Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

1500 kültür ünitesi, bir dizi gelişmiş peristaltik pompa ve yerinde karıştırma modülünden oluşan karmaşık yaşam makineleri üzerinde yüksek verimli çalışmalar için mikroakışkan bir sistem sunuyoruz. Mikroakışkan çip, vivodaki son derece karmaşık ve dinamik mikro çevresel koşulların analizini sağlar.

Özet

In vivo çevresel koşulları taklit etmek, karmaşık yaşam makineleri üzerindeki in vitro çalışmalar için çok önemlidir. Bununla birlikte, canlı hücreleri ve organları hedefleyen mevcut teknikler, robotik gibi oldukça pahalıdır veya sıvı manipülasyonunda nanolitre hacminden ve milisaniyelik zaman doğruluğuna sahip değildir. Burada, 1.500 kültür ünitesi, bir dizi gelişmiş peristaltik pompa ve yerinde karıştırma modülünden oluşan bir mikroakışkan sistemin tasarımını ve imalatını sunuyoruz. Mikroakışkan cihazın kapasitelerini göstermek için, önerilen sistemde nöral kök hücre (NSC) küreleri korunur. NSC küresi 1. günde CXCL'ye, 2. günde egf'ye maruz kaldığında yuvarlak şekilli uygunluğun iyi korunduğunu gözlemledik. 6 ilacın giriş sırasındaki değişim, NSC küresinde morfolojik değişikliklere ve NSC saplığı (örneğin, Hes5 ve Dcx) için ifade düzeyi temsili işaretleyicisine neden olur. Bu sonuçlar, dinamik ve karmaşık çevresel koşulların NSC farklılaşması ve kendini yenileme üzerinde büyük etkileri olduğunu ve önerilen mikroakışkan cihazın karmaşık yaşam makineleri üzerinde yüksek verimli çalışmalar için uygun bir platform olduğunu göstermektedir.

Giriş

Biyomedikal ve klinik çalışmalar için yüksek verim teknikleri çok önemlidir. Araştırmacılar, milyonlarca kimyasal, genetik veya canlı hücre ve organoid testini paralel olarak gerçekleştirerek, biyo-moleküler bir yolu modüle eden genleri hızla tanımlayabilir ve sıralı ilaç girişini kişinin özel ihtiyaçlarına göre özelleştirebilir. Robotik1 ve mikroakışkan çipler bir cihaz kontrol programı ile birlikte hücre / doku manipülasyonu, sıvı işleme, görüntüleme ve veri işleme / kontrol2, 3kapsayan karmaşık deneysel prosedürlerin otomatikleştirilmesine izin verir. Bu nedenle, istenen aktarım hızına göre tek bir çip üzerinde yüzlerce ve binlerce deneysel koşul korunabilir4,5.

Bu protokolde, 1500 kültür ünitesi, bir dizi gelişmiş peristaltik pompa ve yerinde karıştırma modülünden oluşan bir mikroakışkan cihazın tasarım ve imalat prosedürünü tanımladık. 2 seviyeli hücre kültürü odası, orta değişim sırasında gereksiz kesmeyi önler ve bu da uzun süreli canlı hücre görüntüleme için bozulmamış bir kültür ortamı sağlar. Çalışmalar, önerilen mikroakışkan cihazın karmaşık yaşam makineleri üzerinde yüksek verimli çalışmalar için uygun bir platform olduğunu göstermektedir. Ayrıca, mikroakışkan çipin gelişmiş özellikleri, sürekli değişen sitokinler ve ligand kompozisyonları 6 ,7gibi son derece karmaşık vedinamik mikroçevrimsel koşulların otomatik olarak yeniden keşfedilmesine izin verir, tamamlanması 96 kuyu plakası gibi geleneksel platformlar için aylar sürer.

Protokol

1. Mikroakışkan çip tasarımı

  1. Her biri ayrı bir vana ve peristaltik pompa ile kontrol edilen 18 giriştan oluşan mikroakışkan çoklayıcıyı tasarlayın. Pompalama döngüsü başına tahrik edilen sıvı hacmini artırmak için, peristaltik pompanın bilerek 200 μm'ye genişletilen 3 kontrol kanalından ve 10 bağlı akış hattından oluşmasını sağlar.
  2. Makassız kültür odasını tasarlayın. 2 seviyeli kültür ünitesinin replikasyonu, orta değişim sırasında hücreler üzerinde istenmeyen kesme stresini önleyen bir alt hücre kültür odası (400 μm x 400 μm x 150 μm) ve daha yüksek bir tampon tabakası (400 μm x 400 μm x 75 μm) tarafından oluşturulur (Şekil 1).
  3. Yüksek verimli özellikler tasarlayin. Kültür birimini, yaklaşık 7 cm x 5 cm büyüklüğünde bir alanı kaplayan 30 x 50 matris düzeni oluşturmak için çoğaltın.

2. Çip imalatı ve çalışması

  1. UV litografisi kullanılarak replika kalıplama imalatı
    NOT: Replika kalıplama, standart fotolithografi protokolü8'egöre silikon gofret üzerine imal edildi.
    1. Kanal yapılarının imalatı
      1. Dönen fotoresist: 10 s için 500 rpm ve 30 s için 3000 rpm'de bir silikon gofret üzerinde SU-8 3025 negatif fotoresistin 5 mL'sini döndürün.
      2. Yumuşak fırın: Gofredi 2 dakika boyunca 65 °C'de bir ocak üzerine koyun ve ardından 10 dakika boyunca 95 °C, Oda sıcaklığına kadar soğutun.
      3. Hizalama ve kürleme: Gofreti ve maskeyi hizalayıcının tutucusuna sabitlayın ve açıkta kalan fotoresisti iyileştirmek için ışık kaynağını 18 s açın.
      4. Ön pozlama pişirme: Gofredi oda sıcaklığından 110°C/s'de 95°C'ye çıkarın ve çıkarılana kadar en az 40 dakika tutun.
      5. Geliştirin: Gofreti gelişmekte olan çözeltiye (SU-8 geliştiricisi) batırın ve gereksiz fotoresisti yıkamak ve 25 μm yüksekliğinde kanal yapısını elde etmek için 2,5 dakika ajite edin.
      6. Sert pişirme: Gofretleri cam Petri kabı ile örtün ve 2 dakika boyunca 65 °C'de pişirin, ardından 120 °C/ s'de 160 ° C'ye kadar rampalayın ve 3 saat saklayın.
    2. Hücre kültürü odasının tampon tabaka ile imalatı
      1. Yukarıdaki gofret üzerinde SU-8 3075 negatif fotoresistin 7 mL katını döndürmek için 2.1.1.1 adım parametrelerini kullanın.
      2. Gofreti yumuşak pişirin (adım 2.1.1.2'de açıklanmıştır) ve maskeyi gofret üzerindeki işaretleyicilerle iyi hizalamak için değiştirin. Sonra açıkta kalan fotoresisti iyileştirmek için 24 s için ışık kaynağını açın.
      3. Gofreti gelişmekte olan çözeltiye (SU-8 geliştiricisi) batırın ve gereksiz fotoresisti yıkamak ve daha önce üretilen 25 μm yüksekliğindeki kanal yapısının etrafında 75 μm yüksekliğinde bir katman yapısı elde etmek için 4 dakika 40 saniye boyunca çalkalayın. Karmaşık yapıyı daha güçlü hale getirmek için gofreti sert pişirin (adım 2.1.1.6'da açıklanmıştır).
      4. Katman yapısına yığılan 75 μm yüksekliğinde bir oda yapısı oluşturmak için 2.1.2.1-2.1.2.3 adımlarını yineleyin.
    3. Vana yapılarının imalatı
      1. Yukarıdaki gofret üzerinde AZ 50x pozitif fotoresistin 5 mL katını döndürmek için 2.1.1.1 adım parametresini kullanarak.
      2. Yumuşak pişirin (adım 2.1.1.2'de açıklanmıştır) gofreti pişirin ve maskeyi gofret üzerindeki işaretleyicilerle iyi hizalayın, ardından ışık kaynağını 20 s boyunca açık tutun ve 30 s için hemen kapatın. Açıkta kalan fotoresisti iyileştirmek için ışık yakma / kapatma prosedürünü 5 daire halinde tekrarlayın.
      3. Gofreti eşleşen geliştiriciye batırın ve gereksiz fotoresisti yıkamak ve iyi bağlantı sağlamak için kontrol kanallarıyla örtüşen yuvarlak şekilli vanaları almak için yaklaşık 8 dakika çalkalanın. Sert fırın (adım 2.1.1.6'da açıklanmıştır) tüm modeli daha güçlü hale getirmek için desenli gofret.
  2. Yumuşak litografi kullanılarak mikroakışkan çip üretimi
    1. Desenli ve boş silikon gofretleri rimetilchlorosilane ile 15 dakika boyunca tedavi edin.
    2. Sırasıyla 50 g akış katmanına karşılık gelen 3 porsiyon PDMS jeli (10:1 monomer/katalizör oranı), 20 g kontrol katmanı 2 ve 20 g membran hazırlayın.
    3. Desenli silikon gofretin üzerine 50 g PDMS jeli dökun ve akış tabakasını kopyalamak için -0,85 MPa'daki vakum odasında 1-2 saat boyunca gazdan arındırın.
    4. 20 g PDMS'nin 2 kısmını degaslayın ve bir kontrol katmanı ve membran tabakası hazırlamak için 30 s için 2000-2800 rpm'de desenli gofret ve boş bir silikon gofret üzerinde döndürün.
    5. PDMS kaplı gofretleri inkübasyon için 80 °C'de 60 dakika havalandırma fırınına koyun.
    6. Özelleştirilmiş optik cihaz (100x yakınlaştırma) ve plazma gravür makinesi aracılığıyla farklı katmanları hizalayın ve birbirine bağlayın. Daha sonra talaşın bağlanmasını artırmak için 80 ° C'de 2 saat havalandırma fırınında saklayın.
    7. Çip üzerindeki giriş deliklerini delin ve ardından PDMS kaplı bir kapakçığa yapıştırın ve kullanmadan önce 80 °C'de en az 12 saat kürleyin.
  3. Talaş işlemi
    1. Minyatür pnömatik solenoid vanaları çipin kontrol katmanına bağlayın ve anahtarı bağlamak ve kontrol etmek için özelleştirilmiş MATLAB grafik kullanıcı arayüzü8'i açın.
    2. Şınav PDMS membran vanalarının kapatma basınçlarını 25 psi olarak ayarlayın.
    3. Vanaları zamanında açarak, dinamik olarak değişen kombinatoryal/sıralı girişleri belirlenen bölmelere(Şekil 2d)sunun.

3. Hücresel mikroçevricilerde dinamik girişlerin üretilmesi

  1. Talaş tedavisi ve hücre yüklemesi
    1. Mikroskopta standart kültür koşullarını (%37 °C,%5 CO 2)en az 5 saat koruyun.
    2. Çipi kaplama ortamıyla doldurun (örneğin, NOT'ta belirtilen) ve standart kültür koşullarında (adım 3.1.1'de açıklanan) en az bir saat kuluçkaya yatırın.
    3. Sağlıklı bir kültür ortamı oluşturmak için çipi fosfat tamponlu salin (PBS) veya hücre kültürü ortamı (Dulbecco's Modified Eagle's medium, DMEM) ile yıkayın.
    4. Hücreleri %80 izdiahta toplar ve ~ 106/mL yoğunlukta kültür ortamı (DMEM) kullanarak hücreleri yeniden biriktirin. Daha sonra hücre içeren çözeltiye baskı yaparak hücreleri çipe yükleyin.
      NOT: Talaş üzerinde farklı hücre hatlarının kült örültürlüğü, hücre kültürü odasını tedavi etmek için ilgili kaplama ortamını gerektirir. Tipik olarak, 3T3 fibroblast ve bağlı hen kültürü üzerine yapılan deneyler için kültür odalarını kontrol eden tüm vanalar açıktır, hücreler aynı sütundaki tüm kültür odalarına akar.
  2. Yüksek verimli canlı hücre görüntüleme kurulumu
    NOT: Görüntü alımı için, otomatik çeviri aşamasına sahip ters bir mikroskop ve dijital tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (CMOS) kamera kullanılmıştır. Sahne ve görüntü alımı özelleştirilmiş yazılım aracılığıyla kontrol edildi.
    1. 30'a 50 oda matrisinin her odasının konum koordinatlarını onaylamak ve tanımlamak için parlak alanda 10x objektif lens kullanarak kültür odalarının matrisini görselleştirin.
    2. Objektif lensi 20x veya 40x'e dönüştürün, ardından istediğiniz odanın konum koordinatlarını seçin ve çeviri aşaması onaydan sonra atanan konuma taşınır. En iyi görüntüyü elde etmek için x, y, z odak düzlemine ince ayar yapın.
    3. Her kanal için en uygun ışık yoğunluğu, maruziyet süresi ve diğer görüntülenmiş parametreler ayrı ayrı belirlendi (örneğin, parlak alan ve floresan görüntüleme).
    4. Görüntüleme döngüsünün aralığını ve süresini ayarlayın, yolu kaydedin ve görüntülemeye başlayın.

Sonuçlar

Geleneksel çipli peristaltik pompa ilk olarak Stephen Quake tarafından 2000 yılında tanımlanmıştır, peristalsis 101, 100, 110, 010, 011, 001 8,10deseni ile çalıştırıldı. 0 ve 1 sayısı, 3 yatay kontrol hattının "açık" ve "kapanış" olduğunu gösterir. 3'ten fazla vana (örneğin, beş) kullanılarak yapılan çalışmalar dabildirilmiştir 11. 3 kontrol hattı ve 3 akış hattından oluşan peristaltik pompa nanoliter ...

Tartışmalar

Çoklayıcı ve karmaşık deneyler yapmak için çeşitli mikroakışkan cihazlar geliştirilmiştir17,18,19,20. Örneğin, bir dizi topolojik girintiden yapılmış mikrowelller, küçük örnek boyutu, paralelleştirme, daha düşük malzeme maliyeti, daha hızlı yanıt, yüksek hassasiyet 21 , 22,23,

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar Chansn Instrument (Çin) LTD'den Zhifeng Cheng'in teknik desteğini kabul ediyor. Bu çalışma hibelerle desteklendi (Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı,51927804).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
2713 Loker Avenue WestTorrey pines scientific
AZ-50XAZ Electronic Materials, Luxembourg
Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mLSigma
CO2 Incubator HP151Heal Force
Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red)Invitrogen
Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01gShanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD.
FBSSigma
Fibronection 0.25 mg/mLMillipore, Austria
Glutamax 100xGibco
Heating Incubator BGG-9240AShanghai bluepard instruments Co.,Ltd.
Nikon Model Eclipse Ti2-ENikon
Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL StreptomycinInvitrogen
Plasma cleaner PDC-002Harrick Plasma
polydimethylsiloxane(PDMS)Momentive
polylysine 0.01%Sigma
Spin coater ARE-310Awatori Rentaro
Spin coater TDZ5-WSCence
Spin coater WH-SC-01Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
SU-8 3025MicroChem, Westborough, MA, USA
SU-8 3075MicroChem, Westborough, MA, USA

Referanslar

  1. Michael, S., et al. A robotic platform for quantitative high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 6 (5), 637-657 (2008).
  2. Kim, S. J., Lai, D., Park, J. Y., Yokokawa, R., Takayama, S. Microfluidic automation using elastomeric valves and droplets: reducing reliance on external controllers. Small. 8 (19), 2925-2934 (2012).
  3. Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration: the evolution of design rules for biological automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 213-231 (2007).
  4. Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1575-1588 (2013).
  5. Junkin, M., et al. High-content quantification of single-cell immune dynamics. Cell Reports. 15 (2), 411-422 (2016).
  6. Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), (2019).
  7. Kageyama, R., Shimojo, H., Ohtsuka, T. Dynamic control of neural stem cells by bHLH factors. Neuroscience Research. 138, 12-18 (2019).
  8. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
  9. Zhang, C., et al. Ultra-multiplexed analysis of single-cell dynamics reveals logic rules in differentiation. Science Advances. 5 (4), (2019).
  10. Quake, S. R., Scherer, A. From micro-to nanofabrication with soft materials. Science. 290 (5496), 1536-1540 (2000).
  11. Okandan, M., Galambos, P., Mani, S. S., Jakubczak, J. F. Development of surface micromachining technologies for microfluidics and BioMEMS. Microfluidics and BioMEMS. 4560, 133-139 (2001).
  12. Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Sixth Edition. , (1983).
  13. Niu, W., et al. SOX2 reprograms resident astrocytes into neural progenitors in the adult brain. Stem Cell Reports. 4 (5), 780-794 (2015).
  14. Sarkar, D. K., et al. Cyclic adenosine monophosphate differentiated β-endorphin neurons promote immune function and prevent prostate cancer growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (26), 9105-9110 (2008).
  15. Watanabe, J., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-induced differentiation of embryonic neural stem cells into astrocytes is mediated via the β isoform of protein kinase. C. Journal of Neuroscience Research. 84 (8), 1645-1655 (2006).
  16. Watanabe, J., et al. Involvement of protein kinase C in the PACAP-induced differentiation of neural stem cells into astrocytes. Annals of the New York Academy of Sciences. 1070 (1), 597-601 (2006).
  17. Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
  18. Khademhosseini, A., et al. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab on a Chip. 5 (12), 1380-1386 (2005).
  19. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (50), 19606-19611 (2008).
  20. Zhang, Y., et al. DNA methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array. Lab on a Chip. 9 (8), 1059-1064 (2009).
  21. Huang, N. T., Hwong, Y. J., Lai, R. L. A microfluidic microwell device for immunomagnetic single-cell trapping. Microfluidics and Nanofluidics. 22 (2), 16 (2018).
  22. Galler, K., Bräutigam, K., Große, C., Popp, J., Neugebauer, U. Making a big thing of a small cell-recent advances in single cell analysis. Analyst. 139 (6), 1237-1273 (2014).
  23. Grünberger, A., Wiechert, W., Kohlheyer, D. Single-cell microfluidics: opportunity for bioprocess development. Current Opinion in Biotechnology. 29, 15-23 (2014).
  24. Lin, H., Mei, N., Manjanatha, M. G. In vitro comet assay for testing genotoxicity of chemicals. Optimization in Drug Discovery. , 517-536 (2014).
  25. Bai, H., et al. Efficient water collection on integrative bioinspired surfaces with star-shaped wettability patterns. Advanced Materials. 26 (29), 5025-5030 (2014).
  26. Zhao, J., Chen, S. Following or against topographic wettability gradient: movements of droplets on a micropatterned surface. Langmuir. 33 (21), 5328-5335 (2017).
  27. Theberge, A. B., et al. Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets. Lab on a Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).
  28. Zhang, L., et al. Fabrication of ceramic microspheres by diffusion-induced sol-gel reaction in double emulsions. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (22), 11489-11493 (2013).
  29. Moerman, R., et al. Quantitative analysis in nanoliter wells by prefilling of wells using electrospray deposition followed by sample introduction with a coverslip method. Analytical Chemistry. 77 (1), 225-231 (2005).
  30. Zhou, X., Lau, L., Lam, W. W. L., Au, S. W. N., Zheng, B. Nanoliter dispensing method by degassed poly (dimethylsiloxane) microchannels and its application in protein crystallization. Analytical Chemistry. 79 (13), 4924-4930 (2007).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 170Mikroak kany ksek verimcanl h cre g r nt leme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır