JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن نقدم نظام microfluidic لدراسات الإنتاجية العالية على آلات الحياة المعقدة ، والتي تتكون من 1500 وحدة ثقافة ، ومجموعة من المضخات التجهر المحسنة ومعامل خلط في الموقع. رقاقة microfluidic يسمح لتحليل الظروف البيئية الدقيقة معقدة للغاية وديناميكية في الجسم الحي.

Abstract

تقليد في الظروف البيئية في الجسم الحي أمر بالغ الأهمية للدراسات المختبرية على آلات الحياة المعقدة. ومع ذلك ، فإن التقنيات الحالية التي تستهدف الخلايا والأعضاء الحية إما مكلفة للغاية ، مثل الروبوتات ، أو تفتقر إلى حجم النانولتر ودقة الوقت مللي ثانية في التلاعب السائل. نقدم هنا تصميم وتصنيع نظام microfluidic ، والذي يتكون من 1500 وحدة ثقافية ، ومجموعة من المضخات التمعجية المحسنة ومعامل خلط في الموقع. لإثبات قدرات الجهاز microfluidic ، يتم الحفاظ على مجالات الخلايا الجذعية العصبية (NSC) في النظام المقترح. لاحظنا أنه عندما يتعرض مجال NSC لCXCL في اليوم 1 وEGF في اليوم 2 ، يتم الحفاظ على التوافق على شكل دائري بشكل جيد. الاختلاف في ترتيب الإدخال من 6 أدوية يسبب تغييرات مورفولوجية في مجال NSC وعلامة ممثل مستوى التعبير عن الجذعية NSC (أي Hes5 و Dcx). وتشير هذه النتائج إلى أن الظروف البيئية الديناميكية والمعقدة لها آثار كبيرة على تمايز مجلس الأمن القومي والتجديد الذاتي، وأن الجهاز المقترح للمركبات الدقيقة هو منصة مناسبة لدراسات الإنتاجية العالية على آلية الحياة المعقدة.

Introduction

تقنيات الإنتاجية العالية حاسمة بالنسبة للدراسات الطبية الحيوية والسريرية. ومن خلال إجراء الملايين من الاختبارات الكيميائية أو الوراثية أو الحية للخلايا والأعضاء، يمكن للباحثين تحديد الجينات التي تعدل المسار الجزيئي الحيوي بسرعة، وتخصيص مدخلات الأدوية المتسلسلة للاحتياجات المحددة للمرء. الروبوتات 1 ورقائق microfluidic في تركيبة مع برنامج التحكم في الجهاز تسمح الإجراءات التجريبية المعقدة لتكون الآلي، والتي تغطي التلاعب الخلية / الأنسجة، والمناولة السائلة، والتصوير، ومعالجة البيانات / التحكم2،3. لذلك ، يمكن الحفاظ على مئات وآلاف الحالات التجريبية على رقاقة واحدة ، وفقا للسرعة المطلوبة4،5.

في هذا البروتوكول ، وصفنا إجراء التصميم والتصنيع لجهاز microfluidic ، والذي يتكون من 1500 وحدة ثقافة ، ومجموعة من المضخات التثابر المحسنة ومعامل الخلط في الموقع. تمنع غرفة ثقافة الخلية ذات المستويين القص غير الضروري أثناء التبادل المتوسط ، مما يضمن بيئة ثقافية غير مضطربة لتصوير الخلايا الحية على المدى الطويل. وتبين الدراسات أن الجهاز microfluidic المقترحة هي منصة مناسبة لدراسات الإنتاجية العالية على آلات الحياة المعقدة. وعلاوة على ذلك، فإن الميزات المتقدمة للرقاقة microfluidic تسمح إعادة تشكيل الآلي للظروف البيئة الدقيقة معقدة للغاية وديناميكية في الجسم الحي، مثل السيتوكينات المتغيرة باستمرار والتراكيب ليغاندس6،7، والانتهاء منها يستغرق شهورا للمنصات التقليدية مثل لوحة 96 جيدا.

Protocol

1. تصميم رقائق ميكروفلويديك

  1. تصميم المضاعف microfluidic تتكون من 18 مداخل، يتم التحكم في كل منها عن طريق صمام الفردية ومضخة العاكسة. لزيادة حجم السائل مدفوعة لكل دورة ضخ، يكون مضخة التجسيم تتكون من 3 قنوات التحكم، والتي تم توسيعها عمدا إلى 200 ميكرومتر، و 10 خطوط تدفق متصلة.
  2. صمم غرفة الثقافة الخالية من القص. يتكون تكرار وحدة الثقافة من مستويين من قبل غرفة ثقافة الخلية السفلية (400 ميكرومتر × 400 ميكرومتر × 150 ميكرومتر) وطبقة عازلة أعلى (400 ميكرومتر × 400 ميكرومتر × 75 ميكرومتر) ، مما يمنع إجهاد القص غير المرغوب فيه على الخلايا أثناء التبادل المتوسط (الشكل 1).
  3. تصميم ميزات عالية الإنتاجية. تكرار وحدة الثقافة لتشكيل تخطيط مصفوفة 30 × 50 ، وتحتل مساحة حوالي 7 سم في 5 سم في الحجم.

2. تصنيع رقاقة وتشغيلها

  1. تصنيع صب النسخة المتماثلة باستخدام الطباعة الحجرية للأشعة فوق البنفسجية
    ملاحظة: تم تصنيع صب النسخة المتماثلة على رقاقة السيليكون وفقا لبروتوكول التصوير الضوئي القياسي8.
    1. تلفيق هياكل القناة
      1. غزل فوتوريست: تدور معطف 5 مل من SU-8 3025 الضوئية السلبية على رقاقة السيليكون في 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ق و 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
      2. خبز ناعم: ضع الرقاقة على لوح ساخن عند 65 درجة مئوية لمدة دقيقتين ثم 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، قم بتهدئتها إلى درجة حرارة الغرفة.
      3. المحاذاة والمعالجة: إصلاح رقاقة وقناع على حامل المحاذاة وبدوره على مصدر الضوء لمدة 18 ق لعلاج الضوئي يتعرض.
      4. خبز ما قبل التعرض: قم بزيادة الرقاقة إلى 95 درجة مئوية عند 110 درجة مئوية / ساعة من درجة حرارة الغرفة وابقها على الأقل 40 دقيقة حتى إزالتها.
      5. تطوير: تراجع رقاقة في الحل النامية (SU-8 المطور) والتحريض عليه لمدة 2.5 دقيقة لغسل قبالة واستعداد الضوئي والحصول على هيكل قناة 25 ميكرومتر عالية.
      6. خبز من الصعب: تغطية رقاقة مع طبق بيتري الزجاج وخبز في 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، ثم منحدر تصل إلى 160 درجة مئوية في 120 درجة مئوية / ساعة والاحتفاظ بها لمدة 3 ساعات.
    2. تصنيع غرفة ثقافة الخلية مع طبقة العازلة
      1. استخدام المعلمات الخطوة 2.1.1.1 لتدور معطف 7 مل من SU-8 3075 الضوئية السلبية على رقاقة أعلاه.
      2. خبز ناعم (موضح في الخطوة 2.1.1.2) رقاقة وتغيير القناع لمحاذاة جيدا مع علامات على رقاقة. ثم قم بتشغيل مصدر الضوء لمدة 24 s لعلاج المكشط الضوئي المكشوف.
      3. تراجع رقاقة إلى الحل النامية (SU-8 المطور) والتحريض عليه لمدة 4 دقائق و 40 ثانية لغسل قبالة مضاد للكوادر زائدة عن الحاجة والحصول على هيكل طبقة 75 ميكرومتر عالية أن حول هيكل قناة 25 ميكرومتر عالية ملفقة من قبل. خبز الثابت (وصفها في الخطوة 2.1.1.6) رقاقة لجعل هيكل معقد أقوى.
      4. كرر الخطوات 2.1.2.1-2.1.2.3 لتصنيع هيكل غرفة 75 ميكرومتر عالية التي كومة على هيكل طبقة.
    3. تصنيع هياكل الصمام
      1. باستخدام المعلمة الخطوة 2.1.1.1 لتدور معطف 5 مل من 50x AZ الضوئية الإيجابية على رقاقة أعلاه.
      2. خبز لينة (وصفها في الخطوة 2.1.1.2) رقاقة وجعل قناع محاذاة جيدا مع علامات على رقاقة، ثم الحفاظ على مصدر الضوء على لمدة 20 ق وإيقاف فورا لمدة 30 ق. كرر ضوء على / إيقاف الإجراء في 5 دوائر لعلاج معرض للضوء.
      3. تراجع رقاقة لمطور مطابقة وإثارة لمدة 8 دقائق لغسل قبالة واستعدات ضوئية زائدة عن الحاجة والحصول على الصمامات على شكل دائري التي تتداخل مع قنوات التحكم لضمان اتصال جيد. خبز الثابت (وصفها في الخطوة 2.1.1.6) رقاقة منقوشة لجعل النموذج بأكمله أقوى.
  2. إنتاج رقاقة Microfluidic باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة
    1. علاج رقائق السيليكون منقوشة وفارغة مع rimethylchlorosilane لمدة 15 دقيقة.
    2. إعداد 3 أجزاء من هلام PDMS (10:1 من نسبة مونومر / محفز) المقابلة ل 50 غرام من طبقة التدفق، 20 غرام من طبقة التحكم 2، و 20 غرام من الغشاء، على التوالي.
    3. يلقي 50 غرام من هلام PDMS على رقاقة السيليكون منقوشة، وإزالة الغاز لهم لمدة 1-2 ساعة في غرفة فراغ في -0.85 MPa لنسخ طبقة التدفق.
    4. ديغا 2 أجزاء من 20 غرام من PDMS وتدور على رقاقة منقوشة ورقائق السيليكون فارغة في 2000-2800 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية لإعداد طبقة التحكم وطبقة الغشاء.
    5. ضع الرقائق المغطاة ب PDMS في فرن التهوية لمدة 60 دقيقة عند 80 درجة مئوية للحضانة.
    6. محاذاة والسندات طبقات مختلفة معا من خلال جهاز بصري مخصص (التكبير في 100x) والبلازما آلة الحفر. ثم يبقيه في فرن التهوية لمدة 2 ساعة في 80 درجة مئوية لتعزيز الترابط من رقاقة.
    7. لكمة ثقوب مدخل على رقاقة، ومن ثم السندات على غطاء المغلفة PDMS والشفاء لمدة 12 ساعة على الأقل في 80 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  3. عملية رقاقة
    1. قم بتوصيل الصمامات السولينويد الهوائية المصغرة بطبقة التحكم في الشريحة، وافتح واجهة المستخدم الرسومية المخصصة MATLAB8 لربط المفتاح والتحكم فيه.
    2. تعيين الضغوط الختامية لدفع متابعة صمامات غشاء PDMS إلى 25 psi.
    3. تقديم المدخلات مجتمعة المتغيرة ديناميكيا / تسلسلي لغرف المعينة (الشكل 2D) في الوقت المناسب على الخروج من الصمامات.

3. توليد مدخلات ديناميكية في البيئات الدقيقة الخلوية

  1. معالجة الرقاقة وتحميل الخلايا
    1. الحفاظ على ظروف الثقافة القياسية (37 درجة مئوية، 5٪ CO2)على المجهر لمدة 5 ساعات على الأقل.
    2. املأ الشريحة بطبقة متوسطة (أي مذكورة في الملاحظة) واحتضنها في ظروف الثقافة القياسية (الموضحة في الخطوة 3.1.1) لمدة ساعة واحدة على الأقل.
    3. مسح رقاقة من قبل المالحة الفوسفات المخزنة (PBS) أو خلية ثقافة المتوسطة (دولبيكو النسر المعدلة المتوسطة، DMEM) لبناء بيئة ثقافية صحية.
    4. حصاد الخلايا في التقاء 80٪، وإعادة إنفاق الخلايا باستخدام وسائل الإعلام الثقافية (DMEM) في كثافة ~ 106/ مل. ثم قم بتحميل الخلايا في الشريحة عن طريق الضغط على الحل المحتوي على الخلية.
      ملاحظة: يتطلب زراعة خطوط خلايا مختلفة على رقاقة وسيط طلاء المقابلة لعلاج غرفة ثقافة الخلية. عادة، للتجارب على 3T3 الخلايا الليفية والثقافة الملتصقة من هن جميع الصمامات التي تسيطر على غرف الثقافة مفتوحة، والخلايا تتدفق إلى جميع غرف الثقافة داخل نفس العمود.
  2. إعداد لتصوير الخلايا الحية عالي الإنتاجية
    ملاحظة: للحصول على الصورة، تم استخدام مجهر مقلوب مع مرحلة تحويلية آلية وكاميرا رقمية تكميلية لأشباه الموصلات أكسيد المعدن (CMOS). تم التحكم في المرحلة والحصول على الصورة عن طريق البرنامج المخصص.
    1. تصور مصفوفة غرف الثقافة باستخدام عدسة الهدف 10x في مجال مشرق لتأكيد وتحديد إحداثيات الموقع من كل غرفة من 30 في 50 مصفوفة الغرفة.
    2. تحويل العدسة الموضوعية إلى 20x أو 40x ، ثم حدد إحداثيات الموقع للغرفة المطلوبة وينتقل المرحلة التحويلية إلى الموضع المعين بعد التأكيد. ضبط س، ص، ض الطائرة المحورية للحصول على صورة الأمثل.
    3. تم تحديد شدة الضوء وفضح الوقت والمعلمات الأخرى المصورة بشكل فردي لكل قناة (أي التصوير الساطع والمجال الفلوري).
    4. تعيين الفاصل الزمني ومدة دورة التصوير، وحفظ المسار ومن ثم بدء التصوير.

النتائج

تم وصف المضخة التثامية التقليدية على رقاقة لأول مرة من قبل ستيفن كويك في عام 2000 ، والتي تم تشغيل التثابير من قبل نمط 101 ، 100 ، 110 ، 010 ، 011 ، 001 8،10. الرقم 0 و 1 يشيران إلى "فتح" و "إغلاق" خطوط التحكم الأفقية 3. كما تم الإبلاغ عن دراسات تستخدم أكثر من 3 صمامات (على سبيل ال...

Discussion

وقد تم تطوير مختلف الأجهزة microfluidic لأداء تجارب متعددة ومعقدة17،18،19،20. على سبيل المثال ، يمكن أن microwells مصنوعة من مجموعة من فترات الاستراحة الطوبولوجية فخ الخلايا الفردية دون استخدام القوة الخارجية ، والتي تظهر شخصيات مف?...

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

يقر المؤلفون بالدعم الفني المقدم من جيفنغ تشنغ من شركة تشانسن للصك (الصين) المحدودة. وقد تم دعم هذا العمل من خلال المنح (المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين، 51927804).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2713 Loker Avenue WestTorrey pines scientific
AZ-50XAZ Electronic Materials, Luxembourg
Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mLSigma
CO2 Incubator HP151Heal Force
Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red)Invitrogen
Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01gShanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD.
FBSSigma
Fibronection 0.25 mg/mLMillipore, Austria
Glutamax 100xGibco
Heating Incubator BGG-9240AShanghai bluepard instruments Co.,Ltd.
Nikon Model Eclipse Ti2-ENikon
Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL StreptomycinInvitrogen
Plasma cleaner PDC-002Harrick Plasma
polydimethylsiloxane(PDMS)Momentive
polylysine 0.01%Sigma
Spin coater ARE-310Awatori Rentaro
Spin coater TDZ5-WSCence
Spin coater WH-SC-01Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
SU-8 3025MicroChem, Westborough, MA, USA
SU-8 3075MicroChem, Westborough, MA, USA

References

  1. Michael, S., et al. A robotic platform for quantitative high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 6 (5), 637-657 (2008).
  2. Kim, S. J., Lai, D., Park, J. Y., Yokokawa, R., Takayama, S. Microfluidic automation using elastomeric valves and droplets: reducing reliance on external controllers. Small. 8 (19), 2925-2934 (2012).
  3. Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration: the evolution of design rules for biological automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 213-231 (2007).
  4. Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1575-1588 (2013).
  5. Junkin, M., et al. High-content quantification of single-cell immune dynamics. Cell Reports. 15 (2), 411-422 (2016).
  6. Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), (2019).
  7. Kageyama, R., Shimojo, H., Ohtsuka, T. Dynamic control of neural stem cells by bHLH factors. Neuroscience Research. 138, 12-18 (2019).
  8. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
  9. Zhang, C., et al. Ultra-multiplexed analysis of single-cell dynamics reveals logic rules in differentiation. Science Advances. 5 (4), (2019).
  10. Quake, S. R., Scherer, A. From micro-to nanofabrication with soft materials. Science. 290 (5496), 1536-1540 (2000).
  11. Okandan, M., Galambos, P., Mani, S. S., Jakubczak, J. F. Development of surface micromachining technologies for microfluidics and BioMEMS. Microfluidics and BioMEMS. 4560, 133-139 (2001).
  12. Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Sixth Edition. , (1983).
  13. Niu, W., et al. SOX2 reprograms resident astrocytes into neural progenitors in the adult brain. Stem Cell Reports. 4 (5), 780-794 (2015).
  14. Sarkar, D. K., et al. Cyclic adenosine monophosphate differentiated β-endorphin neurons promote immune function and prevent prostate cancer growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (26), 9105-9110 (2008).
  15. Watanabe, J., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-induced differentiation of embryonic neural stem cells into astrocytes is mediated via the β isoform of protein kinase. C. Journal of Neuroscience Research. 84 (8), 1645-1655 (2006).
  16. Watanabe, J., et al. Involvement of protein kinase C in the PACAP-induced differentiation of neural stem cells into astrocytes. Annals of the New York Academy of Sciences. 1070 (1), 597-601 (2006).
  17. Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
  18. Khademhosseini, A., et al. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab on a Chip. 5 (12), 1380-1386 (2005).
  19. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (50), 19606-19611 (2008).
  20. Zhang, Y., et al. DNA methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array. Lab on a Chip. 9 (8), 1059-1064 (2009).
  21. Huang, N. T., Hwong, Y. J., Lai, R. L. A microfluidic microwell device for immunomagnetic single-cell trapping. Microfluidics and Nanofluidics. 22 (2), 16 (2018).
  22. Galler, K., Bräutigam, K., Große, C., Popp, J., Neugebauer, U. Making a big thing of a small cell-recent advances in single cell analysis. Analyst. 139 (6), 1237-1273 (2014).
  23. Grünberger, A., Wiechert, W., Kohlheyer, D. Single-cell microfluidics: opportunity for bioprocess development. Current Opinion in Biotechnology. 29, 15-23 (2014).
  24. Lin, H., Mei, N., Manjanatha, M. G. In vitro comet assay for testing genotoxicity of chemicals. Optimization in Drug Discovery. , 517-536 (2014).
  25. Bai, H., et al. Efficient water collection on integrative bioinspired surfaces with star-shaped wettability patterns. Advanced Materials. 26 (29), 5025-5030 (2014).
  26. Zhao, J., Chen, S. Following or against topographic wettability gradient: movements of droplets on a micropatterned surface. Langmuir. 33 (21), 5328-5335 (2017).
  27. Theberge, A. B., et al. Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets. Lab on a Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).
  28. Zhang, L., et al. Fabrication of ceramic microspheres by diffusion-induced sol-gel reaction in double emulsions. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (22), 11489-11493 (2013).
  29. Moerman, R., et al. Quantitative analysis in nanoliter wells by prefilling of wells using electrospray deposition followed by sample introduction with a coverslip method. Analytical Chemistry. 77 (1), 225-231 (2005).
  30. Zhou, X., Lau, L., Lam, W. W. L., Au, S. W. N., Zheng, B. Nanoliter dispensing method by degassed poly (dimethylsiloxane) microchannels and its application in protein crystallization. Analytical Chemistry. 79 (13), 4924-4930 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

170 Microfluidic

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved