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요약

당사는 마우스에서 분리한 미가공 복막 삼출물 세포를 배양하고, 관심 약리제로 처리하고, 운반체 단백질에 DNP를 사용하여 미리 항디니트로페놀(DNP) IgE를 투여하여 수행하는 생체 외 비만 세포 탈과립 분석을 확립했습니다.

초록

비만세포 안정제는 알레르기 약물의 필수적인 부분입니다. 수동태 전신 아나필락시스(PSA)는 생체 내에서 비만 세포에 대한 관심 약리학적 제제의 효과를 조사하는 데 널리 사용되는 동물 분석법입니다. 아나필락시스 증상은 주로 비만세포에서 추출한 과립의 외세포작용(exocytosis)에 기인하기 때문에, 증상을 완화시키는 물질은 비만세포를 안정화시키는 활성을 갖는 것으로 생각된다. 그럼에도 불구하고, 치료 후 비만 세포의 기능적 활성이 감소하는 것을 직접 입증하여 활성을 확인하는 것이 현명합니다. 이를 위해 불멸화된 비만 세포주 또는 배양된 1차 비만 세포를 사용하는 체외 탈과립 분석이 일상적으로 사용됩니다. in vitro 및 in vivo 분석의 결과가 항상 서로 유사한 것은 아닙니다. 그러나 in vitro assay의 처리 조건(예: treatment dose, time, 주변 환경)은 PSA와 같은 in vivo assay의 처리 조건과 구별되는 경우가 많습니다. in vivo 세포에 대한 약리학적 제제의 효과를 보다 밀접하게 반영하기 위한 in vitro(또는 ex vivo) 분석을 추구하기 위해, 당사는 마우스에서 분리한 조잡한 복막 삼출물 세포(PEC)를 제제로 처리하고 항-디니트로페놀(DNP) IgE를 투여한 후 운반체 단백질에서 DNP와 함께 직접 배양하는 ex vivo 비만 세포 탈과립 분석을 고안했습니다. 이 분석법은 in vivo 분석에 의해 표시된 약리학적 제제의 비만 세포 안정화 활성을 검증하는 데 유용할 뿐만 아니라 실용적이고 재현성이 높은 것으로 나타났습니다.

서문

비만 세포는 알레르기에서 중심적인 역할을 합니다 1,2. IgE에 대한 친화성이 높은 수용체(FcεRI)와의 상호작용을 통해 비만 세포 표면에 위치한 IgE가 동족 알레르기 항원을 만나면 신호 연쇄 반응이 유도되어 과립의 방출을 촉진합니다. 그 결과, 모노아민(예: 히스타민, 세로토닌), 사이토카인(예: TNF-α) 및 단백질 분해 효소(예: 트립타제, 키마제)를 포함한 다양한 알레르기 효과 분자가 방출되어 일련의 면역학적, 신경학적 및 혈관근 반응을 일으킵니다 3,4.

비만 세포 안정제(mast cell stabilizer)라고 하는 의약품 종류는 비만 세포 기능을 약화시켜 알레르기 증상을 완화합니다5. 수동적 전신 아나필락시스(PSA)는 약리학적 제제의 비만 세포 안정화 활성을 조사하는 데 자주 사용되는 동물 모델입니다. 아나필락시스 증상은 주로 수동적으로 전달된 합텐 특이적 IgE와 나중에 동물에 주입된 운반 단백질의 합텐의 상호 작용에 따른 비만세포의 활성화로 인해 발생하기 때문에, 관심 약리학적 제제의 치료가 증상의 개선으로 이어질 때 비만세포 안정화 활성을 지닌다는 것은 잘 받아들여지고 있습니다6. 그럼에도 불구하고, 증상의 개선이 비만 세포 기능의 억제 이외의 메커니즘에서 파생될 가능성을 배제하기 위해 별도의 실험에서 제제에 의한 비만 세포 기능의 손상을 직접 입증하는 것이 필수적인 경우가 많습니다.

비만 세포 표면에 FcεRI와 복합체를 형성하는 IgE의 특정 항원 또는 화학 시약으로 비만 세포를 자극하여 분비 과립의 외세포작용(즉, 탈과립)을 유도하는 방식으로 수행되는 비만 세포 탈과립 분석법은 일반적으로 in vitro7 약리학 시약의 비만 세포 안정화 활성을 측정하는 데 사용됩니다. 이 분석에는 쥐 호염기성 백혈병(RBL) 세포주8, 골수 유래 비만 세포(BMMC)9 및 복막 세포 유래 비만 세포(PCMC)10를 포함한 여러 유형의 세포가 사용됩니다. RBL은 많은 수의 세포를 쉽게 얻을 수 있기 때문에 유용하지만, 세포 특성이 더 이상 신체의 비만 세포와 유사하지 않은 불멸의 암 세포주입니다. 충분한 수의 BMMC 또는 PCMC를 획득하는 것은 세포 특성이 신체의 비만 세포와 더 유사할 수 있음에도 불구하고 종종 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸립니다.

정제된 1차 비만 세포를 사용한 탈과립 분석법은 바람직한 대안입니다11. 그럼에도 불구하고, 이러한 분석법의 사용은 동물 조직, 특히 마우스 조직에서 비만 세포를 높은 수율로 정제하기 위한 손쉬운 방법으로 널리 보급되어 있지 않으며 순도는 아직 사용할 수 없습니다. 더욱이, 비만 세포 기능을 in vitro에서 억제하기 위한 약리학적 제제를 사용한 치료의 농도 및 기간이 in vivo와 항상 일치하지 않을 수 있기 때문에 in vitro 탈과립 분석으로 얻은 결과는 PSA와 같은 in vivo 분석의 결과를 잘못 나타낼 수 있으며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 따라서 생체 내에서 발생하는 비만 세포 활성화 방식을 밀접하게 모방할 뿐만 아니라 생체 내 비만 세포에 가해지는 약리학적 시약의 효과를 정확하게 반영하는 새로운 탈과립 분석에 대한 수요가 높습니다. 이러한 요구를 충족하기 위해 당사는 마우스에서 분리한 복막 삼출액 세포(PEC)의 비만 세포를 관심 약리제로 처리한 후 사전에 디니트로페놀(DNP)에 특이적인 IgE를 투여한 후 DNP 접합 소 혈청 알부민(BSA)으로 자극하는 생체 외 비만 세포 탈과립 분석을 고안했습니다.

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프로토콜

모든 동물실험은 충남대학교 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 제공한 지침(동물의정서번호: CNU-00996)에 따라 수행되었다.

1. 미처리 PEC의 용해물에서 비만 세포 특이적 분자 정량화

  1. 마우스 복막강(peritoneal cavity)12에서 세포를 분리한다.
    1. 생쥐(생후 8주령, 수컷, BALB/C)를 이소플루란으로 마취합니다. 경추 탈구를 통해 안락사시킵니다.
    2. 폼 블록에 마우스를 놓습니다. 70% 에탄올로 복부를 닦습니다.
    3. 뭉툭한 가장자리 가위로 복부 피부를 세로로 자릅니다. 집게와 가위를 사용하여 마우스의 피부를 벗겨냅니다.
    4. 10mL 주사기와 26G 바늘을 사용하여 얼음처럼 차가운 Tyrode의 B 버퍼13 6mL를 복강에 주입합니다. 장기를 찌르지 않도록 바늘을 부드럽게 삽입하십시오.
    5. 마우스의 복부를 60-90초 동안 마사지하여 복막 세포를 Tyrode의 B 완충액으로 모읍니다. 혈관이 손상되지 않도록 부드럽게 하십시오.
    6. 10mL 주사기에 부착된 바늘(20G)을 삽입하여 베벨을 위로 향하게 합니다. 복막강에서 액체를 천천히 흡인합니다(일반적으로 5-6mL).
    7. 주사기에서 바늘을 제거합니다. 복막액을 50mL 원뿔형 튜브에 분주합니다. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
    8. 1.1.4 - 1.1.7단계를 반복합니다.
    9. 튜브를 300 x g 에서 10°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 1 mL의 1x 적혈구(RBC) 용해 완충액에 세포를 재현탁합니다. 세포를 얼음 위에 3분 동안 두십시오.
    10. 세포 현탁액을 Tyrode의 B 완충액 2mL로 희석합니다. 튜브를 300 x g 에서 10°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
    11. 상층액을 제거합니다. 0.5mL의 Tyrode's A buffer13에 세포를 재현탁시킵니다.
    12. 혈구계로 세포를 세십시오. Tyrode의 A 버퍼를 사용하여 셀 수를 5 x 106/mL로 조정합니다.
  2. 자기 세포 정제 시스템을 사용하여 비만 세포가 고갈된 PEC를 준비합니다14.
    1. 원심분리기 5 x 10 5 조PECs를 300 x g에서 10 °C에서 5분 동안 사용합니다. 200μL의 PBSBE 세포 정제 완충액(0.5% BSA, 2mM EDTA, 1 x PBS, pH 7.4)에 펠릿을 재현탁합니다.
    2. 세포에 1μL의 Fc 차단제(0.5mg/mL)를 추가하여 다음에 추가될 anti-c-kit 단일클론 항체(mAb)의 비특이적 결합을 방지합니다. 세포를 얼음 위에 5분 동안 두십시오.
    3. 1μL의 비오틴화 안티 마우스 c-kit mAb15 (0.5mg/mL)를 추가합니다. 셀을 10분 동안 얼음 위에 두십시오.
    4. PBSBE 완충액 2mL를 추가합니다. 300 x g 에서 10°C에서 10분 동안 셀을 원심분리합니다.
    5. 상층액을 제거합니다. PBSBE 완충액 2mL로 세포를 다시 세척합니다.
    6. 90μL의 PBSBE 완충액에 세포를 재현탁합니다. 10μL의 스트렙타비딘 접합 마이크로비드를 추가합니다. 세포를 15분 동안 얼음 위에 두십시오.
    7. PBSBE 완충액 2mL를 추가합니다. 300 x g 에서 10°C에서 10분 동안 셀을 원심분리합니다.
    8. 스핀 중에 중간 마그네틱 컬럼에 500μL의 PBSBE 버퍼를 로드합니다. 버퍼가 열을 통해 흐르도록 허용합니다.
    9. 원심분리 후 상층액을 제거합니다. 500μL의 PBSBE 완충액에 세포를 재현탁합니다.
    10. 열에 셀을 로드합니다. 컬럼을 자유롭게 통과하는 셀을 수집합니다.
    11. 500μL의 PBSBE 완충액으로 컬럼을 세척합니다. 열을 통과하는 셀을 다시 수집합니다.
    12. 1.2.11단계를 반복합니다.
    13. 1.2.9-1.2.11 단계의 셀을 하나의 튜브에 결합합니다. 300 x g 에서 10°C에서 10분 동안 셀을 원심분리합니다.
    14. Tyrode의 A 버퍼에서 셀을 다시 suspend합니다. 세포를 세십시오. 셀 수를 5 x 106 cells/mL로 조정합니다.
  3. PEC의 용해물을 준비합니다.
    1. 플레이트 PEC(예: 5 x 105)를 각각 둥근 바닥 96웰 플레이트에 넣습니다. 300 x g 에서 10°C에서 2분 동안 플레이트를 원심분리하여 세포를 수집합니다. 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
    2. 세포 펠릿에 100μL의 세포 용해 완충액을 추가합니다. 여러 번 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 세포를 재현탁시킵니다. 접시를 얼음 위에 60분 동안 보관합니다.
    3. 300 x g 에서 10°C에서 5분 동안 플레이트를 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. 상층액(세포 용해물)을 새로운 96웰 플레이트로 옮깁니다.
  4. β-hexosaminidase16의 효소 활성을 측정합니다.
    1. 96웰 마이크로플레이트에서 예열된 β-hexosaminidase 기질 용액(50μL)에 세포 용해물(50μL)을 추가합니다. 피펫으로 부드럽게 섞으십시오.
    2. 37°C 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다. 30분 후 50μL의 정지 용액(100mM 글리신, pH 10.7)을 첨가하여 효소 반응을 종료합니다.
    3. 이중 파장 설정에서 UV-VIS 흡광도 마이크로플레이트 리더를 사용한 반응 혼합물의 O.D.를 판독합니다. 효소 반응 수준을 결정하기 위한 405nm와 자동 배경 빼기를 위한 620nm.
  5. 히스타민의 농도를 측정하십시오17.
    1. 투명화된 세포 용해물 100μL를 히스타민 ELISA 키트와 함께 제공된 항히스타민 mAb로 코팅된 플레이트로 옮깁니다. 제조업체의 설명서에 따라 경쟁력 있는 히스타민 ELISA 분석을 수행합니다.
    2. 450nm 파장에서 UV-VIS 흡광도 마이크로플레이트 리더로 샘플의 O.D.를 판독합니다.
  6. 유세포분석을 통한 PEC의 비만세포 비율을 측정합니다18.
    1. 1 x 105 조잡한 또는 비스트 셀이 고갈된 PEC를 둥근 바닥 96 웰 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 300 x g 에서 10°C에서 2분 동안 원심분리합니다.
    2. 50μL의 FACS 완충액에 세포를 재현탁합니다. 1μL의 anti-mouse c-kit(0.5mg/mL) 및 anti-mouse IgE mAb(0.5mg/mL)를 추가합니다.
    3. 세포를 잠시 소용돌이치십시오. 어둠 속에서 20분 동안 세포를 얼음 위에 두십시오.
    4. 웰에 150μL의 FACS 완충액을 채웁니다. 플레이트를 300 x g 에서 10°C에서 2분 동안 원심분리합니다. 플레이트를 빠르게 뒤집어 버퍼를 버립니다.
    5. 프로피듐 요오드화물(1μg/mL)을 함유한 150μL의 FACS 완충액으로 세포를 재현탁합니다. 유세포 분석기로 세포를 분석합니다.

2. 조잡한 PEC를 사용한 비만 세포 탈과립 분석

  1. 비만 세포 탈과립(% degranulation)의 정도를 측정합니다.
    1. BALB/C 마우스 3마리(생후 8주령, 수컷) 3마리에게 3μg의 anti-DNP mAb(마우스 IgE)를 정맥 주사합니다. Ab 주사 후 하루 후에 PEC를 분리합니다(1.1단계 참조).
    2. 90μL의 조PEC(5.5 x 106/mL)를 평평한 바닥 96웰 플레이트(총 4웰)에 플레이트합니다. 37 oC 가습 CO2 인큐베이터에서 30 분 동안 플레이트를 배양합니다.
    3. PEC가 포함된 웰에 10μL의 DNP-BSA(1x PBS에서 5ng/mL)를 추가합니다. 37°C CO2 인큐베이터에서 10분 동안 플레이트를 배양합니다.
    4. 배양 직후 300 x g 에서 10°C에서 5분 동안 플레이트를 원심분리합니다. 피펫으로 상층액(100 μL)을 조심스럽게 복용합니다. 얼음 위의 새로운 둥근 바닥 96 웰 플레이트에 보관하십시오.
    5. PEC가 포함된 마이크로플레이트 웰에 100μL의 세포 용해 완충액(1 x PBS의 0.1% Triton X-100, pH 7.4)을 추가합니다. 접시를 얼음 위에 60분 동안 보관합니다.
    6. β-hexosaminidase 분석을 수행합니다.
      1. 탈과립 분석 후 얼음에 보관된 4개 중 2세트의 상등액과 해당 세포 용해물을 각각 취합니다(2.1.4 및 2.1.5 단계 참조). 분석 복제를 위해 상등액과 세포 용해물을 두 개의 별도 웰(각각 50μL)로 분리합니다.
      2. 각 웰에 50μL의 β-hexosaminidase 기질 용액을 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 반응 혼합물에 50μL의 정지 용액(100mM 글리신, pH 10.7)을 추가합니다.
      3. 반응 혼합물의 O.D.를 읽습니다(단계 1.4.3 참조). 다음과 같이 비만 세포 탈과립의 정도를 계산합니다.
        % 탈과립 = OD상등액 / (OD상등액 + OD용해물) X 100 %
    7. 히스타민 분석을 수행합니다.
      1. 100μL의 1x PBS를 상층액의 다른 두 웰과 탈과립 후 저장된 해당 세포 용해물에 추가하여 샘플의 총 부피를 200μL로 만듭니다. 각 샘플을 히스타민 ELISA 키트와 함께 제공된 히스타민 ELISA 플레이트에 있는 두 개의 별도 웰로 나눕니다.
      2. 제조업체의 설명서에 따라 ELISA 분석을 수행합니다. 450nm 파장에서 UV-VIS 흡광도 마이크로플레이트 리더로 샘플의 O.D.를 판독합니다. 2.1.6.3과 같이 탈과립의 정도를 계산합니다.
        % 탈과립 = [히스타민]sup /([히스타민]sup + [히스타민]용해물) X 100%
  2. ex vivo 비만 세포 탈과립 분석을 통해 in vivo에서 발휘된 비만 세포에 대한 항알레르기 약물의 효과를 평가합니다.
    1. 덱사메타손19 (DEX) 및 케토티펜20(KET) 200μL 를 마우스(6주령, 수컷)에게 3일 동안 하루에 한 번씩 경구(p.o.) 투여합니다(6마리/그룹).
    2. 3차 치료 후 3μg의 항DNP IgE를 마우스에 정맥 주사(i.v.)합니다. 각 마우스 그룹을 두 개의 개별 케이지(3개의 마우스/케이지)로 나눕니다. 하나는 PSA 분석용이고 다른 하나는 ex vivo 비만 세포 탈과립 분석용입니다.
    3. PSA 분석 수행
      1. 항-DNP IgE 주입 하루 후 1일 후에 DNP-BSA(80μg)를 마우스에 주입합니다. DNP-BSA 주사 직후부터 1시간 동안 15분마다 직장 체온계로 체온을 측정합니다.
      2. DNP-BSA의 주입 후에 1 일 혈액을 가지고 가십시오. ELISA로 혈청 내 MCPT-1 수치를 측정합니다.
    4. ex vivo 비만 세포 탈과립 분석을 수행합니다.
      1. 항-DNP IgE 주입 하루 후 마우스에서 PEC를 분리합니다. 격리된 PEC의 수를 계산합니다.
      2. 96웰 플레이트(마우스당 4웰)에 90μL의 미처리 PEC(5.5 x10 6/mL)를 플레이트화합니다. 37°C 가습된 CO2 인큐베이터에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다.
      3. DNP-BSA 10μL(5ng/mL)를 추가합니다. 37°C 가습 CO2 인큐베이터에서 10분 동안 플레이트를 배양합니다.
      4. 플레이트를 300 x g 에서 10°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액(100μL)을 조심스럽게 취하고 세포는 웰에 남겨둡니다.
      5. 100μL의 세포 용해 완충액을 웰에 추가합니다. 얼음 위에서 60분 동안 접시를 배양합니다.
      6. 2.1.6 및 2.1.7에 설명된 대로 β-hexosaminidase 분석 및 histamine ELISA 분석을 수행합니다. 2.1.6.3단계에서와 같이 % 탈과립을 계산합니다.

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결과

ex vivo mast cell degranulation assay를 위한 최적의 PEC 수 결정

비만 세포(c-kit+· IgE+ 이중 양성 세포)15 는 PEC의 약 2%에 불과합니다(그림 1A). PEC의 비만 세포에 의해 과립이 100% 방출된다는 가정하에 배양 상등액에서 검출될 수 있는 비만 세포 특이적 분자의 최대 수준을 추정하고, 서로 다른...

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토론

비만 세포 탈과립 분석이 상대적으로 적은 수의 조잡한 마우스 PEC로 수행될 수 있다는 발견은 중요합니다. PEC는 1차 마우스 비만 세포의 훌륭한 공급원임에 틀림없지만, PEC에서 비만 세포를 정제하는 것이 까다롭습니다. Percoll25 와 같은 밀도 구배 배지는 쥐 PEC에서 비만 세포를 정제하는 데 성공적으로 사용되었지만, 쥐 복막 비만 세포의 정제를 위한 사...

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공개

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 말

이원희 씨와 이은주 씨의 기술적, 행정적 도움에 감사드립니다. 또한 Thi Minh Nguyet Nguyen 박사의 사려 깊은 의견에 감사드립니다. 본 연구는 충남대학교의 연구비(CNU 연구비 2017-2098-01)와 한국연구재단의 연구비(NRF-2019R1F1A1061894, NRF-2019M3A9G4067293)의 지원을 받았다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringe1757589701
1.5 mL micro tubeHisolMT-15003
10 mL syringe1757593161
15 mL conical tubeThermo Fisher scientific14-959-53A
20xPBSTech & InnovationBPB-9121-500mL
4-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminideSIGMAN9376
5 mL polystyrene round-bottom tubeLife sciences352003
50 mL conical tubeThermo Fisher scientific14-959-49A
Aluminium FiolBioFactTS1-3330
Anti-mouse CD117(c-kit)Biolegend135129keep at 2-8°C
Anti-mouse IgE mAbsThermo Fisher scientific11-5992-81keep at 2-8°C
Antiti-DNP-IgESIGMAD8406-.2MGkeep at -20°C
CentrifugeHANIL396150
D-(+)-gluouseSIGMAG8270
DexamethasoneSIGMAD2915-100MG
DNP-BSAInvitrogen2079360keep at -20°C
EDTABiofactPB131-500
Fetal Bovine serumThermo Fisher scientific11455035
GelatinSIGMAG1890
GlycineJUNSEI27185-0350
hemocytometerZEISS176045
HEPESThermo Fisher scientific15630130
Histamine ELISA kitAbcamGK3275957-4keep at 2-8°C
Hotplate stirrerLab teachzso-9001
IsofluranceTroikaaI29159
ketotifen fumarate saltSIGMAK2628
MCPT-1 ELISA kitThermo Fisher scientific88-7503-22keep at 2-8°C
Mouse Fc blockBD Biosciences553141keep at 2-8°C
Propidium iodioleSIGMA81845keep at 2-8°C
RBC lysis bufferBiolegend420301
Round-bottom 96 wellSPL-life sciences30096
Single use syringe filterStartoriusag16555
Streptavidin microbeadsMilteryiBiotec130-048-101keep at 2-8°C
Triton X-100JUNSEIchemical49415-1601
TWEEN 20SIGMA9005-64-5
Water bathCHANGSHINSCIENCE190107

참고문헌

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