Geração de Condições Ambientais Dinâmicas usando um dispositivo microfluido de alto rendimento

Resumo

Apresentamos um sistema microfluido para estudos de alto rendimento em máquinas de vida complexas, que consiste em 1500 unidades culturais, uma matriz de bombas peristálticas aprimoradas e um módulo de mistura no local. O chip microfluido permite a análise das condições microambientais altamente complexas e dinâmicas in vivo.

Resumo

Imitar condições ambientais in vivo é crucial para estudos in vitro sobre máquinas de vida complexas. No entanto, as técnicas atuais voltadas para células e órgãos vivos são altamente caras, como a robótica, ou não têm volume de nanoliter e precisão de tempo de milissegundos na manipulação líquida. Nós apresentamos aqui o design e a fabricação de um sistema microfluido, que consiste em 1.500 unidades culturais, uma matriz de bombas peristálticas aprimoradas e um módulo de mistura no local. Para demonstrar as capacidades do dispositivo microfluido, as esferas de células-tronco neurais (NSC) são mantidas no sistema proposto. Observamos que quando a esfera NSC é exposta à CXCL no primeiro dia e eGF no dia 2, a conformação em forma redonda é bem mantida. A variação na ordem de entrada de 6 medicamentos causa alterações morfológicas na esfera NSC e no marcador representativo do nível de expressão para a hasteza NSC (ou seja, Hes5 e Dcx). Esses resultados indicam que as condições ambientais dinâmicas e complexas têm grandes efeitos na diferenciação e autoconexão do NSC, e o dispositivo microfluido proposto é uma plataforma adequada para estudos de alto rendimento sobre as máquinas de vida complexa.

Introdução

Técnicas de alto rendimento são cruciais para estudos biomédicos e clínicos. Ao conduzir paralelamente milhões de testes químicos, genéticos ou de células vivas e organoides, os pesquisadores podem identificar rapidamente genes que modulam uma via bio molecular e personalizar a entrada de drogas sequenciais às necessidades específicas. Os chips robóticos¹ e microfluidic em combinação com um programa de controle de dispositivos permitem que procedimentos experimentais complexos sejam automatizados, abrangendo manipulação celular/tecido, manuseio líquido, imagem e processamento/controle de dados^2,3. Portanto, centenas e milhares de condições experimentais podem ser mantidas em um único chip, de acordo com o rendimento desejado^4,5.

Neste protocolo, descrevemos o procedimento de design e fabricação de um dispositivo microfluido, que consiste em 1500 unidades culturais, uma matriz de bombas peristálticas aprimoradas e módulos de mistura no local. A câmara de cultura celular de 2 níveis previne uma tesoura desnecessária durante a troca média, o que garante um ambiente cultural não perturbado para imagens de células vivas de longo prazo. Os estudos demonstram que o dispositivo microfluido proposto é uma plataforma adequada para estudos de alto rendimento sobre as complexas máquinas de vida. Além disso, as características avançadas do chip microfluido permitem a reconstituição automatizada de condições microambientais altamente complexas e dinâmicas in vivo, como as composições de citocinas e ligantes em troca^6,7,a conclusão das quais leva meses para plataformas convencionais como placa de 96 poços.

Protocolo

1. Design de chips microfluidos

1. Projete o multiplexer microfluido composto por 18 entradas, cada uma controlada por uma válvula individual e uma bomba peristáltica. Para aumentar o volume líquido impulsionado por um ciclo de bombeamento, faça com que a bomba peristáltica seja composta por 3 canais de controle, que foram propositalmente ampliados para 200 μm, e 10 linhas de fluxo conectadas.
2. Projete a câmara de cultura sem tesouras. A replicação da unidade de cultura de 2 níveis é composta por uma câmara de cultura celular inferior (400 μm x 400 μm x 150 μm) e uma camada tampão mais alta (400 μm x 400 μm x 75 μm), que previne o estresse indesejado das células durante a troca média(Figura 1).
3. Projete recursos de alto rendimento. Duplicar a unidade de cultura para formar um layout de matriz 30 x 50, ocupando uma área de aproximadamente 7 cm por 5 cm de tamanho.

2. Fabricação e operação de chips

1. Fabricação da moldagem de réplica usando litografia UV
   NOTA: A moldagem da réplica foi fabricada em wafer de silício de acordo com o protocolo de fotolitografia padrão⁸.
   1. Fabricação das estruturas do canal
      1. Fotoresist giratório: Spin coat 5 mL do fotoresist negativo SU-8 3025 em um wafer de silício a 500 rpm para 10 s e 3000 rpm para 30 s.
      2. Cozimento macio: Coloque o wafer em uma placa quente a 65 °C por 2 min e depois 95 °C por 10 min, esfrie-o até a temperatura ambiente.
      3. Alinhamento e cura: Fixar o wafer e a máscara no suporte do alinhador e ligar a fonte de luz para 18 s para curar o fotoresist exposto.
      4. Pré-exposição pós-exposição bake: Aumente o wafer para 95°C a 110°C/h a partir da temperatura ambiente e mantenha-o pelo menos 40 min até a remoção.
      5. Desenvolva: Mergulhe o wafer na solução em desenvolvimento (desenvolvedor SU-8) e agitar-o por 2,5 min para lavar fotoresist redundante e obter a estrutura do canal de 25 μm de altura.
      6. Cozimento duro: Cubra o wafer com placa de petri de vidro e asse a 65 °C por 2 minutos, depois aumente até 160°C a 120 °C/h e mantenha-o por 3 horas.
   2. Fabricação da câmara de cultura celular com a camada tampão
      1. Use os parâmetros da etapa 2.1.1.1 para girar o revestimento de 7 mL do fotoresist negativo SU-8 3075 no wafer acima.
      2. Asse macio (descrito na etapa 2.1.1.2) o wafer e mude a máscara para se alinhar bem com marcadores no wafer. Em seguida, ligue a fonte de luz para 24 s para curar o fotoresist exposto.
      3. Mergulhe o wafer na solução em desenvolvimento (desenvolvedor SU-8) e agitar-o por 4 minutos e 40 segundos para lavar o fotoresist redundante e obter uma estrutura de camada de 75 μm de altura que em torno da estrutura de canal de 25 μm de altura fabricada antes. Cozimento duro (descrito na etapa 2.1.1.6) o wafer para tornar a estrutura complexa mais forte.
      4. Repita as etapas 2.1.2.1-2.1.2.3 para fabricar uma estrutura de câmara de 75 μm de altura que empilhe na estrutura da camada.
   3. Fabricação das estruturas das válvulas
      1. Usando o parâmetro da etapa 2.1.1.1 para girar o casaco de 5 mL do fotoresista positivo AZ 50x no wafer acima.
      2. Asse macio (descrito na etapa 2.1.1.2) o wafer e faça a máscara alinhada bem com marcadores no wafer, em seguida, mantenha a fonte de luz acesa por 20 s e desligada imediatamente por 30 s. Repita o procedimento de luz acesa/desligada em 5 círculos para curar o fotoresist exposto.
      3. Mergulhe o wafer para o desenvolvedor compatível e agitar-o por cerca de 8 minutos para lavar fotoresist redundante e obter as válvulas em forma redonda que se sobrepõem com os canais de controle para garantir uma boa conexão. Cozimento duro (descrito na etapa 2.1.1.6) o wafer padronizado para tornar todo o modelo mais forte.
2. Produção de chips microfluidos usando litografia macia
   1. Trate os wafers de silício estampados e em branco com rimetilcloosilano por 15 minutos.
   2. Prepare 3 porções de gel PDMS (10:1 de razão monômero/catalisador) correspondentes a 50 g de camada de fluxo, 20 g de controle camada 2 e 20 g de membrana, respectivamente.
   3. Funde 50 g de gel PDMS no wafer de silício padronizado e desaparaso-os por 1-2 horas na câmara de vácuo a -0,85 MPa para copiar a camada de fluxo.
   4. Degas as 2 porções de 20 g de PDMS e gire-a no wafer padronizado e um wafer de silício em branco a 2000-2800 rpm por 30 s, como preparar uma camada de controle e camada de membrana.
   5. Coloque os wafers cobertos de PDMS no forno de ventilação por 60 min a 80 °C para incubação.
   6. Alinhe e conecte as diferentes camadas através de dispositivo óptico personalizado (zoom em 100x) e máquina de gravura de plasma. Em seguida, mantenha-o em um forno de ventilação por 2 horas a 80 °C para melhorar a ligação do chip.
   7. Faça os furos de entrada no chip e, em seguida, conecte-o a um deslizamento revestido de PDMS e curado por pelo menos 12 horas a 80 °C antes de usar.
3. Operação de chips
   1. Conecte válvulas solenoides pneumáticas em miniatura à camada de controle do chip e abra a interface de usuário gráfica MATLAB^{personalizada 8} para vincular e controlar o interruptor.
   2. Ajuste as pressões de fechamento das válvulas de membrana PDMS push-up para 25 psi.
   3. Ofereça entradas combinatórias/sequenciais de mudança dinâmica para câmaras designadas(Figura 2d) por tempo de desconto das válvulas.

3. Geração de insumos dinâmicos em microambientes celulares

1. Tratamento de chips e carregamento celular
   1. Mantenha as condições de cultura padrão (37 °C, 5% CO₂) no microscópio por pelo menos 5 horas.
   2. Encha o chip com meio de revestimento (ou seja, mencionado na NOTA) e incuba-o nas condições de cultura padrão (descrito na etapa 3.1.1) por pelo menos uma hora.
   3. Lave o chip por soro fisiológico tamponado (PBS) ou meio de cultura celular (o meio de DMEM da Águia Modificada de Dulbecco) para construir um ambiente de cultura saudável.
   4. Colher células com 80% de confluência e resuspensar as células usando mídia cultural (DMEM) a uma densidade de ~ 10⁶/mL. Em seguida, carregue as células no chip pressurizando a solução contendo células.
      NOTA: A colheita de diferentes linhas celulares no chip requer meio de revestimento correspondente para tratar a câmara de cultura celular. Normalmente, para experimentos em fibroblasto 3T3 e cultura aderente de galinha todas as válvulas que controlam as câmaras culturais estão abertas, as células fluem para todas as câmaras de cultura dentro da mesma coluna.
2. Configuração para imagens de células vivas de alto rendimento
   NOTA: Para aquisição de imagem, foi utilizado um microscópio invertido com estágio translacional automatizado e uma câmera digital complementar de semicondutor de óxido de metal (CMOS). O estágio e a aquisição de imagens foram controlados através do software personalizado.
   1. Visualize a matriz das câmaras culturais utilizando lente objetiva de 10x em campo brilhante para afirmar e definir as coordenadas de localização de cada câmara da matriz de 30 por 50 câmaras.
   2. Transforme a lente objetiva para o 20x ou 40x, selecione as coordenadas de localização da câmara desejada e o estágio translacional se move para a posição atribuída após a confirmação. Ajuste bem o plano focal x,y, z para obter uma imagem ideal.
   3. O ideal é que a intensidade da luz, o tempo de exposição e outros parâmetros de imagem foram determinados individualmente para cada canal (ou seja, imagens de campo brilhante e fluorescência).
   4. Defina o intervalo e a duração do ciclo de imagem, salve o caminho e, em seguida, inicie a imagem.

Resultados

A bomba peristáltica convencional foi descrita pela primeira vez por Stephen Quake em 2000, usando a qual a peristalse foi acionada pelo padrão 101, 100, 110, 010, 011, 001 ^8,10. Os números 0 e 1 indicam "abrir" e "fechar" as 3 linhas de controle horizontal. Estudos com mais de 3 válvulas (por exemplo, cinco) também foram relatados¹¹. Embora a bomba peristáltica composta por 3 linhas de controle e 3 linhas de fluxo forneça precisão...

Discussão

Vários dispositivos microfluidos foram desenvolvidos para realizar experimentos multiplexados e complexos^17,18,19,20. Por exemplo, microwells feitas de uma matriz de recessos topológicos podem prender células individuais sem o uso de força externa, mostrando caracteres vantajosos, incluindo pequeno tamanho amostral, paraleloização, menor custo de material, resposta mais rápida, alta sens...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2713 Loker Avenue West	Torrey pines scientific
AZ-50X	AZ Electronic Materials, Luxembourg
Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL	Sigma
CO2 Incubator HP151	Heal Force
Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14	Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red)	Invitrogen
Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g	Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD.
FBS	Sigma
Fibronection 0.25 mg/mL	Millipore, Austria
Glutamax 100x	Gibco
Heating Incubator BGG-9240A	Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd.
Nikon Model Eclipse Ti2-E	Nikon
Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin	Invitrogen
Plasma cleaner PDC-002	Harrick Plasma
polydimethylsiloxane(PDMS)	Momentive
polylysine 0.01%	Sigma
Spin coater ARE-310	Awatori Rentaro
Spin coater TDZ5-WS	Cence
Spin coater WH-SC-01	Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
SU-8 3025	MicroChem, Westborough, MA, USA
SU-8 3075	MicroChem, Westborough, MA, USA