Generazione di condizioni ambientali dinamiche utilizzando un dispositivo microfluidico ad alta produttività

Riepilogo

Presentiamo un sistema microfluidico per studi ad alta produttività su macchinari di vita complessi, composto da 1500 unità di coltura, una serie di pompe peristaltiche potenziate e un modulo di miscelazione in loco. Il chip microfluidico consente l'analisi delle condizioni micro-ambientali altamente complesse e dinamiche in vivo.

Abstract

Imitare le condizioni ambientali in vivo è fondamentale per gli studi in vitro su macchinari per la vita complessi. Tuttavia, le tecniche attuali che prendono di mira cellule e organi vivi sono molto costose, come la robotica, o mancano di volume nanolitro e precisione del tempo millisecondo nella manipolazione dei liquidi. Nel presente documento presentiamo la progettazione e la fabbricazione di un sistema microfluidico, composto da 1.500 unità di coltura, una serie di pompe peristaltiche potenziate e un modulo di miscelazione in loco. Per dimostrare le capacità del dispositivo microfluidico, le sfere di cellule staminali neurali (NSC) vengono mantenute nel sistema proposto. Abbiamo osservato che quando la sfera NSC è esposta al CXCL nel primo giorno e all'EGF nel secondo giorno, la conformazione a forma rotonda è ben mantenuta. La variazione nell'ordine di input di 6 farmaci causa cambiamenti morfologici alla sfera NSC e al marcatore rappresentativo del livello di espressione per la stelo NSC (cioè Hes5 e Dcx). Questi risultati indicano che le condizioni ambientali dinamiche e complesse hanno grandi effetti sulla differenziazione e sull'autorinove NSC, e il dispositivo microfluidico proposto è una piattaforma adatta per studi ad alta produttività sui macchinari di vita complessi.

Introduzione

Le tecniche ad alta produttività sono fondamentali per gli studi biomedici e clinici. Conducendo parallelamente milioni di test chimici, genetici o a cellule vive e organoidi, i ricercatori possono identificare rapidamente i geni che modulano una via bio-molecolare e personalizzare l'input sequenziale del farmaco in base alle proprio esigenze specifiche. I chip^{robotici 1} e microfluidici in combinazione con un programma di controllo del dispositivo consentono di automatizzate procedure sperimentali complesse, che coprono la manipolazione di cellule / tessuti, la manipolazione di liquidi, l'imaging e l'elaborazione / controllo^{dei dati 2,3}. Pertanto, centinaia e migliaia di condizioni sperimentali possono essere mantenute su un singolo chip, in base alla velocità effettiva^{desiderata 4,5}.

In questo protocollo, abbiamo descritto la procedura di progettazione e fabbricazione di un dispositivo microfluidico, che consiste di 1500 unità di coltura, una serie di pompe peristaltiche migliorate e modulo di miscelazione in loco. La camera di coltura cellulare a 2 livelli previene il taglio non necessario durante lo scambio medio, il che garantisce un ambiente di coltura indisturbato per l'imaging di cellule vive a lungo termine. Gli studi dimostrano che il dispositivo microfluidico proposto è una piattaforma adatta per studi ad alta produttività sui macchinari di vita complessi. Inoltre, le caratteristiche avanzate del chip microfluidico consentono la ricostituzione automatizzata di condizioni microambientali altamente complesse e dinamiche in vivo, come le composizioni di citochine e ligandi in costante^{evoluzione 6,7}, il cui completamento richiede mesi per piattaforme convenzionali come la piastra a 96 pozzetti.

Protocollo

1. Design dei chip microfluidici

1. Progettare il multiplexer microfluidico composto da 18 insenature, ognuna delle quali è controllata da una singola valvola e da una pompa peristaltica. Per aumentare il volume del liquido guidato dal ciclo di pompaggio, far in modo che la pompa peristaltica sia composta da 3 canali di controllo, che sono stati appositamente allargati a 200 μm, e 10 linee di flusso collegate.
2. Progettare la camera di coltura senza taglio. La replicazione dell'unità di coltura a 2 livelli è composta da una camera di coltura cellulare inferiore (400 μm x 400 μm x 150 μm) e da uno strato tampone più elevato (400 μm x 400 μm x 75 μm), che impedisce stress da taglio indesiderato sulle cellule durante loscambio medio (figura 1).
3. Progetta funzionalità ad alta produttività. Duplicare l'unità di coltura per formare un layout a matrice 30 x 50, occupando un'area di circa 7 cm per 5 cm di dimensioni.

2. Fabbricazione e funzionamento dei truciolo

1. Fabbricazione dello stampaggio della replica utilizzando la litografia UV
   NOTA: Lo stampaggio della replica è stato fabbricato su wafer di silicio secondo il protocollo di fotolitografia standard⁸.
   1. Fabbricazione delle strutture del canale
      1. Fotoresist rotante: Spin coat 5 mL del fotoresist negativo SU-8 3025 su un wafer di silicio a 500 giri/min per 10 s e 3000 giri/min per 30 s.
      2. Cuocere morbido: Mettere il wafer su una piastra calda a 65 °C per 2 minuti e poi 95 °C per 10 minuti, raffreddarlo a temperatura ambiente.
      3. Allineamento e polimerizzazione: fissare il wafer e la maschera sul supporto dell'allineatore e accendere la sorgente luminosa per 18 s per curare il fotoresist esposto.
      4. Cuocere pre-esposizione: Aumentare il wafer a 95°C a 110°C/h dalla temperatura ambiente e mantenerlo almeno 40 min fino alla rimozione.
      5. Sviluppare: immergere il wafer nella soluzione in via di sviluppo (sviluppatore SU-8) e agitarlo per 2,5 minuti per lavare via il fotoresist ridondante e ottenere la struttura del canale alta 25 μm.
      6. Cottura dura: Coprire il wafer con una piastra di Petri in vetro e cuocere a 65 °C per 2 minuti, quindi aumentare fino a 160 °C a 120 °C /h e conservarlo per 3 ore.
   2. Fabbricazione della camera di coltura cellulare con lo strato tampone
      1. Utilizzare i parametri del passaggio 2.1.1.1 per ruotare il cappotto 7 mL del fotoresist negativo SU-8 3075 sul wafer di cui sopra.
      2. Cuocere in modo morbido (descritto al passaggio 2.1.1.2) il wafer e cambiare la maschera per allinearsi bene con i marcatori sul wafer. Quindi accendere la sorgente luminosa per 24 s per curare il fotoresist esposto.
      3. Immergere il wafer nella soluzione in via di sviluppo (sviluppatore SU-8) e agitarlo per 4 minuti e 40 secondi per lavare via il fotoresist ridondante e ottenere una struttura a strato alta 75 μm che intorno alla struttura del canale alta 25 μm si è fabbricata prima. Cuocere duramente (descritto nel passaggio 2.1.1.6) il wafer per rendere la struttura complessa più forte.
      4. Ripetere i passaggi 2.1.2.1-2.1.2.3 per fabbricare una struttura a camera alta 75 μm che si impila sulla struttura dello strato.
   3. Fabbricazione delle strutture delle valvole
      1. Utilizzando il parametro del passo 2.1.1.1 per girare cappotto 5 mL del fotoresist positivo AZ 50x sul wafer di cui sopra.
      2. Cuocere in modo morbido (descritto al passaggio 2.1.1.2) il wafer e rendere la maschera allineata bene con marcatori sul wafer, quindi mantenere la sorgente luminosa su 20 s e spenta immediatamente per 30 s. Ripetere la procedura di spegnimento/ spegnimento della luce in 5 cerchi per curare il fotoresist esposto.
      3. Immergere il wafer allo sviluppatore abbinato e agitarlo per circa 8 minuti per lavare via il fotoresist ridondante e ottenere le valvole a forma rotonda che si sovrappongono ai canali di controllo per garantire una buona connessione. Cuocere duramente (descritto nel passaggio 2.1.1.6) il wafer modellato per rendere l'intero modello più forte.
2. Produzione di chip microfluidici con litografia morbida
   1. Trattare i wafer di silicio fantasia e vuoto con rimetilclorosilano per 15 minuti.
   2. Preparare 3 porzioni di gel PDMS (10:1 del rapporto monomero/catalizzatore) corrispondenti rispettivamente a 50 g di strato di flusso, 20 g di strato di controllo 2 e 20 g di membrana.
   3. Gettare 50 g di gel PDMS sul wafer di silicio modellato e de-gasarli per 1-2 ore nella camera a vuoto a -0,85 MPa per copiare lo strato di flusso.
   4. Degasare le 2 porzioni di 20 g di PDMS e girarlo sul wafer a motivi geometrici e un wafer di silicio vuoto a 2000-2800 giri/min per 30 s in modo da preparare uno strato di controllo e uno strato di membrana.
   5. Mettere i wafer coperti da PDMS in forno di ventilazione per 60 min a 80 °C per l'incubazione.
   6. Allineare e legare i diversi livelli attraverso un dispositivo ottico personalizzato (zoom in 100x) e una macchina per l'incisione al plasma. Quindi tenerlo in forno ventilato per 2 ore a 80 °C per migliorare l'incollaggio del truciolo.
   7. Punzonare i fori di ingresso sul truciolo, quindi incollarlo su un coverslip rivestito di PDMS e polimerizzi per almeno 12 ore a 80 °C prima dell'uso.
3. Operazione chip
   1. Collegare le valvole solenoidi pneumatiche in miniatura allo strato di controllo del chip e aprire l'interfaccia utente grafica⁸ MATLAB personalizzata per collegare e controllare l'interruttore.
   2. Impostare le pressioni di chiusura delle valvole a membrana PDMS push-up su 25 psi.
   3. Fornire input combinatoriali/sequenziali che cambiano dinamicamente alle camere designate (Figura 2d) mediante l'on-off tempestivo delle valvole.

3. Generazione di input dinamici nei microambientati cellulari

1. Trattamento truciolo e carico cellulare
   1. Mantenere le condizioni di coltura standard (37 °C, 5% CO₂) al microscopio per almeno 5 ore.
   2. Riempire il truciolo con il mezzo di rivestimento (cioè menzionato nella NOTA) e incubarlo alle condizioni di coltura standard (descritte al passaggio 3.1.1) per almeno un'ora.
   3. Sciacquare il chip con saline tamponate da fosfati (PBS) o mezzo di coltura cellulare (il mezzo dell'aquila modificata di Dulbecco, DMEM) per costruire un ambiente di coltura sano.
   4. Raccogliere le cellule all'80% di confluenza e rimorsi le cellule usando mezzi di coltura (DMEM) ad una densità di ~ 10⁶/mL. Quindi caricare le celle nel chip pressurizzando la soluzione contenente celle.
      NOTA: La coltivazione di diverse linee cellulari sul chip richiede un mezzo di rivestimento corrispondente per trattare la camera di coltura cellulare. Tipicamente, per esperimenti su fibroblasti 3T3 e coltura aderente di lamenti tutte le valvole che controllano le camere di coltura sono aperte, le cellule fluiscono in tutte le camere di coltura all'interno della stessa colonna.
2. Installazione per l'imaging a celle vive ad alta produttività
   NOTA: Per l'acquisizione di immagini, è stato utilizzato un microscopio invertito con uno stadio trasdizionale automatizzato e una fotocamera digitale complementare a semiconduttore di ossido di metallo (CMOS). La fase e l'acquisizione delle immagini sono state controllate tramite il software personalizzato.
   1. Visualizza la matrice delle camere di coltura usando una lente obiettivo 10x in campo luminoso per affermare e definire le coordinate di posizione di ogni camera della matrice della camera 30 per 50.
   2. Trasforma l'obiettivo in 20x o 40x, quindi seleziona le coordinate di posizione della camera desiderata e lo stadio tras trasmizionale si sposta nella posizione assegnata dopo la conferma. Mettere a punto il piano focale x, y, z per ottenere un'immagine ottimale.
   3. Ottimale l'intensità della luce, il tempo di esposizione e altri parametri immagine sono stati determinati individualmente per ogni canale (ad esempio, imaging a campo luminoso e fluorescenza).
   4. Impostare l'intervallo e la durata del ciclo di imaging, salvare il percorso e quindi avviare l'imaging.

Risultati

La pompa peristaltica convenzionale on-chip è stata descritta per la prima volta da Stephen Quake nel 2000, usando la quale la peristalisi è stata azionata dal modello 101, 100, 110, 010, 011, 001 ^8,10. I numeri 0 e 1 indicano "aperto" e "chiuso" delle 3 linee di controllo orizzontali. Sono stati inoltre riportati studi che utilizzano più di 3 valvole (ad esempio cinque)^11. Anche se la pompa peristaltica composta da 3 linee di controllo...

Discussione

Vari dispositivi microfluidici sono stati sviluppati per eseguire esperimenti multiplexati e complessi^17,18,19,20. Ad esempio, i microwell fatti di una serie di recessi topologici possono intrappolare singole cellule senza l'uso di forza esterna, mostrando caratteri vantaggiosi tra cui piccole dimensioni del campione, parallelizzazione, minor costo del materiale, risposta più^...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2713 Loker Avenue West	Torrey pines scientific
AZ-50X	AZ Electronic Materials, Luxembourg
Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL	Sigma
CO2 Incubator HP151	Heal Force
Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14	Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red)	Invitrogen
Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g	Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD.
FBS	Sigma
Fibronection 0.25 mg/mL	Millipore, Austria
Glutamax 100x	Gibco
Heating Incubator BGG-9240A	Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd.
Nikon Model Eclipse Ti2-E	Nikon
Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin	Invitrogen
Plasma cleaner PDC-002	Harrick Plasma
polydimethylsiloxane(PDMS)	Momentive
polylysine 0.01%	Sigma
Spin coater ARE-310	Awatori Rentaro
Spin coater TDZ5-WS	Cence
Spin coater WH-SC-01	Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
SU-8 3025	MicroChem, Westborough, MA, USA
SU-8 3075	MicroChem, Westborough, MA, USA