Generación de condiciones ambientales dinámicas utilizando un dispositivo microfluídico de alto rendimiento

Resumen

Presentamos un sistema microfluídico para estudios de alto rendimiento en maquinaria de vida compleja, que consta de 1500 unidades de cultivo, una gama de bombas peristálticas mejoradas y un módulo de mezcla in situ. El chip microfluídico permite el análisis de las condiciones microambientales altamente complejas y dinámicas in vivo.

Resumen

Imitar condiciones ambientales in vivo es crucial para estudios in vitro sobre maquinaria de vida compleja. Sin embargo, las técnicas actuales dirigidas a células y órganos vivos son altamente costosas, como la robótica, o carecen de volumen de nanolitro y precisión de tiempo de milisegundos en la manipulación de líquidos. Aquí presentamos el diseño y la fabricación de un sistema microfluídico, que consta de 1.500 unidades de cultivo, una gama de bombas peristálticas mejoradas y un módulo de mezcla in situ. Para demostrar las capacidades del dispositivo microfluídico, las esferas de células madre neuronales (NSC) se mantienen en el sistema propuesto. Observamos que cuando la esfera NSC está expuesta a CXCL en el día 1 y EGF en el día 2, la conformación en forma redonda está bien mantenida. La variación en el orden de entrada de 6 fármacos causa cambios morfológicos en la esfera NSC y el marcador representativo del nivel de expresión para la tallo de NSC (es decir, Hes5 y Dcx). Estos resultados indican que las condiciones ambientales dinámicas y complejas tienen grandes efectos en la diferenciación y la autorre renovación del NSC, y el dispositivo microfluídico propuesto es una plataforma adecuada para estudios de alto rendimiento en la compleja maquinaria de vida.

Introducción

Las técnicas de alto rendimiento son cruciales para los estudios biomédicos y clínicos. Al realizar paralelamente millones de pruebas químicas, genéticas o de células vivas y organoides, los investigadores pueden identificar rápidamente genes que modulan una vía bio-molecular y personalizar la entrada secuencial de fármacos a sus necesidades específicas. La robótica¹ y los chips microfluídicos en combinación con un programa de control de dispositivos permiten automatizar procedimientos experimentales complejos, cubriendo la manipulación celular/tisular, manipulación de líquidos, imágenes y procesamiento/control de datos^2,3. Por lo tanto, cientos y miles de condiciones experimentales se pueden mantener en un solo chip, de acuerdo con el rendimiento deseado^4,5.

En este protocolo, describimos el procedimiento de diseño y fabricación de un dispositivo microfluídico, que consta de 1500 unidades de cultivo, una gama de bombas peristálticas mejoradas y módulo de mezcla in situ. La cámara de cultivo celular de 2 niveles previene la cizalla innecesaria durante el intercambio medio, lo que garantiza un entorno cultural inalterado para las imágenes de células vivas a largo plazo. Los estudios demuestran que el dispositivo microfluídico propuesto es una plataforma adecuada para estudios de alto rendimiento sobre la compleja maquinaria de vida. Además, las características avanzadas del chip microfluídico permiten la reconstitución automatizada de condiciones microambientales altamente complejas y dinámicas in vivo, como las composiciones de citoquinas y ligandos siempre intercambiadas^6,7,la finalización de las cuales toma meses para plataformas convencionales como la placa de 96 pozos.

Protocolo

1. Diseño de chips microfluídicos

1. Diseñe el multiplexador microfluídico que consta de 18 entradas, cada una de las cuales está controlada por una válvula individual y una bomba peristáltica. Para aumentar el volumen líquido impulsado por el ciclo de bombeo, haga que la bomba peristáltica se componga de 3 canales de control, que se amplió a propósito a 200 μm, y 10 líneas de flujo conectadas.
2. Diseña la cámara de cultura libre de cizalla. La replicación de la unidad de cultivo de 2 niveles está compuesta por una cámara de cultivo celular inferior (400 μm x 400 μm x 150 μm) y una capa de búfer más alta (400 μm x 400 μm x 75 μm), lo que evita la tensión de cizallamiento no deseada en las células durante el intercambio medio(Figura 1).
3. Diseñe funciones de alto rendimiento. Duplique la unidad de cultivo para formar un diseño de matriz de 30 x 50, ocupando un área de aproximadamente 7 cm por 5 cm de tamaño.

2. Fabricación y operación de chips

1. Fabricación de la moldura de réplica mediante litografía UV
   NOTA: La moldura de réplica fue fabricada en oblea de silicio de acuerdo con el protocolo de fotolitografía estándar⁸.
   1. Fabricación de las estructuras del canal
      1. Fotorresista giratorio: Capa giratoria 5 ml del fotorresista negativo SU-8 3025 en una oblea de silicio a 500 rpm para 10 s y 3000 rpm durante 30 s.
      2. Horneado suave: Coloque la oblea sobre una placa caliente a 65 °C durante 2 minutos y luego 95 °C durante 10 minutos, enfríe a temperatura ambiente.
      3. Alineación y curado: Fije la oblea y la máscara en el soporte del alineador y encienda la fuente de luz durante 18 s para curar al fotoresista expuesto.
      4. Hornea antes de la exposición: Aumenta la oblea a 95°C a 110°C/h a temperatura ambiente y mantenla al menos 40 minutos hasta que se retire.
      5. Desarrollar: Sumerja la oblea en la solución en desarrollo (desarrollador su-8) y agitarla durante 2,5 minutos para lavar el fotoresista redundante y obtener la estructura de canal de 25 μm de altura.
      6. Hornear duro: Cubra la oblea con una placa de Cristal Petri y hornee a 65 °C durante 2 minutos, luego aumente hasta 160 °C a 120 °C/h y guárdela durante 3 horas.
   2. Fabricación de la cámara de cultivo celular con la capa de búfer
      1. Utilice los parámetros del paso 2.1.1.1 para girar la capa 7 mL del fotoresista negativo SU-8 3075 en la oblea anterior.
      2. Hornee suavemente (descrito en el paso 2.1.1.2) la oblea y cambie la máscara para alinearse bien con los marcadores en la oblea. A continuación, encienda la fuente de luz durante 24 s para curar al fotoresista expuesto.
      3. Sumerja la oblea en la solución en desarrollo (desarrollador su-8) y agitarla durante 4 minutos y 40 segundos para lavar el fotoresista redundante y obtener una estructura de capa de 75 μm de alto que alrededor de la estructura de canal de 25 μm de alto fabricada antes. Hornear duro (descrito en el paso 2.1.1.6) la oblea para hacer la estructura compleja más fuerte.
      4. Repita los pasos 2.1.2.1-2.1.2.3 para fabricar una estructura de cámara de 75 μm de altura que se apilan en la estructura de capa.
   3. Fabricación de las estructuras de la válvula
      1. Utilizando el parámetro del paso 2.1.1.1 para girar la capa 5 mL del fotoresista positivo AZ 50x en la oblea anterior.
      2. Hornee suavemente (descrito en el paso 2.1.1.2) la oblea y haga que la máscara se alinee bien con marcadores en la oblea, luego mantenga la fuente de luz encendida durante 20 s y apagada inmediatamente durante 30 s. Repita el procedimiento de encendido/apagado de la luz en 5 círculos para curar al fotoresista expuesto.
      3. Sumerja la oblea para emparejar al desarrollador y agitarla durante unos 8 minutos para lavar el fotoresista redundante y obtener las válvulas de forma redonda que se superponen con los canales de control para garantizar una buena conexión. Hornear duro (descrito en el paso 2.1.1.6) la oblea estampada para hacer todo el modelo más fuerte.
2. Producción de chips microfluídicos mediante litografía suave
   1. Trate las obleas de silicio estampadas y en blanco con rimethylchlorosilane durante 15 min.
   2. Preparar 3 porciones de gel PDMS (10:1 de relación monómero/catalizador) correspondientes a 50 g de capa de flujo, 20 g de capa de control 2 y 20 g de membrana, respectivamente.
   3. Lance 50 g de gel PDMS en la oblea de silicio estampada y desgastese durante 1-2 horas en la cámara de vacío a -0,85 MPa para copiar la capa de flujo.
   4. Desgastela las 2 porciones de 20 g de PDMS y espírala en la oblea estampada y una oblea de silicio en blanco a 2000-2800 rpm durante 30 s como para preparar una capa de control y una capa de membrana.
   5. Coloque las obleas cubiertas por PDMS en el horno de ventilación durante 60 minutos a 80 °C para la incubación.
   6. Alinee y una las diferentes capas a través de un dispositivo óptico personalizado (zoom en 100x) y una máquina de grabado de plasma. A continuación, manténgalo en un horno de ventilación durante 2 horas a 80 °C para mejorar la unión del chip.
   7. Perforar los orificios de entrada en el chip, y luego unirlo en un clip recubierto de PDMS y curado durante al menos 12 horas a 80 °C antes de su uso.
3. Operación de chip
   1. Conecte las válvulas solenoides neumáticas en miniatura a la capa de control del chip y abra la interfaz gráfica de usuario MATLAB^{personalizada 8} para vincular y controlar el interruptor.
   2. Ajuste las presiones de cierre de las válvulas de membrana PDMS push-up a 25 psi.
   3. Entregue entradas combinatorias/secuenciales que cambian dinámicamente a las cámaras designadas(Figura 2d)mediante el encendido y apagado oportuno de las válvulas.

3. Generación de insumos dinámicos en microambientes celulares

1. Tratamiento de chips y carga celular
   1. Mantenga las condiciones de cultivo estándar (37 °C, 5% CO₂₎en el microscopio durante al menos 5 horas.
   2. Llene el chip con el medio de recubrimiento (es decir, mencionado en el NOTE) e incubarlo en las condiciones de cultivo estándar (descritas en el paso 3.1.1) durante al menos una hora.
   3. Enjuague el chip por solución salina amortiguada por fosfato (PBS) o medio de cultivo celular (el medio de Dulbecco Modified Eagle, DMEM) para construir un entorno de cultivo saludable.
   4. Cosecha células al 80% de confluencia, y resuspend las células usando medios de cultivo (DMEM) a una densidad de ~ 10⁶/mL. A continuación, cargue las celdas en el chip presurizando la solución que contiene células.
      NOTA: La cultivo de diferentes líneas celulares en el chip requiere el medio de recubrimiento correspondiente para tratar la cámara de cultivo celular. Por lo general, para los experimentos en fibroblasto 3T3 y cultivo adherente de gallina todas las válvulas que controlan las cámaras de cultivo están abiertas, las células fluyen a todas las cámaras de cultivo dentro de la misma columna.
2. Configuración para imágenes de células vivas de alto rendimiento
   NOTA: Para la adquisición de imágenes, se utilizó un microscopio invertido con una etapa traslacional automatizada y una cámara digital complementaria de semiconductores de óxido metálico (CMOS). La adquisición de etapas e imágenes se controló a través del software personalizado.
   1. Visualice la matriz de cámaras de cultivo utilizando lente objetiva de 10x en campo brillante para afirmar y definir las coordenadas de ubicación de cada cámara de la matriz de cámara de 30 por 50.
   2. Transforme la lente objetivo a la 20x o 40x y, a continuación, seleccione las coordenadas de ubicación de la cámara deseada y la etapa traslacional se mueve a la posición asignada después de la confirmación. Ajuste el plano focal x, y, z para obtener una imagen óptima.
   3. La intensidad óptima de la luz, el tiempo de exposición y otros parámetros de imagen se determinaron individualmente para cada canal (es decir, imágenes de campo brillante y fluorescencia).
   4. Establezca el intervalo y la duración del ciclo de imágenes, guarde la ruta y, a continuación, comience a crear imágenes.

Resultados

La bomba peristáltica convencional en chip fue descrita por primera vez por Stephen Quake en 2000, utilizando la cual la peristalsis fue accionada por el patrón 101, 100, 110, 010, 011, 001 ^8,10. Los números 0 y 1 indican "abierto" y "cierre" de las 3 líneas de control horizontales. También se han notificado estudios con más de 3 válvulas (por ejemplo, cinco)^11. A pesar de que la bomba peristáltica compuesta por 3 líneas de contro...

Discusión

Se han desarrollado varios dispositivos microfluídicos para realizar experimentos multiplexados y complejos^17,18,19,20. Por ejemplo, los micropos hechos de una matriz de recovecos topológicos pueden atrapar células individuales sin el uso de fuerza externa, mostrando caracteres ventajosos incluyendo pequeño tamaño de muestra, paralelización, menor costo de material, respuesta más rápida...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2713 Loker Avenue West	Torrey pines scientific
AZ-50X	AZ Electronic Materials, Luxembourg
Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL	Sigma
CO2 Incubator HP151	Heal Force
Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14	Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red)	Invitrogen
Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g	Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD.
FBS	Sigma
Fibronection 0.25 mg/mL	Millipore, Austria
Glutamax 100x	Gibco
Heating Incubator BGG-9240A	Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd.
Nikon Model Eclipse Ti2-E	Nikon
Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin	Invitrogen
Plasma cleaner PDC-002	Harrick Plasma
polydimethylsiloxane(PDMS)	Momentive
polylysine 0.01%	Sigma
Spin coater ARE-310	Awatori Rentaro
Spin coater TDZ5-WS	Cence
Spin coater WH-SC-01	Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
SU-8 3025	MicroChem, Westborough, MA, USA
SU-8 3075	MicroChem, Westborough, MA, USA