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摘要

我们已经建立了离体肥大细胞脱颗粒测定，方法是孵育从小鼠中分离的粗腹膜渗出物细胞，用感兴趣的药理学试剂处理并预先施用抗二硝基苯酚 （DNP） IgE，在载体蛋白上施用 DNP。

摘要

肥大细胞稳定剂是过敏药物的重要组成部分。被动全身性过敏反应 （PSA） 是一种动物试验，广泛用于研究感兴趣的药理学药物对体内肥大细胞的影响。由于过敏症状主要归因于肥大细胞颗粒的胞吐作用，因此认为改善症状的药物具有肥大细胞稳定活性。尽管如此，通过直接证明肥大细胞处理后功能活性的下降来确认活性是谨慎的。为此，通常使用永生化肥大细胞系或培养的原代肥大细胞进行体外脱颗粒测定。体外和体内测定的结果可能并不总是彼此相似;然而，由于体外测定的治疗条件（例如，治疗剂量、时间、周围环境）通常与体内测定（如 PSA）的治疗条件不同。为了追求体外（或离体）测定以更紧密地反映药理学试剂对体内肥大细胞的影响，我们设计了离体肥大细胞脱颗粒测定，其中从小鼠中分离的粗腹膜渗出细胞 （PEC），用该试剂处理并施用抗二硝基苯酚 （DNP） IgE，直接与 DNP 在载体蛋白上孵育。事实证明，该测定不仅有助于验证体内测定指示的药理学试剂的肥大细胞稳定活性，而且实用且具有高度可重复性。

引言

肥大细胞在过敏中起着核心作用 1,2。当通过与 IgE 高亲和力受体 （FcεRI） 相互作用位于肥大细胞表面的 IgE 遇到同源过敏原时，会引发信号级联反应以促使颗粒释放。结果，释放各种过敏效应分子，包括单胺（例如组胺、血清素）、细胞因子（例如 TNF-α）和蛋白水解酶（例如类胰蛋白酶、凝乳酶），以引起一系列免疫、神经和血管反应 3,4。

一类药物称为肥大细胞稳定剂，它通过减弱肥大细胞功能来缓解过敏症状5。被动全身性过敏反应 （PSA） 是一种动物模型，通常用于探测药物的肥大细胞稳定活性。由于过敏症状主要是由于被动转移的半抗原特异性 IgE 与后来注射到动物体内的载体蛋白上的半抗原相互作用后肥大细胞的激活引起的，因此当感兴趣的药理学试剂的治疗导致症状改善时，其具有肥大细胞稳定活性，这是公认的6.尽管如此，通常必须直接在单独的实验中证明药物对肥大细胞功能的损害，以排除症状改善来自抑制肥大细胞功能以外的机制的可能性。

肥大细胞脱颗粒测定是通过用化学试剂或 IgE 的特异性抗原刺激肥大细胞在肥大细胞表面与 FcεRI 形成复合物以诱导分泌颗粒的胞吐作用（即脱颗粒）进行的，通常用于测定体外药理试剂的肥大细胞稳定活性7。该检测使用了几种类型的细胞，包括大鼠嗜碱性白血病 （RBL） 细胞系8、骨髓来源的肥大细胞 （BMMC）9 和腹膜细胞来源的肥大细胞 （PCMC）10。虽然很容易获得大量细胞，因此很有用，但 RBL 是一种永生化癌细胞系，其细胞特性不再类似于体内肥大细胞的细胞特性。获得足够数量的 BMMC 或 PCMC，即使它们的细胞特性可能更接近体内肥大细胞的细胞特性，通常既昂贵又耗时。

使用纯化的原代肥大细胞的脱颗粒测定是一种理想的替代方案11。尽管如此，这种测定法的使用并不广泛，因为这是一种从动物组织（特别是小鼠组织）中纯化肥大细胞的简单方法，产量高，并且纯度尚不可用。此外，由于在体外用药物抑制肥大细胞功能的浓度和持续时间可能并不总是与体内一致，因此通过体外脱颗粒测定获得的结果可能会歪曲体内测定（如 PSA）的结果，反之亦然。因此，一种新型脱颗粒测定法的需求量很大，它不仅密切模拟了肥大细胞活化在体内发生的方式，而且准确反映了药理试剂在体内对肥大细胞的作用。为了满足这些需求，我们设计了一种离体肥大细胞脱颗粒测定法，其中从小鼠中分离的腹膜渗出物细胞 （PEC） 中的肥大细胞，用感兴趣的药理学试剂处理并预先施用对二硝基苯酚 （DNP） 具有特异性的 IgE，用 DNP 偶联的牛血清白蛋白 （BSA） 刺激。

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研究方案

所有动物实验均按照忠南道大学 IACUC（机构动物护理和使用委员会）提供的指南（动物协议编号：CNU-00996）进行。

1. 定量粗 PEC 裂解物中的肥大细胞特异性分子

  1. 从小鼠腹膜腔中分离细胞12.
    1. 用异氟醚麻醉小鼠 （8 周龄，雄性，BALB/C）。通过颈椎脱位实施安乐死。
    2. 将鼠标放在泡沫块上。用 70% 乙醇擦拭腹部。
    3. 用钝边剪刀纵向剪断腹侧皮肤。用镊子和剪刀剥掉老鼠的皮肤。
    4. 使用带有 6 G 针头的 10 mL 注射器将 13 mL 冰冷的 Tyrode B 缓冲液26 注入腹膜腔。轻轻插入针头，以免刺伤任何器官。
    5. 按摩小鼠的腹部 60-90 秒，以将腹膜细胞收集到 Tyrode 的 B 缓冲液中。轻轻地做，不要损伤血管。
    6. 将连接到 10 mL 注射器的针头 （20 G） 斜向上插入。从腹膜腔缓慢吸出液体（通常为 5-6 mL）。
    7. 从注射器中取出针头。将腹膜液分配到 50 mL 锥形管中。将试管放在冰上。
    8. 重复步骤 1.1.4 - 1.1.7。
    9. 将试管在 10 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟。 将细胞重悬于 1 mL 的 1x 红细胞 （RBC） 裂解缓冲液中。将细胞在冰上放置 3 分钟。
    10. 用 2 mL Tyrode 的 B 缓冲液稀释细胞悬液。将试管在 10 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟。
    11. 去除上清液。将细胞重悬于 0.5 mL 的 Tyrode A 缓冲液13 中。
    12. 用血细胞计数器计数细胞。使用 Tyrode 的 A 缓冲液将细胞数量调整为 5 x 106/mL。
  2. 使用磁性细胞纯化系统制备肥大细胞耗尽的 PEC14。
    1. 在 10 °C 下以 300 x g 离心 5 x 105 个粗 PEC，离心 5 分钟。 将沉淀重悬于 200 μL PBSBE 细胞纯化缓冲液（0.5% BSA、2 mM EDTA、1 x PBS，pH 7.4）中。
    2. 向细胞中加入 1 μL Fc 阻滞剂 （0.5 mg/mL），以防止接下来添加的抗 c-kit 单克隆抗体 （mAb） 的非特异性结合。将细胞在冰上放置 5 分钟。
    3. 加入 1 μL 生物素化抗小鼠 c-kit mAb15 （0.5 mg/mL）。将细胞在冰上放置 10 分钟。
    4. 加入 2 mL PBSBE 缓冲液。将细胞在 10 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟。
    5. 去除上清液。用 2 mL PBSBE 缓冲液再次洗涤细胞。
    6. 将细胞重悬于 90 μL PBSBE 缓冲液中。加入 10 μL 链霉亲和素偶联的微珠。将细胞在冰上放置 15 分钟。
    7. 加入 2 mL PBSBE 缓冲液。将细胞在 10 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟。
    8. 在离心过程中，将 500 μL PBSBE 缓冲液加载到中等磁柱上。让缓冲液流过色谱柱。
    9. 离心后去除上清液。将细胞重悬于 500 μL PBSBE 缓冲液中。
    10. 将细胞加载到色谱柱上。收集自由通过色谱柱的细胞。
    11. 用 500 μL PBSBE 缓冲液洗涤色谱柱。再次收集通过色谱柱的单元格。
    12. 重复步骤 1.2.11。
    13. 将步骤 1.2.9-1.2.11 中的细胞合并在一个管中。将细胞在 10 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟。
    14. 在 Tyrode 的 A 缓冲液中重悬细胞。计数细胞。将细胞数量调整为 5 x 106 个细胞/mL。
  3. 准备 PEC 的裂解物。
    1. 分别在圆底 96 孔板中板 PEC（例如，5 x 105）。将板在 10 °C 下以 300 x g 离心 2 分钟以收集细胞。用移液管小心地去除上清液。
    2. 向细胞沉淀中加入 100 μL 细胞裂解缓冲液。通过轻轻上下吹打数次来重悬细胞。将板放在冰上 60 分钟。
    3. 将板在 10 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟以去除细胞碎片。将上清液（细胞裂解物）转移到新的 96 孔板中。
  4. 测量 β-己糖胺酶16 的酶活性。
    1. 将细胞裂解物 （50 μL） 添加到 96 孔微孔板中预热的 β-己糖胺酶底物溶液 （50 μL） 中。用移液管轻轻混合。
    2. 将板在 37 °C 培养箱中孵育。30 分钟后加入 50 μL 终止液（100 mM 甘氨酸，pH 10.7）以终止酶反应。
    3. 在双波长设置下，用紫外可见光吸光度酶标仪读取反应混合物的外径;405 nm 用于测定酶反应水平，620 nm 用于自动背景扣除。
  5. 测量组胺17 的浓度。
    1. 将 100 μL 澄清的细胞裂解物转移到组胺 ELISA 试剂盒随附的抗组胺 mAb 包被板中。按照制造商的手册进行竞争性组胺 ELISA 测定。
    2. 使用 450 nm 波长的紫外可见光吸光度酶标仪读取样品的外径。
  6. 用流式细胞术18 确定 PEC 中肥大细胞的比例。
    1. 在圆底 96 孔板中转移 1 x 105 个粗制或肥大细胞耗尽的 PEC。将板在 10 °C 下以 300 x g 离心 2 分钟。
    2. 将细胞重悬于 50 μL FACS 缓冲液中。添加 1 μL 抗小鼠 c-kit （0.5 mg/mL） 和抗小鼠 IgE mAb （0.5 mg/mL）。
    3. 短暂涡旋细胞。将细胞在冰上避光放置 20 分钟。
    4. 用 150 μL 的 FACS 缓冲液填充孔。将板在 10 °C 下以 300 x g 离心 2 分钟。 通过快速翻转板丢弃缓冲液。
    5. 用 150 μL 含有碘化丙啶 （1 μg/mL） 的 FACS 缓冲液重悬细胞。用流式细胞仪分析细胞。

2. 使用粗 PEC 的肥大细胞脱颗粒测定

  1. 确定肥大细胞脱颗粒的程度（% 脱颗粒）。
    1. 用 3 μg 抗 DNP mAb（小鼠 IgE）静脉注射 3 只 BALB/C 小鼠（8 周龄，雄性）。抗体注射后 1 天分离 PEC（参见步骤 1.1）。
    2. 将 90 μL 粗 PEC （5.5 x 106/mL） 接种在平底 96 孔板（共 4 孔）中。将板在 37 °C 加湿的 CO2 培养箱中孵育 30 分钟。
    3. 向含有 PEC 的孔中加入 10 μL DNP-BSA（5 ng/mL 在 1x PBS 中）。将板在 37 °C CO2 培养箱中孵育 10 分钟。
    4. 孵育后立即在 10 °C 下以 300 x g 离心板 5 分钟。用移液管小心地取上清液 （100 μL）。将它们保存在冰上的新圆底 96 孔板中。
    5. 将 100 μL 细胞裂解缓冲液（0.1% Triton X-100 在 1 x PBS 中，pH 7.4）添加到含有 PEC 的微孔板孔中。将板放在冰上 60 分钟。
    6. 进行 β-己糖酶测定。
      1. 从脱颗粒测定后储存在冰中的四种上清液和相应的细胞裂解物中分别取两组上清液和相应的细胞裂解物（参见步骤 2.1.4 和 2.1.5）。将上清液和细胞裂解物分成两个单独的孔（每个孔 50 μL）以重复检测。
      2. 向每个孔中加入 50 μL β-己糖酶底物溶液。将板在 37 °C 下孵育 30 分钟。向反应混合物中加入 50 μL 终止液（100 mM 甘氨酸，pH 10.7）。
      3. 读取反应混合物的外径（参见步骤1.4.3）。计算肥大细胞脱颗粒的程度如下。
        脱颗粒 % = OD上清液 /（OD上清液 + OD裂解液） X 100%
    7. 进行组胺测定。
      1. 将 100 μL 的 1x PBS 添加到上清液的另外两个孔中，并在脱颗粒后保存相应的细胞裂解物，使样品的总体积达到 200 μL。将每个样品分成组胺 ELISA 试剂盒随附的组胺 ELISA 板中的两个单独的孔。
      2. 按照制造商的手册进行 ELISA 检测。使用 450 nm 波长的紫外可见光吸光度酶标仪读取样品的外径。计算脱颗粒的程度，如 2.1.6.3 所示。
        脱颗粒百分比 = [组胺] sup /（[组胺]sup + [组胺]裂解物） X 100%
  2. 通过离体肥大细胞脱颗粒测定评估抗过敏药物对体内发挥的肥大细胞的影响。
    1. 分别向小鼠（6 周龄，雄性）口服 （po） 200 μL 地塞米松19 （DEX） 和酮替芬20 （KET），每天一次，持续 3 天（6 只小鼠/组）。
    2. 第 3 次处理后，用 3 μg 抗 DNP IgE 静脉内 （i.v.） 注射小鼠。将每组小鼠分成两个单独的笼子（3 只小鼠/笼）;一个用于 PSA 测定，另一个用于离体肥大细胞脱颗粒测定。
    3. 进行 PSA 检测
      1. 注射抗 DNP IgE 后一天，用 DNP-BSA （80 μg） 注射小鼠。注射 DNP-BSA 后立即开始，每 15 分钟用直肠温度计测量体温 1 小时。
      2. 注射 DNP-BSA 后一天取血。用 ELISA 测量血清中 MCPT-1 的水平。
    4. 进行离体肥大细胞脱颗粒测定。
      1. 注射抗 DNP IgE 后一天从小鼠中分离 PEC。计算隔离的 PEC 的数量。
      2. 在 96 孔板（每只小鼠 4 个孔）中接种 90 μL 粗 PEC（5.5 x 106/mL）。将板在 37 °C 加湿的 CO2 培养箱中孵育 30 分钟。
      3. 添加 10 μL DNP-BSA （5 ng/mL）。将板在 37 °C 加湿 CO2 培养箱中孵育 10 分钟。
      4. 将板在 10 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟。 小心地取取上清液 （100 μL），将细胞留在孔中。
      5. 向孔中加入 100 μL 细胞裂解缓冲液。将板在冰上孵育 60 分钟。
      6. 如 2.1.6 和 2.1.7 中所述进行 β-己糖胺酶测定和组胺 ELISA 测定。如步骤 2.1.6.3 中计算 % 脱颗粒。

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结果

确定离体肥大细胞脱颗粒测定的最佳 PEC 数量

肥大细胞 （c-kit+·IgE + 双阳性细胞）15 仅占 PEC 的 2% 左右（图 1A）。假设 PEC 中肥大细胞释放 100% 的颗粒，估计培养上清液中要检测到的肥大细胞特异性分子的最大水平，我们测量了用不同数量的 PEC 制备的总细胞裂解物中 β-己糖胺酶

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讨论

肥大细胞脱颗粒测定可以用相对较少的粗小鼠 PEC 进行，这一发现具有重要意义。尽管 PEC 必须是原代小鼠肥大细胞的极好来源，但纯化 PEC 中的肥大细胞是很高的要求。尽管 Percoll25 等密度梯度培养基已成功用于从大鼠 PEC 中纯化肥大细胞，但其用于纯化小鼠腹膜肥大细胞的使用受到限制，这可能是由于大鼠和小鼠肥大细胞密度的差异。另一种梯度培养?...

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披露声明

作者没有什么可披露的。

致谢

我们感谢 Wonhee Lee 先生和 Eunjoo Lee 女士提供的技术和行政帮助。我们还感谢 Thi Minh Nguyet Nguyen 博士的深思熟虑的评论。这项工作得到了忠清南国立大学（CNU 研究资助 2017-2098-01）和韩国国家研究基金会（NRF-2019R1F1A1061894 和 NRF-2019M3A9G4067293）的研究资助。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringe1757589701
1.5 mL micro tubeHisolMT-15003
10 mL syringe1757593161
15 mL conical tubeThermo Fisher scientific14-959-53A
20xPBSTech & InnovationBPB-9121-500mL
4-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminideSIGMAN9376
5 mL polystyrene round-bottom tubeLife sciences352003
50 mL conical tubeThermo Fisher scientific14-959-49A
Aluminium FiolBioFactTS1-3330
Anti-mouse CD117(c-kit)Biolegend135129keep at 2-8°C
Anti-mouse IgE mAbsThermo Fisher scientific11-5992-81keep at 2-8°C
Antiti-DNP-IgESIGMAD8406-.2MGkeep at -20°C
CentrifugeHANIL396150
D-(+)-gluouseSIGMAG8270
DexamethasoneSIGMAD2915-100MG
DNP-BSAInvitrogen2079360keep at -20°C
EDTABiofactPB131-500
Fetal Bovine serumThermo Fisher scientific11455035
GelatinSIGMAG1890
GlycineJUNSEI27185-0350
hemocytometerZEISS176045
HEPESThermo Fisher scientific15630130
Histamine ELISA kitAbcamGK3275957-4keep at 2-8°C
Hotplate stirrerLab teachzso-9001
IsofluranceTroikaaI29159
ketotifen fumarate saltSIGMAK2628
MCPT-1 ELISA kitThermo Fisher scientific88-7503-22keep at 2-8°C
Mouse Fc blockBD Biosciences553141keep at 2-8°C
Propidium iodioleSIGMA81845keep at 2-8°C
RBC lysis bufferBiolegend420301
Round-bottom 96 wellSPL-life sciences30096
Single use syringe filterStartoriusag16555
Streptavidin microbeadsMilteryiBiotec130-048-101keep at 2-8°C
Triton X-100JUNSEIchemical49415-1601
TWEEN 20SIGMA9005-64-5
Water bathCHANGSHINSCIENCE190107

参考文献

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