 °C で 5 分間遠心分離します。 ペレットを200 μLのPBSBE細胞精製バッファー(0.5% BSA、2 mM EDTA、1 x PBS、pH 7.4)に再懸濁します。
    2. 1 μLのFcブロッカー(0.5 mg/mL)を細胞に添加して、次に添加する抗c-kitモノクローナル抗体(mAb)の非特異的結合を防ぎます。細胞を氷上に5分間置きます。
    3. 1 μL のビオチン化抗マウス c-kitmAb 15 (0.5 mg/mL) を添加します。細胞を氷上に10分間置きます。
    4. PBSBEバッファー2mLを添加します。細胞を300 x g で10分間、10°Cで遠心分離します。
    5. 上清を取り除きます。細胞を2mLのPBSBEバッファーで再度洗浄します。
    6. 細胞を90 μLのPBSBEバッファーに再懸濁します。10 μLのストレプトアビジン標識マイクロビーズを添加します。細胞を氷上に15分間置きます。
    7. PBSBEバッファー2mLを添加します。細胞を300 x g で10分間、10°Cで遠心分離します。
    8. スピン中に500 μLのPBSBEバッファーを中磁気カラムにロードします。バッファーが列を流れるのを待ちます。
    9. 遠心分離後、上清を除去します。細胞を500 μLのPBSBEバッファーに再懸濁します。
    10. 列にセルをロードします。カラムを自由に通過するセルを収集します。
    11. カラムを500 μLのPBSBEバッファーで洗浄します。カラムを通過するセルを再度収集します。
    12. 手順1.2.11を繰り返します。
    13. ステップ1.2.9-1.2.11のセルを1つのチューブに結合します。細胞を300 x g で10分間、10°Cで遠心分離します。
    14. Tyrode の A バッファー内のセルを再懸濁します。セルを数えます。細胞数を5 x 106 細胞/mLに調整します。
  3. PECのライセートを調製します。
    1. プレートPEC(例えば、5 x 105)をそれぞれ丸底の96ウェルプレートに入れます。プレートを300 x g で10°Cで2分間遠心分離し、細胞を回収します。ピペットで上清を慎重に取り除きます。
    2. 細胞ペレットに100 μLの細胞溶解バッファーを添加します。細胞を数回ピペッティングして、穏やかにピペッティングします。プレートを氷の上に置いて60分間保管します。
    3. プレートを300 x g で5分間、10°Cで遠心分離し、細胞の破片を除去します。上清(細胞溶解物)を新しい96ウェルプレートに移します。
  4. β-ヘキソサミニダーゼ16の酵素活性を測定します。
    1. 細胞ライセート(50 μL)を、96ウェルマイクロプレート内の予熱したβ-ヘキソサミニダーゼ基質溶液(50 μL)に加えます。ピペットでやさしく混ぜます。
    2. プレートを37°Cのインキュベーターでインキュベートします。30分後に50 μLの停止溶液(100 mMグリシン、pH 10.7)を加えて、酵素反応を終了します。
    3. 反応混合物のO.D.を、2波長設定の紫外可視吸光度マイクロプレートリーダーで読み取ります。酵素反応のレベルを決定するために405 nm、自動バックグラウンド減算のためにそれぞれ620 nm。
  5. ヒスタミン17の濃度を測定します。
    1. 透明化した細胞ライセート100 μLを、ヒスタミンELISAキットに付属の抗ヒスタミンmAbコーティングプレートに移します。競合するヒスタミンELISAアッセイは、メーカーのマニュアルに従って行ってください。
    2. UV可視吸光度マイクロプレートリーダーでサンプルのO.D.を450nmの波長で読み取ります。
  6. PEC中の肥満細胞の比率をフローサイトメトリーで決定します18。
    1. 1 x 105 の粗細胞またはマスト細胞が枯渇したPECを丸底の96ウェルプレートに移します。プレートを300 x g で10°Cで2分間遠心分離します。
    2. 細胞を50μLのFACSバッファーに再懸濁します。1 μL の抗マウス c-kit (0.5 mg/mL) および抗マウス IgE mAb (0.5 mg/mL) を添加します。
    3. 細胞を短時間ボルテックスします。細胞を暗闇で20分間氷上に保ちます。
    4. ウェルに150μLのFACSバッファーを充填します。プレートを300 x g で10°Cで2分間遠心分離します。 プレートをすばやく裏返して、バッファーを廃棄します。
    5. ヨウ化プロピジウム(1μg/mL)を含む150μLのFACSバッファーで細胞を再懸濁します。フローサイトメーターで細胞を解析します。

2. 粗PECを用いた肥満細胞の脱顆粒アッセイ

  1. 肥満細胞の脱顆粒の程度を決定します(%脱顆粒)。
    1. 3匹のBALB / Cマウス(8週齢、雄)に3μgの抗DNP mAb(マウスIgE)を静脈内(i.v.)注射します。Ab注入の1日後にPECを分離します(ステップ1.1を参照)。
    2. 90 μL の粗 PEC (5.5 x 106/mL) を平底 96 ウェルプレート (合計 4 ウェル) にプレートします。プレートを37 °C加湿CO2 インキュベーターで30分間インキュベートします。
    3. 10 μL の DNP-BSA (1x PBS に 5 ng/mL) を PEC を含むウェルに加えます。プレートを37°CのCO2 インキュベーターで10分間インキュベートします。
    4. インキュベーション直後に、プレートを300 x g で10°Cで5分間遠心分離します。上清(100μL)をピペットで慎重に取ります。氷上の新しい丸底96ウェルプレートに保存します。
    5. 100 μLの細胞溶解バッファー(0.1% Triton X-100 in 1 x PBS、pH 7.4)をPECを含むマイクロプレートウェルに加えます。プレートを氷の上に置いて60分間保管します。
    6. β-ヘキソサミニダーゼアッセイを実施します。
      1. 脱顆粒アッセイ後に氷に保存された4セットの上清と対応する細胞溶解物をそれぞれ2セット取り出します(ステップ2.1.4および2.1.5を参照)。上清と細胞ライセートを2つの別々のウェル(各50 μL)に分割して、アッセイを複製します。
      2. 各ウェルに50 μLのβ-ヘキソサミニダーゼ基質溶液を添加します。プレートを37°Cで30分間インキュベートします。反応混合物に50 μLの停止溶液(100 mMグリシン、pH 10.7)を加えます。
      3. 反応混合物の外径を読み取ります(ステップ1.4.3を参照)。マスト細胞の脱顆粒の程度は次のように計算します。
        % 脱顆粒 = OD上清 / (OD上清 + ODライセート) X 100%
    7. ヒスタミンアッセイを実施します。
      1. 上清の別の2つのウェルに1x PBS100 μLを加え、脱顆粒後に保存された対応する細胞溶解物を加えて、サンプルの総容量を200 μLにします。ヒスタミンELISAキットに付属のヒスタミンELISAプレートで、各サンプルを2つの別々のウェルに分割します。
      2. ELISAアッセイは、メーカーのマニュアルに従って行ってください。UV可視吸光度マイクロプレートリーダーでサンプルのO.D.を450nmの波長で読み取ります。2.1.6.3のように脱粒度を計算します。
        % 脱顆粒 = [ヒスタミン]sup /([ヒスタミン]sup + [ヒスタミン]ライセート) X 100%
  2. ex vivo 肥満細胞脱顆粒アッセイにより、in vivo で発揮される肥満細胞に対する抗アレルギー薬の効果を評価します。
    1. デキサメタゾン19 (DEX)とケトチフェン20 (KET)の200μLをそれぞれマウス(6週齢、雄)に1日1回3日間(6匹/グループ)経口投与します。
    2. 3回目の 治療後、マウスに3μgの抗DNP IgEを静脈内(i.v.)注射します。マウスの各グループを2つの別々のケージ(3匹のマウス/ケージ)に分けます。1つはPSAアッセイ用、もう1つはex vivoマスト細胞脱顆粒アッセイ用です。
    3. PSAアッセイの実施
      1. 抗DNP IgEの注射の1日後にマウスにDNP-BSA(80μg)を注入します。DNP-BSAの注射直後から1時間、直腸体温計で体温を測定します。.
      2. DNP-BSAの注射の1日後に血液を採取します。ELISAを使用して血清中のMCPT-1のレベルを測定します。.
    4. ex vivo 肥満細胞の脱顆粒アッセイを実施します。
      1. 抗DNP IgEの注射の1日後にマウスからPECを分離します。分離されたPECの数を数えます。
      2. 90 μL の粗 PEC (5.5 x 106/mL) を 96 ウェルプレート (マウスあたり 4 ウェル) にプレートします。プレートを37°C加湿CO2 インキュベーターで30分間インキュベートします。
      3. DNP-BSA(5 ng/mL)10 μLを添加します。プレートを37°C加湿CO2 インキュベーターで10分間インキュベートします。
      4. プレートを300 x g で10°Cで5分間遠心分離します。 上清(100μL)を慎重に取り、細胞をウェルに残します。
      5. 100 μLの細胞溶解バッファーをウェルに加えます。プレートを氷上で60分間インキュベートします。
      6. 2.1.6および2.1.7に記載されているように、β-ヘキソサミニダーゼアッセイおよびヒスタミンELISAアッセイを実施します。ステップ2.1.6.3のように脱顆粒率を計算します。

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結果

ex vivo 肥満細胞脱顆粒アッセイに最適な PEC 数の決定

肥満細胞(c-kit+·IgE+ ダブルポジティブセル)15 は、PECの約2%に過ぎません(図1A)。顆粒の100%がPEC中の肥満細胞によって放出されたと仮定して、培養上清中に検出される肥満細胞特異的分子の最大レベルを推定し、異なる数のPEC?...

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ディスカッション

マスト細胞の脱顆粒アッセイが比較的少数の粗マウスPECで実施できるという発見は重要です。PECsは初代マウス肥満細胞の優れた供給源でなければなりませんが、PECsの肥満細胞を精製することは要求されています。Percoll25 のような密度勾配培地は、ラットPECsからの肥満細胞の精製に成功裏に使用されてきましたが、マウス腹膜肥満細胞の精製には?...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

ウォンヒ・リー氏とイ・ウンジュ氏の技術・管理支援に感謝します。また、Thi Minh Nguyet Nguyen博士の思慮深いコメントにも感謝します。本研究は、忠南大学校(CNU Research Grant 2017-2098-01)および韓国国立研究財団(NRF-2019R1F1A1061894およびNRF-2019M3A9G4067293)の研究助成を受けて行われました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringe1757589701
1.5 mL micro tubeHisolMT-15003
10 mL syringe1757593161
15 mL conical tubeThermo Fisher scientific14-959-53A
20xPBSTech & InnovationBPB-9121-500mL
4-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminideSIGMAN9376
5 mL polystyrene round-bottom tubeLife sciences352003
50 mL conical tubeThermo Fisher scientific14-959-49A
Aluminium FiolBioFactTS1-3330
Anti-mouse CD117(c-kit)Biolegend135129keep at 2-8°C
Anti-mouse IgE mAbsThermo Fisher scientific11-5992-81keep at 2-8°C
Antiti-DNP-IgESIGMAD8406-.2MGkeep at -20°C
CentrifugeHANIL396150
D-(+)-gluouseSIGMAG8270
DexamethasoneSIGMAD2915-100MG
DNP-BSAInvitrogen2079360keep at -20°C
EDTABiofactPB131-500
Fetal Bovine serumThermo Fisher scientific11455035
GelatinSIGMAG1890
GlycineJUNSEI27185-0350
hemocytometerZEISS176045
HEPESThermo Fisher scientific15630130
Histamine ELISA kitAbcamGK3275957-4keep at 2-8°C
Hotplate stirrerLab teachzso-9001
IsofluranceTroikaaI29159
ketotifen fumarate saltSIGMAK2628
MCPT-1 ELISA kitThermo Fisher scientific88-7503-22keep at 2-8°C
Mouse Fc blockBD Biosciences553141keep at 2-8°C
Propidium iodioleSIGMA81845keep at 2-8°C
RBC lysis bufferBiolegend420301
Round-bottom 96 wellSPL-life sciences30096
Single use syringe filterStartoriusag16555
Streptavidin microbeadsMilteryiBiotec130-048-101keep at 2-8°C
Triton X-100JUNSEIchemical49415-1601
TWEEN 20SIGMA9005-64-5
Water bathCHANGSHINSCIENCE190107

参考文献

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