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요약

우리는 1500 배양 장치, 향상된 연동 펌프의 배열및 현장 믹싱 계수로 구성된 복잡한 생명 기계에 대한 높은 처리량 연구를위한 미세 유체 시스템을 제시합니다. 미세 유체 칩은 생체 내 매우 복잡하고 역동적인 미세 환경 조건을 분석할 수 있게 해줍니다.

초록

생체 내 환경 조건을 모방하는 것은 복잡한 생명 기계에 대한 시험관 내 연구에 매우 중요합니다. 그러나 살아있는 세포와 장기를 대상으로 하는 현재 기술은 로봇 공학과 같이 비용이 많이 들거나 나노리터 부피와 액체 조작의 밀리초 시간 정확도가 부족합니다. 당사는 1,500개의 배양 장치, 향상된 연동 펌프 및 현장 믹싱 계수로 구성된 미세 유체 시스템의 설계 및 제조를 소개합니다. 미세 유체 장치의 용량을 입증하기 위해 신경 줄기 세포 (NSC) 구는 제안 된 시스템에서 유지됩니다. 우리는 NSC 구가 1일째에 CXCL에 노출되고 2일째EGF에 노출되면 둥근 모양의 형태가 잘 유지되는 것을 관찰했습니다. 6개의 약물의 입력 순서의 변화는 NSC 스템니스(즉, Hes5 및 Dcx)에 대한 NSC 구및 발현 수준 대표 마커에 대한 형태학적 변화를 일으킨다. 이러한 결과는 동적 및 복잡한 환경 조건이 NSC 분화 및 자체 갱신에 큰 영향을 미치는 것을 나타내며, 제안된 미세 유체 장치는 복잡한 생명 기계에 대한 높은 처리량 연구를 위한 적합한 플랫폼입니다.

서문

높은 처리량 기술은 생물 의학 및 임상 연구에 매우 중요합니다. 수백만 개의 화학, 유전 적 또는 살아있는 세포 및 오르가노이드 테스트를 병렬로 수행함으로써 연구원은 생체 분자 경로를 조절하는 유전자를 신속하게 식별하고 특정 요구에 순차적인 약물 입력을 사용자 정의 할 수 있습니다. 로봇공학 1 및 마이크로 유체 칩은 장치 제어 프로그램과 결합하여 세포/조직 조작, 액체 처리, 이미징 및 데이터 처리/제어2,3을포함하는 복잡한 실험 절차를 자동화할 수 있도록 합니다. 따라서 원하는 처리량4,5에따라 수백 및 수천 개의 실험 조건을 단일 칩으로 유지할 수 있다.

이 프로토콜에서, 우리는 1500 배양 장치, 향상된 연동 펌프및 현장 믹싱 계수로 구성된 미세 유체 장치의 설계 및 제조 절차를 설명했습니다. 2 단계 세포 배양 챔버는 중간 교환 중에 불필요한 전단을 방지하여 장기적인 살아있는 세포 이미징을위한 방해받지 않는 배양 환경을 보장합니다. 연구 결과는 제안된 미세 유체 장치가 복잡한 생활 기계에 높은 처리량 연구를 위한 적당한 플랫폼이다는 것을 보여줍니다. 더욱이, 미세 유체 칩의 고급 기능은 생체 내 매우 복잡하고 역동적인 미세 환경 조건의 자동 재구성을 허용, 끊임없이 변화하는 사이토카인과 리간드 조성물6,7,96 웰 플레이트와 같은 기존의 플랫폼에 대한 수개월이 걸리는 완료.

프로토콜

1. 미세 유체 칩 설계

  1. 개별 밸브와 연동 펌프에 의해 제어되는 18개의 입구로 구성된 미세 유체 멀티플렉터를 설계합니다. 펌핑 사이클당 구동되는 액체 부피를 증가시키기 위해, 연동 펌프는 의도적으로 200 μm, 10개의 연결된 유동선으로 확대된 3개의 제어 채널로 구성된다.
  2. 전단이 없는 문화실을 디자인합니다. 2단계 배양장치의 복제는 낮은 세포 배양 챔버(400 μm x 400 μm x 150 μm x 150 μm)와 더 높은 완충층(400 μm x 400 μm x 75 μm)으로 구성되어 중간 교환 시 세포에 원치 않는 전단 응을 방지한다(도1).
  3. 높은 처리량 기능을 설계합니다. 배양 장치를 복제하여 30 x 50 매트릭스 레이아웃을 형성하여 약 7cm x 5cm 크기의 영역을 차지합니다.

2. 칩 제작 및 작동

  1. UV 리소그래피를 사용하여 복제 성형 제작
    참고: 표준 광석 촬영 프로토콜8에따라 실리콘 웨이퍼에서 복제 성형이 제작되었습니다.
    1. 채널 구조 제작
      1. 스피닝 포토레지스트: 30s용 10s, 3000rpm의 실리콘 웨이퍼에 SU-8 3025 네거티브 포토레지스트의 스핀 코트 5mL.
      2. 소프트 베이크: 웨이퍼를 65°C에서 2분 동안 핫플레이트에 올려 놓은 다음 95°C를 10분간 식히고 실온으로 식힙니다.
      3. 정렬 및 경화: 웨이퍼와 마스크를 정렬기 홀더에 고정하고 노출된 포토레지스트를 치료하기 위해 18s의 광원을 켭니다.
      4. 사전 노출 굽기: 실온에서 110°C/h에서 웨이퍼를 95°C로 늘리고 제거할 때까지 최소 40분 간 유지합니다.
      5. 개발: 개발 솔루션(SU-8 개발자)에서 웨이퍼를 찍어 2.5분 동안 교반하여 중복 광저항을 씻어내고 25 μm 높이의 채널 구조를 얻습니다.
      6. 하드 베이킹: 웨이퍼를 유리 페트리 접시로 덮고 65°C에서 2분간 굽은 다음 120°C/h에서 최대 160°C까지 올라가 3시간 동안 보관하십시오.
    2. 완충층을 가진 세포 배양챔버의 제조
      1. 상기 웨이퍼에 SU-8 3075 네거티브 포토레지스트의 7mL을 회전시키기 위해 2.1.1.1 단계의 파라미터를 사용한다.
      2. 부드러운 베이킹 (단계 2.1.1.2에 설명) 웨이퍼와 웨이퍼의 마커와 잘 정렬마스크를 변경합니다. 그런 다음 24s의 광원을 켜서 노출된 포토레지스트를 치료합니다.
      3. 웨이퍼를 개발 솔루션(SU-8 개발자)에 찍어 4분 40초 동안 교반하여 중복 광저항을 씻어내고 이전에 제작된 25μm 높이의 채널 구조 주변의 75μm 높이의 층 구조를 얻습니다. 하드 베이크 (단계 2.1.1.6에 설명) 웨이퍼는 복잡한 구조를 강하게합니다.
      4. 2.1.2.1-2.1.2.3을 반복하여 층 구조에 쌓이는 75 μm 높이의 챔버 구조를 제작한다.
    3. 밸브 구조의 제조
      1. 상기 웨이퍼에 AZ 50x 양성 포토레지스트의 5mL를 회전하는 단계 2.1.1.1의 파라미터를 이용하여.
      2. 부드러운 베이킹 (단계 2.1.1.2에 설명) 웨이퍼와 마스크를 웨이퍼의 마커와 잘 정렬 한 다음 광원을 20 s에 넣고 30 s를 즉시 꺼두십시오. 노출 된 포토 레지스트를 치료하기 위해 5 원에서 조명 켜기 / 오프 절차를 반복합니다.
      3. 웨이퍼를 찍어 개발자와 일치시키고 약 8분 동안 교반하여 중복 광저항을 씻어내고 좋은 연결을 보장하기 위해 제어 채널과 겹치는 둥근 모양의 밸브를 얻습니다. 하드 베이크 (단계 2.1.1.6에 설명) 패턴 웨이퍼는 전체 모델을 강하게합니다.
  2. 소프트 리소그래피를 이용한 미세 유체 칩 생산
    1. 패턴 및 빈 실리콘 웨이퍼를 리메틸클로로실레인으로 15분 동안 처리합니다.
    2. 유동층 50g, 제어층 20g, 멤브레인 20g에 해당하는 PDMS 젤(단량/촉매 비 10:1)의 3부분을 각각 준비한다.
    3. 패턴 실리콘 웨이퍼에 PDMS 젤 50g을 캐스팅하고- 0.85 MPa에서 진공 챔버에서 1-2 시간 동안 그들을 제가스하여 유동층을 복사한다.
    4. PDMS 20g의 2부분을 탈착시키고 30s에 대한 패턴 웨이퍼 및 빈 실리콘 웨이퍼에 스핀하여 30s에 대한 제어 층 및 멤브레인 층을 준비한다.
    5. PDMS 로 덮여 웨이퍼를 80 °C에서 60 분 동안 환기 오븐에 넣고 배양하십시오.
    6. 맞춤형 광학 장치(100x 확대 줌) 및 플라즈마 에칭 기계를 통해 서로 다른 레이어를 정렬하고 결합합니다. 그런 다음 칩의 결합을 향상시키기 위해 80 °C에서 2 시간 동안 환기 오븐에 보관하십시오.
    7. 칩의 입구 구멍을 펀치한 다음 PDMS 코팅 커버슬립에 결합한 다음 사용하기 전에 80°C에서 최소 12시간 동안 경화합니다.
  3. 칩 작동
    1. 소형 공압 솔레노이드 밸브를 칩의 제어 레이어에 연결하고 맞춤형 MATLAB 그래픽 사용자 인터페이스8을 열어 스위치를 연결하고 제어합니다.
    2. 푸시업 PDMS 멤브레인 밸브의 닫는 압력을 25 psi로 설정합니다.
    3. 밸브의 적시 온오프로 지정된 챔버(도2d)에동적으로 변화하는 조합/순차 입력을 전달합니다.

3. 셀룰러 마이크로 환경에서 동적 입력의 생성

  1. 칩 처리 및 셀 로딩
    1. 현미경에서 표준 배양 조건(37°C, 5%CO2)을최소 5시간 동안 유지한다.
    2. 칩에 코팅 매체(즉, NOTE에 언급된)로 칩을 채우고 표준 배양 조건(3.1.1 단계에서 설명)에서 적어도 한 시간 동안 배양한다.
    3. 건강한 배양 환경을 구축하기 위해 인산염 완충식염(PBS) 또는 세포 배양 배지(덜벡코의 변형 독수리의 매체, DMEM)에 의해 칩을 플러시한다.
    4. 80% 수렴성으로 세포를 수확하고, ~ 10 6/mL의 밀도로 배양매체(DMEM)를 사용하여 세포를 재보선한다. 그런 다음 셀 함유 용액을 가압하여 셀을 칩에 로드합니다.
      참고: 칩상상상에서 상이한 세포주를 배양하려면 세포 배양 챔버를 처리하기 위해 대응하는 코팅 배지가 필요합니다. 전형적으로, 3T3 섬유아세포 및 암탉의 부착배양에 대한 실험의 경우 배양챔버를 제어하는 모든 판막이 개방되고, 세포는 동일한 컬럼 내의 모든 배양실로 흐른다.
  2. 높은 처리량 라이브 셀 이미징을 위한 설정
    참고: 이미지 수집의 경우 자동화된 번역 단계와 디지털 보완 금속 산화물 반도체(CMOS) 카메라가 있는 반전 된 현미경이 사용되었습니다. 단계 및 이미지 수집은 사용자 정의 소프트웨어를 통해 제어되었습니다.
    1. 밝은 분야에서 10x 객관적렌즈를 사용하여 배양 챔버의 매트릭스를 시각화하여 30 x 50 챔버 매트릭스의 각 챔버의 위치 좌표를 확인하고 정의합니다.
    2. 목표 렌즈를 20배 또는 40x로 변환한 다음 원하는 챔버의 위치 좌표를 선택하고 번역 스테이지는 확인 후 할당된 위치로 이동합니다. 최적의 이미지를 얻기 위해 x, y, z 초점 평면을 미세 조정합니다.
    3. 빛 강도, 노출 시간 및 기타 이미지 매개 변수를 각 채널(즉, 밝은 필드 및 형광 이미징)에 대해 개별적으로 결정하였다.
    4. 이미징 주기의 간격과 지속 시간을 설정하고 경로를 저장한 다음 이미징을 시작합니다.

결과

종래의 온칩 연동 펌프는 2000년 스티븐 퀘이크(Stephen Quake)에 의해 처음 설명되었으며, 이 펌프는 패턴 101, 100, 010, 011, 011, 001 8,10에의해 연동이 작동되었다. 숫자 0과 1은 3개의 수평 제어선의 "열기" 및 "닫기"를 나타냅니다. 3개 이상의 밸브(예: 5개)를 사용한 연구도11개보고되었다. 3개의 제어라인과 3개의 유동선으로 구성된 연동 펌프가...

토론

다양한 미세유체 장치는 멀티플렉스 및 복합 실험을 수행하기 위해 개발되었다17,18,19,20. 예를 들어, 위상 오목의 배열로 만들어진 마이크로웰은 외부의 힘을 사용하지 않고 개별 세포를 트랩할 수 있으며, 작은 샘플 크기, 병렬화, 낮은 재료 비용, 빠른 반응, 고감도21,

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

저자는 찬센 악기 (중국) LTD의 Zhifeng Cheng의 기술 지원을 인정합니다. 이 작품은 보조금에 의해 지원되었다 (중국의 국립 자연 과학 재단,51927804).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
2713 Loker Avenue WestTorrey pines scientific
AZ-50XAZ Electronic Materials, Luxembourg
Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mLSigma
CO2 Incubator HP151Heal Force
Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red)Invitrogen
Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01gShanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD.
FBSSigma
Fibronection 0.25 mg/mLMillipore, Austria
Glutamax 100xGibco
Heating Incubator BGG-9240AShanghai bluepard instruments Co.,Ltd.
Nikon Model Eclipse Ti2-ENikon
Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL StreptomycinInvitrogen
Plasma cleaner PDC-002Harrick Plasma
polydimethylsiloxane(PDMS)Momentive
polylysine 0.01%Sigma
Spin coater ARE-310Awatori Rentaro
Spin coater TDZ5-WSCence
Spin coater WH-SC-01Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
SU-8 3025MicroChem, Westborough, MA, USA
SU-8 3075MicroChem, Westborough, MA, USA

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